专利名称：使用生物标记谱诊断脓毒或者sirs的制作方法
技术领域：
本发明涉及诊断或者预测个体中脓毒或者其发展阶段的方法。本发明还涉及诊断个体中系统性炎性应答综合症的方法。
背景技术：
疾病状态的早期检出通常容许更有效的治疗性治疗和相应的更有利的临床结果。然而，在许多情况中，疾病症状的早期检出存在问题；所以，在可能诊断之前疾病可能变成相对的晚期。系统性炎性病症代表一类这种疾病。这些病症，尤其是脓毒，通常由病原微生物和宿主的防御系统的相互作用引起，该相互作用在宿主中引发过度且调节异常的炎性反应。系统性炎性反应期间宿主应答的复杂性使得针对理解疾病病理的努力错综复杂(Healy，Annul.Pharmacother.36648-54(2002)中的综述)。疾病病理的不完全理解又使发现诊断性生物标记变得困难。然而，由于脓毒非常快地发展成威胁生命的病症，所以迫切需要早期并且可靠的诊断。
脓毒遵循一种明确的时间历程，从系统性炎性应答综合症(“SIRS”)阴性到SIRS阳性到脓毒，然后脓毒发展成严重脓毒、脓毒性休克、多种器官功能异常(“MOD”)，最终死亡。当受感染的个体随后发生SIRS时，该个体中也可以出现脓毒。“SIRS”通常被定义为存在下面参数的两种或多种体温大于38℃或者小于36℃；心率大于每分钟90次；呼吸率大于每分钟20次呼吸；PCO2小于32mm Hg；和白细胞数小于4.0×109个细胞/L或者大于12.0×109个细胞/L，或者具有大于10％不成熟带形。“脓毒”通常被定义为具有确定的感染过程的SIRS。“严重脓毒”与MOD、低血压、弥漫性血管内凝血(“DIC”)或者灌注不足异常，其包括乳酸中毒症、少尿、和精神状态的改变。“脓毒性休克”通常被定义为脓毒诱导的低血压，其抗液体复苏并且还存在灌注不足异常。
记载临床上对脓毒重要的病原微生物的存在已经被证明是困难的。通常通过培养患者的血液、痰、尿、伤口分泌物、内在的线导管表面，等等来检测致病微生物。然而，致病微生物可能仅存在于某些身体的微环境中，从而所培养的具体材料可能不含有污染性微生物。可以由于感染部位存在的微生物数目少而使得检测更加复杂。血样中病原数目少给通过培养血液诊断脓毒带来了特别的问题。在一个研究中，例如，仅在17％的具有脓毒临床表现的患者中得到阳性培养结果(Rangel-Frausto等人，JAMA 273117-23(1995).)。非病原微生物污染样品可以使诊断进一步复杂化。例如，仅12.4％的被检测的微生物在707名败血病患者的研究中是临床上重要的。(Weinstein等人，Clinical Infectious Diseases 24584-602(1997).)脓毒的早期诊断的困难可以由与该疾病相关的高发病和高死亡率反映。当前脓毒是美国第十位主要的死亡原因并且在非冠状重病监护室(ICUs)的住院患者中特别普遍，重病监护室中脓毒是最常见的死亡原因。总死亡率高达35％，估计仅在美国每年就发生750,000例。仅美国治疗脓毒的年花费就为数十美元。
因此，需要足够早地诊断并且允许有效干预和防止脓毒的方法。大多数现有的脓毒打分系统或者预测模型仅预测已经被认为是脓毒的患者中晚期并发症(包括死亡)的危险。然而，这些系统和模型不预测脓毒自身的发展。尤其需要将那些患者分成将患脓毒或者不患脓毒的SIRS患者的方法。当前，研究人员通常定义单一的生物标记，该生物标记在脓毒患者组和患者的正常(即，非脓毒)对照组中的表达水平不同。2003年3月26日提交的美国专利申请序号10/400,275(其完整内容被并入作为参考)公开了通过分析各种生物标记的表达水平中的依赖时间的变化揭示早期脓毒的方法。因此，诊断早期脓毒的最佳方法当前需要检测多种生物标记和监视一段时间内这些生物标记的表达。
