一种脓毒症诊断方法及试剂的制作方法
【专利说明】
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技术领域
[0002] 本发明属于感染炎症类疾病的危重程度判定和预后评估技术领域，即脓毒症 (Sepsis)的多器官功能障碍的判定和预后评估。具体而言本发明提供了一种从线粒体亚细 胞水平对脓毒症的诊断、危重程度监测和预后评估的检测方法，该检测方法主要是测定线 粒体呼吸链超复合物NADH-细胞色素C氧化还原酶（NADH: cytosome C oxidoreductase， NCR )的酶活性，同时本发明还提供了作为线粒体NCR的酶活性分析和检测的方法和试剂。
[0003]
【背景技术】
[0004] 脓毒症（Sepsis)是指由感染引起的全身炎症反应综合征（Systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，是由于微生物（如细菌、真菌、病毒、寄生虫等） 侵入人体而诱发的激烈全身炎症反应，并对组织具有损伤性的病理生理过程的一组临床表 现，常常继发于严重疾病，如严重烧伤、多发伤、外科手术后等。严重脓毒症可以导致脓毒性 休克、多器官功能障碍（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，是重症监护病房 内非心脏病死亡的主要原因。近年来，尽管抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的 进步，脓毒症的病死率仍高达30%~70%，全球每天约14, 000人死于其并发症，对人类健康 和经济发展构成极大的威胁和挑战。
[0005] 临床实践表明，脓毒症的许多特异性治疗手段如抗炎治疗、促炎治疗、皮质激素 的使用等都是非常危险的"双刃剑"，这些治疗的选择必须在对病人进行正确分级、分期的 基础上进行。仅仅根据临床表现和非特异性的实验室数据，盲目使用很可能导致病情恶化 和脏器功能衰竭，以及对医疗资源的浪费。随着现代生物技术的发展，人们发现很多生物标 志物可用于脓毒症的早期诊断、病情及预后判断、疗效评估，并以此判断疾病的病理生理状 态，从而指导治疗。有效的生物学标志物检测成为了脓毒症诊断治疗的重要手段，其中比较 有价值的生物标志物有C反应蛋白、降钙素原、sTREM-1、NT-proBNP以及部分细胞因子和 白细胞分化抗原等。
[0006] C反应蛋白（C-reactive protein，CRP)系急性时相蛋白，不仅能够与细菌、真菌 等微生物的多聚糖结合，而且可激活补体系统，促进噬菌作用。CRP由肝实质细胞产生，正 常人群水平在10 mg /L以下，感染发生后4~6 h即开始升高，36~50 h达高峰，峰值 可达正常参考值的数百倍，感染消除后其水平急骤下降，1周内可恢复至正常，而在病毒感 染时无显著升高，这为早期感染类型的鉴别提供了极其重要的依据。因此，作为相关的非特 异性炎性标志物被广泛应用。但CRP对脓毒症的诊断价值差异较大，其作为成人脓毒症生 物标志物具有较低的特异性，通常用于新生儿早期脓毒症的筛查。此外，其他炎症性疾病（ 如烧伤、创伤、大手术、恶性肿瘤等）也可导致CRP明显升高。
[0007] 降钙素原（Procalcitonin，PCT)是降钙素激素的前体，被视为细菌感染的可靠 生物标志物之一。研宄显示，正常人血清PCT浓度低于0. lug/L，非特异性感染、病毒性炎症 及局部感染等疾病时不增加或轻微增加，感染后2 h即可在血浆中迅速检测到，严重感染时 可升高2000倍以上，PCT半衰期为22~26h，与CRP等急性时相蛋白相比更具优势。研宄证 明PCT的最佳阈值为0. 47 μ g/L时，其对脓毒症的诊断灵敏度和特异度分别为83%和81%。 但也有研宄者质疑PCT对脓毒症的诊断和预后的准确性，认为PCT并不与感染严重程度 相一致。一项就PCT对脓毒症诊断价值荟萃分析发现，其平均灵敏度和特异度只有71%，受 试者工作特征曲线下面积也只有0.78。虽然如此，目前，PCT水平已被用于指导急性慢性支 气管炎加重，社区获得性肺炎（CAP)及脓毒症的实验性抗菌治疗。并且，PCT水平还可以和 常规的临床参数一起辅助判断患者的实验性抗菌治疗是否有效。通过连续监测PCT水平来 判断是否可以结束抗菌素治疗是其最有价值的应用。
