一种麦卢卡蜂蜜的鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及蜂蜜鉴定领域，特别是涉及麦卢卡蜂蜜的鉴定方法。
【背景技术】
[0002]麦卢卡(Manuka)蜂蜜是新西兰特有的一种珍贵蜜种，是蜜蜂采集新西兰特有的一种灌木植物-麦卢卡(Leptospermum scoparium)的花蜜酿造而成的。由于麦卢卡蜂蜜具有独特的抗菌活性，营养保健功能强大，已经越来越受到我国消费者的青睐。
[0003]蜂蜜一般都具有抗菌活性，这是由蜂蜜本身的高渗透性、较强的酸度并且一般含有过氧化物造成的。而麦卢卡蜂蜜的抗菌活性则不依赖于过氧化物，因此被称为非过氧化抗菌活性(non-peroxide antibacterial activity, NPA)。
[0004]由于麦卢卡蜂蜜抗菌活性的特殊性，不同等级的麦卢卡蜂蜜价格差异非常大。因为，蜂蜜一般都具有抗菌活性，而具有NPA的麦卢卡蜂蜜却是少之又少。因此，一些蜂蜜生产商往往故意混淆麦卢卡蜂蜜的总抗菌活性和NPA。例如，在产品标签上标注Active或类似字眼误导消费者。目前，我国对于麦卢卡蜂蜜的NPA还没有相关检测标准，急需进行相关研究工作对进口麦卢卡蜂蜜进行监管。
[0005]2013年8月，英国食品标准局发布消费警示，要求各地监管部门重点检查新西兰麦卢卡蜂蜜，因为经过检测发现一些麦卢卡蜂蜜中根本不含活性抗菌物质。另外，据新西兰媒体报道，麦卢卡蜂蜜年产量大约有1700~2000吨，但全球年销售量逾10000吨。因此，麦卢卡蜂蜜掺假问题变得亟待解决。
【发明内容】
[0006]为了更好的鉴别麦卢卡蜂蜜的真假，我们公开了一种麦卢卡蜂蜜的鉴定方法，包括以下步骤:
(1)将蜂蜜样品分别与过氧化氢酶溶液和去离子水混合，形成过氧化氢酶-蜂蜜待测样品和去离子水-蜂蜜待测样品；
(2)将金色葡萄球菌作为测试菌种，制备、培养含有菌悬液的营养琼脂，并在形成的培养基上敲出任意分布的加样孔；
(3)分别向加样孔中加入过氧化氢酶-蜂蜜待测样品和去离子水-蜂蜜待测样品；
(4)37°C培养18小时以上，观察抑菌圈的变化，两种待测样品均呈现抑菌圈的为麦卢卡蜂蜜。
[0007]其中以金黄色葡萄球菌作为测试菌种，制备、培养含有菌悬液的营养琼脂的方法具体为:接种金黄色葡萄球菌ATCC 9144 (Oxoid, Hampshire)于胰蛋白胨大豆肉汤(TSB),37°C下培养18h，调整540 nm的吸光值为0.5，获得菌悬液；新鲜制备150 mL营养琼脂(Becton), 121°C高压灭菌15 min,放入50°C水浴,30 min后100 uL菌悬液加入琼脂中，充分混匀后，倒入245 X 245 mm的分析培养皿(Cornig)，待凝固后倒置放入4°C冰箱，待18-24h后取出，得到符合要求的培养基。
[0008]上述步骤中，所述的敲出任意分布的加样孔的方法具体为:以近似拉丁方(quas1-Latin square)为模板,跨越25 mm的格子,用灭菌的8 mm的木塞钻孔器切进培养基，敲出任意分布的孔，即为加样孔。
[0009]为了更好的提供麦卢卡蜂蜜的抑菌活性数据，我们还进一步提供了一种可以定量检测其NPA值的方法，还包括以下步骤:
Ca)分别配制2%、3%、4%、5%、6%、7%的苯酚标准溶液；
(b)将不同浓度的苯酚标准溶液加入加样孔内；