本领域中持续迫切需要特异且灵敏地诊断脓毒，而不需要随时间监视患者。理想地，通过一种技术进行诊断，该技术准确、快速并且在一个时间点同时检测多种生物标记，从而使在诊断所需的时间内疾病的发展最小化。
发明概述本发明通过在一个时间点内检测来自生物样品的一种以上的生物标记而允许准确、快速和灵敏地预测和诊断脓毒。通过分子诊断方法实现该预测和诊断，在该分子诊断方法中，通过在一个时间点从个体，尤其具有患脓毒危险、患有脓毒，或者被怀疑患有脓毒的个体得到生物标记谱，并将来自该个体的生物标记谱与参比生物标记谱相比较。可以从一群个体(“参比群体”)得到参比生物标记谱，这些个体例如，受到脓毒的折磨或者遭受脓毒发作或者处于脓毒发展的特定阶段。如果来自该个体的生物标记谱含有来自参比群体的生物标记谱的适宜的特征性特征，那么该个体被诊断为更可能与参比群体一样发展成脓毒、受到脓毒的折磨或者处于脓毒发展的特定阶段。从各种个体群体也可以得到参比生物标记谱，这些群体包括患有SIRS或者受到感染但是没有SIRS的那些个体。因此，本发明允许临床医生确定哪些患者不患有SIRS，哪些患有SIRS但是不可能在研究的期限内发展为脓毒，哪些患者患有脓毒，或者哪些处于最终患脓毒的危险中。
尽管本发明的方法尤其可用于检测或预测SIRS患者中脓毒的发作，但是本领域技术人员将理解本发明的方法可以用于任一患者，该患者包括，但不限于，被怀疑患有SIRS或者处于脓毒的任一阶段的患者。例如，可以从患者采集生物样品，并且可以将该样品中的生物标记谱与几种不同的参比生物标记谱相比较，这些参比生物标记谱的每一种来自例如患有SIRS或者处于脓毒的特定阶段的患者。将该患者的生物标记谱分类为相应于来自特定参比群体的图可以预测该患者属于该参比群体中。基于从本发明的方法所得的诊断，可以启动适宜的治疗方案。
用于诊断或者预测SIRS、脓毒或者脓毒发展的阶段的现有方法是基于非特异的临床病征和症状；因此，所得诊断通常具有有限的临床效用。因为本发明的方法准确地检测脓毒的各种阶段，所以这些方法可用于鉴定可能适宜地参加治疗研究的那些个体。因为可以从单个时间点所得的生物样品中生物标记表达的“快照”预测或诊断脓毒，所以该治疗研究可以在严重的临床症状出现之前开始。因为测定生物样品的生物标记谱，所以不必鉴定具体生物标记。然而，本发明提供了鉴定脓毒或者脓毒发展的特定阶段的特征性图谱的特定生物标记的方法。这些生物标记自身将是预测或者诊断脓毒的有用工具。
为此，本发明提供了多种核酸生物标记或者核酸生物标记的组合。从来自个体的生物样品(例如，血样)鉴定核酸生物标记。不被理论所束缚，编码与宿主对SIRS或者脓毒的多个阶段(包括使用常规技术对脓毒的临床怀疑之前脓毒的发作)有关的蛋白的某些mRNA的表达水平可以预测或者诊断脓毒的阶段或者诊断SIRS。该生物样品中的细胞表达编码这些蛋白的mRNA，并且这些mRNA的表达水平的检测可用于确定该个体中脓毒的状态或者诊断SIRS。本发明的核酸生物标记包括，但不限于，mRNA、从这些mRNA制备的核酸，和能够与mRNA形成双链体的核酸。本发明的核酸生物标记被称为“宿主应答生物标记”。
因此，本发明还提供了试剂盒，其含有选自表2-10任一个中所列核酸的至少1、2、3、4、5、10或更多种宿主应答生物标记。表2-10中所列核酸通过它们所编码的蛋白质识别。用于本发明目的的宿主应答生物标记包括，但不限于，编码所鉴定的蛋白的mRNA、从该mRNA制备的cDNA、和能够与编码所鉴定的蛋白的mRNA形成特异复合物(例如，杂交的双链体)的DNA或者其他分子。在一个实施方案中，该试剂盒含有DNA探针(例如，cDNA或者寡核苷酸)，该探针能够与相应于表2-10中所列的生物标记的mRNA形成双链体。在另一实施方案中，本发明提供了一种方法，该方法包括使用DNA探针构建核酸阵列，通过检测个体的生物样品中存在的mRNA生物标记，该核酸阵列能够确定个体中脓毒的状态或者诊断SIRS。