[0008] 髓系细胞表达触发受体-I(TREM-I)属于免疫球蛋白超家族，选择性地表达于中性 粒细胞和部分单核细胞，在多种炎症反应中表达上调。机体在细菌或真菌感染时中性粒细 胞和单核-巨噬细胞表面表达TREM-I显著增加，脱落入血即sTREM-1 (可溶性髓系细胞表 达触发受体1)。研宄证明，在区分脓毒症和非感染性炎症时，sTREM-1是一个非常有意义的 早期参数。虽然如此，一项对11个研宄(包括1795例患者）的荟萃分析发现，sTREM-1对脓 毒症的诊断的整体灵敏度和特异性分别为79% (95%置信区间，65~89)和80% (95%置信区 间，69~88)，ROC曲线下面积为0. 87 (95%置信区间，0. 84~0. 89)。最终得出，血浆sTREM-1 在区分脓毒症及SIRS中表现中等，不足以用于系统性炎症患者的脓毒症诊断。
[0009] 尿钠肽（BNP)为活化的神经内分泌激素，由心室肌细胞产生，心肌壁及心室壁压 力的增加为主要刺激源，促进BNP的释放。BNP的生理学效应包括利尿、拮抗肾素-血管紧 张素-醛固酮系统及刺激鸟苷酸环化酶引起血管扩张。NT-proBNP为BNP前体氨基末端， 心室容积扩大及心力衰竭时，血浆BNP和NT-proBNP水平升高，是一种有效的心室前负荷和 心功能预测标志物。脓毒症早期常出现血流动力学改变和心脏功能障碍。据报道，脓毒症、 脓毒性休克及急性心衰与BNP和NT-proBNP水平升高有关。且因NT-proBNP在血液循环中 比尿钠肽有更长的半衰期，这使得它具有更好的敏感性和特异性。统计分析57例脓毒症患 者的数据后发现，血浆B型尿钠肽前体N末端水平在严重脓毒症时可作为一个早期心功 能障碍和心肌抑制有用的生物指标，如果阈值定在3360 ng /L，其灵敏度为75%，特异性为 90. 2%〇
[0010] 细胞因子中有代表性的包括白细胞介素家族（IL-1、2、4、6、8、10及12)、肿瘤坏死 因子（TNF)、干扰素、巨噬细胞炎症蛋白（MIP)、干扰素诱导蛋白10 (IP-10)、高迀移率族蛋 白BI (HMGBl)等。这些因子在脓毒症早期有一定的诊断价值，其中研宄较多的IL-6-般 认为对脓毒症有重要的预测价值，且IL-6有缓慢而稳定的动力学特征，容易在血液中被检 测，成为脓毒症的重要细胞因子生物标志物。研宄表明，脓毒症患者血IL-6水平明显增高， 且脓毒症的严重程度及预后与其增高幅度相关，IL-6水平持续增高者多器官功能障碍综合 征的发生率和病死率明显增加，如以25 ng /L为阈值时，对脓毒症有较高的诊断价值，其灵 敏度为81. 1%，特异度为78. 9%。但也有研宄显示，IL-6水平在全身炎性反应综合征和脓毒 症之间的差别不大，诊断脓毒症的灵敏度（67%)和特异度（65%)不高。
[0011] 白细胞分化抗原是白细胞表面标志物，其异常表达通常意味着白细胞数目和功能 的变化，故可能作为脓毒症的标志物，迄今报道的表面抗原包括⑶10、11、14、18、25、28、40、 48、64、69、80及163等。其中⑶64研宄较多，它选择性表达于单核/巨噬细胞，正常人成熟 中性粒细胞不表达。研宄发现脓毒症患者中性粒细胞表面⑶64表达增加，可刺激并诱导炎 症介质γ -干扰素和粒细胞集落刺激因子（G-CSF)的释放。中性粒细胞表面CD64可以作 为区分感染、脓毒症和严重组织损伤的诊断性生物标志物，在脓毒症的早期诊断中其敏感 性和特异性分别为65. 8%和64. 6%。另外，在炎症期，血浆蛋白酶水解CD14产生可溶性片段 (s⑶14)，其中称为s⑶14亚类（s⑶14-ST)或pres印sin的组分，在健康人体血清中浓度很 低，但在细菌感染后升高，近期的两个研宄发现presepsin是早期诊断脓毒症及评估脓毒 症患者预后的有效生物标志物(灵敏度为71~72%，特异性为70~86%)。
[0012] 其它生物标志物还有热休克蛋白70(Hsp70)、内皮素-1前体（proET-Ι)、血管生成 素-I (Ang-I )、巨噬细胞移动抑制因子（MIF)、可溶性尿激酶型纤溶酶原激活受体（suPAR) 凝血因子、细胞凋亡产物、激素水平、调节性T细胞（Treg)、病原微生物本身及其产物（内毒 素、核酸）等，但这些标志物对脓毒症的预测灵敏度和特异性相对较差，临床认可度和使用 率较低。
[0013] 由于脓毒症是一组综合征，机体的病理生理反应过程具有不同的阶段性特点，发 病表现多样、发病机制复杂，目前还没有一个标志物的变化能完全反应其整个过程，没有一 个标志物的能独立的用于脓毒症的各期预测、诊断、治疗监测及预后判断。寻找高灵敏度及 特异性的脓毒症生物标志物、分析各种标志物及其