(c)37°C培养18小时后，以近似拉丁方为模板，用游标卡尺测量抑菌圈直径，建立抑菌圈直径与苯酚溶度相关方程；
Cd)将过氧化氢酶-蜂蜜样品加入测试培养基加样孔内；
(e) 37°C培养18小时后，以近似拉丁方为模板，用游标卡尺测量抑菌圈直径，并通过抑菌圈直径与苯酚溶度相关方程，得到相应的NPA值。
[0010]作为一种优选，所述(4)、(C)、Ce)步骤中保持培养基水平无倾斜。
[0011]设置水平时，可以借助水平仪设置放置培养皿的水平位点。
[0012]作为另一优选，所述过氧化氢酶与蜂蜜通过杂交炉混合。
[0013]进一步地，优选过氧化氢酶和蜂蜜在37°C的条件下，杂交炉混合30分钟。
[0014]当然，也可以采用震荡、搅拌等方式进行混合，但是本发明优选杂交炉混合，且优选37°C的杂交炉内混合30分钟可以获得最佳效果。
[0015]优选地，在发明中所用的金黄色葡萄球菌为25代以内的菌株。菌种活性在25代内基本保持稳定，考虑到成本，可以无需每次使用初代菌株进行检测。
[0016]采用本发明所公开的鉴定方法，可以准确鉴别麦卢卡蜂蜜，同时可以定量检测出NPA ^ 5的麦卢卡蜂蜜的NPA值。在蜂蜜鉴别，特别是麦卢卡蜂蜜的鉴定及品质检测中具有重要的意义。
[0017]
【附图说明】
[0018]图1为去离子水-蜂蜜待测样品实验结果示意图。
[0019]图2为过氧化氢酶-蜂蜜待测样品实验结果示意图。
[0020]图3为NPA标准曲线。
[0021]图4为非水平放置情况下置于4个加样孔内的蜂蜜样品的NPA值。
[0022]图5为水平放置情况下置于4个加样孔内的蜂蜜样品的NPA值。
[0023]
【具体实施方式】
[0024]下面结合【具体实施方式】以及附图，对本发明进行进一步阐述和说明。
[0025]在本发明中除非特别声明，所用试剂、仪器均为市售产品。
[0026]实施例1 测试用培养基的制备
菌悬液:任意选用25代以内的金色葡萄球菌ATCC 9144 (Oxoid, Hampshire)作为测试菌种，接种于10 mL胰蛋白胨大豆肉汤中，37°C培养18h，调整吸光度，获得吸光值为0.5的菌悬液。
[0027]培养基:新鲜制备150 mL营养琼脂(Becton)，121°C高压灭菌15 min，放入50°C水浴30 min，然后加入100 μ L菌悬液，充分混匀后，倒入245 χ 245 mm的分析培养皿(Cornig),待培养基凝固后放入4°C冰箱，18_24h后取出，以近似拉丁方(quas1-Latinsquare)为模板,跨越25 mm的格子,用灭菌的8 mm的木塞钻孔器切进培养基,敲出64个任意分布的孔，即为加样孔。
[0028]蜂蜜样品溶液的制备
向5g麦卢卡蜂蜜中添加5 mL无菌的去离子水，并将蜂蜜与去离子水的混合溶液放入37°C杂交炉中混匀30 min。
[0029]分别吸取I mL蜂蜜混合溶液与I mL过氧化氢酶溶液(2 mg/mL, Sigma)和ImL去离子水混合，得到过氧化氢酶-蜂蜜待测样品和去离子水-蜂蜜待测样品。
[0030]分别向加样孔中加入过氧化氢酶-蜂蜜待测样品和去离子水-蜂蜜待测样品。
[0031]将培养皿放入37°C的培养箱中，保持培养皿水平放置培养18h。
[0032]取出培养皿，观察两种样品的抑菌圈，去离子水-蜂蜜待测样品实验结果如图1所示，过氧化氢酶-蜂蜜待测样品实验结果如图2所示。
[0033]样品11，在图1中具有明显