本发明还提供了宿主应答生物标记谱，该图含有至少2、3、4、5、10或20或更多种特征，这些特征是核酸的可检测的特征并且有助于参比群体中个体的分类，该分类的准确度为至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或约100％。参比群体选自正常参比群体、SIRS阳性参比群体、受感染的/SIRS-阴性参比群体、脓毒阳性参比群体、处于脓毒发展的特定阶段的参比群体、通过常规技术在约0-36小时后证实患有脓毒的SIRS-阳性参比群体、通过常规技术在约36-60小时后证实患有脓毒的SIRS-阳性参比群体、和通过常规技术在约60-84小时后证实患有脓毒的SIRS-阳性参比群体。
本发明还提供了分离宿主应答生物标记的方法，其中该生物标记能够被用于确定个体中脓毒状态或者诊断SIRS的方法。该方法包括从来自个体的群体的生物样品得到宿主应答生物标记的参比生物标记谱并鉴定参比生物标记谱中能够确定个体中脓毒状态或者诊断SIRS的特征。然后鉴定并分离相应于该特征的宿主应答生物标记。
附图简述
图1图解了SIRS向脓毒的发展。脓毒的病症由至少三个阶段组成，脓毒患者从严重脓毒发展到脓毒性休克到多种器官功能异常。
图2显示了脓毒和SIRS之间的关系。维恩(Venn)图中所示的多个集合相应于具有所示的病症的个体的群体。
优选实施方案详述本发明允许利用在一个时间点(“快照”)或者在疾病发展的过程中从个体得到的一种或多种生物样品快速、灵敏和准确地诊断或预测脓毒。有利地，可以在临床症状发作前诊断或者预测脓毒，从而允许更有效的治疗干预。
“系统性炎性应答综合症”或者“ISRS”指对多种严重的临床损伤的临床应答，其表现为24小时内下面的状况的两种或多种*体温大于38℃(100.4°F)或者小于36℃(96.8°F)；*心率(HR)大于90次/分钟；*呼吸率(RR)大于20次呼吸/分钟，或者PCO2小于32mm Hg，或者需要机械通气；和*白细胞数(WBC)大于12.0×109/L或者小于4.0×109/L或者大于10％未成熟形式(带)。
SIRS的这些症状代表SIRS的一致定义，该定义在将来可以被修改或者由改良的定义代替。本定义用于阐明当前的临床实践并且不代表本发明的关键方面。
患有SIRS的患者具有临床表现，其被归为如上面定义的SIRS，但是在临床上不被认为是脓毒的。处于发生脓毒的危险中的个体包括ICU中的患者和遭受生理创伤，如烧伤或者其他损伤的患者。“脓毒”指与证实的感染过程相关的SIRS-阳性病症。脓毒的临床怀疑由感染过程导致的SIRS患者的SIRS-阳性病症的怀疑引起。本文中，“脓毒”包括脓毒的所有阶段，包括，但不限于，脓毒的发作、严重脓毒和与脓毒的末期相关的MOD。
“脓毒的发作”指脓毒的早期，即，临床表现足够支持脓毒的临床怀疑之前的阶段。因为本发明的方法用于检测使用常规技术怀疑脓毒的时间之前的脓毒，所以只能在脓毒的表现在临床上更明显的时候回顾地证实早期脓毒时该患者的疾病状态。患者形成脓毒的确切机理不是本发明的关键方面。本发明的方法可独立于感染过程的起源检测生物标记谱中的变化。不管脓毒怎样产生，本发明的方法都允许确定患有或者怀疑患有通过前面所用的标准分类的脓毒或者SIR的患者的状态。
“严重脓毒”指与器官功能异常、灌注不足异常、或者脓毒诱导的低血压有关的脓毒。灌注不足异常包括，但不限于，乳酸中毒、少尿或者精神状态的急剧改变。“脓毒性休克”指脓毒诱导的低血压，其对于足够的静脉内液体刺激不响应并且表现为外周低血压。“转变患者”指SIRS阳性患者，该患者在被监视期间，通常在ICU停留期间发展成脓毒的临床怀疑。“非转变患者”指SIRS阳性患者，该患者在被监视期间，通常在ICU停留期间不发展成脓毒的临床怀疑。
“生物标记”是存在于生物样品并且可以从该生物样品分离或者在该生物样品中检测的几乎任一种生物化合物，如蛋白质或者其片段、肽、多肽、蛋白聚糖、糖蛋白、脂蛋白、糖、脂质、核酸、有机或无机化学品、天然聚合物，和小分子。此外，生物标记可以是完整分子，或者其可以是该完整分子的部分，该部分可以具有部分功能或者可以被例如，抗体或者其他特异结合蛋白质识别。如果生物标记的可检测方面与该患者的给定状态，如脓毒的特定阶段有关，那么认为该生物标记物是可提供信息的。这种可检测的方面可以包括，例如，来自该个体的生物样品中该生物标记的存在、缺乏，或者浓度，和/或该生物标记作为生物标记谱的一部分存在。生物标记的这种可检测的方面在本文中被定义为“特征”。特征还可以是生物标记的两个或多个可检测方面的比例，这些生物标记例如，可以具有或者不具有公知的同一性。“生物标记谱”包括至少两种这些特征，其中这些特征可以相应于相同的或者不同类别的生物标记，如核酸和糖。生物标记谱还可以含有至少3、4、5、10、20、30或者更多种特征。在一个实施方案中，生物标记谱含有数百，或者甚至数千种特征。在另一实施方案中，生物标记谱含有至少一种内标的至少一个可检测的方面。
“表型变化”是与患者的给定状态有关的参数的可检测的变化。例如，表型变化可以包括体液中生物标记的增加或者减少，其中该变化与脓毒或者脓毒的发作有关。表型变化可以还包括该患者的给定状态的可检测方面的变化，该变化不是生物标记的可检测方面的变化。例如，表型中的变化可以包括体温、呼吸率、脉搏、血压、或者其他生理参数中的可检测的变化。这些变化可通过临床观察和使用技术人员熟知的常规技术检测来确定。本文中，“常规技术“是基于表型变化对个体分类的技术，这些技术不得到根据本发明的生物标记谱。
“决策规则(decision rule)”是用于将患者分类的方法。该规则可以采取本领域中公知的一种或多种形式，如Hastie等人，“TheElements of Statistical Learning，”Springer-Verlag(Springer，New York(2001))中所例证的形式，该文献被完整并入本文作为参考。对样品内分子的复杂混合物的生物标记分析产生了数据集中的特征。可以用决策规则作用于特征的数据集以预测脓毒的发作、确定脓毒的发展、诊断脓毒，或者诊断SIRS。
决策规则的应用不需要完美分类。在一个实施方案中，分类可以具有至少约90％或者甚至更高的确定性。在其他实施方案中，该确定性为至少约80％、至少约70％、或至少约60％。，确定性的有用的程度可以根据本发明的具体方法而变。“确定性”被定义为被准确分类的个体的总数与被分类的个体总数的商。本文中，“确定性”指“准确度”。分类的特征还在于其“灵敏性”。分类的“灵敏性”涉及当前被鉴定患有脓毒的脓毒患者的百分数。“灵敏性”在本领域中被定义为真阳性数与真阳性和假阴性之和的商。相比，该方法的“特异性”被定义为被正确鉴定为不患有脓毒的患者的百分数。即，“特异性”涉及真阴性与真阴性和假阳性之和的商。在一个实施方案中，灵敏性和/或特异性为至少约90％、至少约80％、至少约70％或至少约60％。可以用于以足够的确定性对个体分类的特征的数目通常为约4个。然而，根据所寻找的确定性的程度，特征数可以更多或更少，但是在所有情况中，特征数为至少1个。在一个实施方案中，用于分类个体的特征数被优化而允许以高确定性对个体分类。
患者中脓毒或者SIRS的“状态确定”包括对患者的生物标记谱分类以(1)检测该患者中脓毒或者SIRS的存在，(2)预测该患者中脓毒或者SIRS的发作，或(3)检测患者中脓毒的发展。“诊断”脓毒或者SIRS指鉴定或者检测患者中的脓毒或者SIRS。因为本发明能够在明显可观察到的临床表现之前更灵敏地检测脓毒，所以脓毒的鉴定或者检测包括检测如上定义的脓毒的发作。即，“预测脓毒的发作”指将该患者的生物标记谱归类为相应于来自一些个体的生物标记谱，这些个体正从SIRS的特定阶段发展到脓毒或者从被感染状态到脓毒(即，从感染到具有相伴的SIRS的感染)。脓毒或者SIRS的“发展检测”或者“发展确定”指对已经被诊断患有脓毒或者SIRS的患者的生物标记谱分类。例如，将已经被诊断为患有脓毒的患者的生物标记分类可以包括检测或者确定该患者从脓毒到严重脓毒或者到具有MOD的脓毒的发展。
根据本发明，通过从个体得到的样品得到生物标记谱可以诊断或者预测脓毒。本文中，“得到”指“拥有”。本发明尤其可用于预测和诊断个体中的脓毒，其中该个体患有感染，或者甚至脓毒，但是该患者还没有被诊断为患有脓毒、怀疑患有脓毒，或者处于发生脓毒的危险中。本发明以相同的方式可用于检测和诊断个体中SIRS。即，本发明可以用于证实SIRS的临床怀疑。本发明还可用于检测脓毒过程的多个阶段，诸如感染、菌血症、脓毒、严重脓毒、脓毒性休克，等等。
将从个体得到的生物标记谱，即，受试生物标记谱与参比生物标记谱相比较。该生物标记谱可以从一个个体或者两个或多个个体的群体产生。该群体例如，可以含有3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多个体。此外，如果受试和参比生物标记谱从在不同时间点采集的生物样品产生并且相互比较，那么在本发明方法中被比较的参比生物标记谱和个体的(受试)生物标记谱可以从相同个体产生。例如，可以在研究期开始时从个体得到样品。然后从该样品得到的参比生物标记谱可以与从该同一个体的随后样品产生的生物标记谱相比较。这种比较可用于，例如，通过随时间重复分类确定该个体的脓毒状态。
参比群体可以选自没有SIRS(“SIRS-阴性”)的个体、没有SIRS但是经历感染过程的个体、患有SIRS但是不存在脓毒(“SIRS-阳性”)的个体、患有脓毒的发作的个体、脓毒阳性并且处于脓毒发展的阶段之一的个体，或者具有增加发生脓毒的危险性的生理创伤的个体。此外，参比群体可以是SIRS-阳性的并随后用常规技术诊断脓毒。例如，用于产生参比图的SIRS-阳性患者的群体可以在为了产生参比生物标记谱而从这些患者采集生物样品之后约24、48、72、96或更多小时后被诊断为脓毒。在一个实施方案中，使用常规技术在生物样品采集后约0-36小时、约36-60小时、约60-84小时、或约84-108小时后将SIRS-阳性个体的群体诊断为脓毒。如果该生物标记谱可以预示脓毒或者其发展阶段之一，那么临床医生就可以在脓毒的临床症状表现之前开始治疗。治疗通常包括检查该患者以确定感染源。一旦定位了感染源，临床医生通常将从感染部位得到培养物，这优选在开始相关的经验性抗微生物治疗和可能额外的辅助性治疗措施，如排出脓肿或者除去受感染的导管之前。脓毒的疗法在Healy(如前)中综述。
本发明的方法包括将个体的生物标记谱与参比生物标记谱比较。本文中，“比较”包括辨别个体和参比生物标记谱中至少一处不同的方法。从而，比较可以包括通过视觉检查层析谱，并且比较可以包括分配给谱的特征的值的算术上的和统计学的比较。这种统计学比较包括，但不限于，应用决策规则。如果生物标记谱含有至少一种内标，那么用以辨别生物标记谱中的差异的比较还可以包括这些内标的特征，从而生物标记的特征与内标的特征相关。该比较可以预测获得脓毒或者SIRS的机会；或者该比较可以证实存在或者不存在脓毒或者SIRS；或者该比较可以指出个体所处的脓毒的阶段。
因此，本发明不需要在监视期内实施时间-密集的测定，也不需要鉴定每种生物标记。尽管本发明不需要监视期来对个体分类，但是应该理解对该个体的重复分类，即重复快照，可以随时间进行直到该个体不再处于危险中。备选地，从该个体得到的生物标记谱可以与在不同时间点从该相同个体得到的一个或多个生物标记谱相比较。技术人员将明白在重复分类过程中做出的每次比较都能够将该个体归类为属于或者不属于参比群体。
通过特征性生物标记谱可以区分具有相应于从无脓毒到MOD的脓毒发展的多个阶段的多种生理状况的个体。本文中，“个体”是动物，优选哺乳动物，更优选人或者非人灵长类。术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。个体可以是正常的、被怀疑患有SIRS或者脓毒、处于患SIRS或者脓毒的危险中，或者被证实患有SIRS或者脓毒。尽管有许多公知的生物标记与脓毒的发展有关，但是并不是所有这些标记都在最初的临床前阶段出现。实际上，仅能通过从最终表现脓毒的临床症状的个体所得样品的回顾分析确定早期脓毒的特征性生物标记的子集。不被理论所束缚，即使导致脓毒的最初病理感染也可以引起生理变化，这些生理变化在生物标记表达的特定变化中体现。例如，一旦确定了脓毒阶段的特征性生物标记谱，就可以将从个体得到的生物样品的生物标记谱与该参比谱相比较以确定该受试者是否也处于脓毒的那一特定阶段。
群体从脓毒的一个阶段发展到另一阶段，或者从常态(即，特征是不患有脓毒或者SIRS的状态)到脓毒或者SIRS和反之亦然的特征是生物标记谱中的改变，因为某些生物标记谱以更高的水平表达并且其他生物标记的表达被下调。生物标记谱中的这些变化可以反映参比群体对例如感染和/或炎症的生理应答中的渐进性建立。技术人员将明白随着生理应答的消退，参比群体的生物标记谱也将变化。如上所述，本发明的一个优点是能够使用来自单个生物样品的生物标记谱将个体归类为特定群体中的成员。然而，技术人员将明白通过对该个体的随后分类可以有助于确定特定生理应答正在被建立或者正在消退。为此，本发明提供了多种生物标记，在对脓毒或者SIRS的生理应答被建立或者消退时这些生物标记的表达水平有的增加，有的降低。例如，研究人员可以选择个体的生物标记谱的一种特征，公知随着对脓毒的生理应答的建立该特征的强度改变。来自该个体的随后的生物样品的谱中相同特征的比较可以确定该个体是否正在向更严重的脓毒发展或者正在向常态发展。
生物标记的分子身份不是本发明必需的。实际上，本发明不应局限于以前已经鉴定的生物标记(见美国专利申请序号10/400,275，2003年3月26日提交)。因此，预期将鉴定新的生物标记，这些生物标记是给定个体群体，特别脓毒早期之一的群体所特有的。在本发明的一个实施方案中，鉴定并分离生物标记。然后该生物标记被用于产生特异结合的抗体，该抗体可以促进多种诊断测定中的生物标记检测。为此，任一免疫测定可以使用能够结合生物标记分子的任何抗体、抗体片段或者衍生物(例如，Fab、Fv、或scFv片段)。这些免疫测定是本领域中熟知的。如果该生物标记是蛋白，那么可以用成熟的技术将其测序并且克隆其编码基因。
本发明的方法可以用于筛选，例如，ICU所接纳的患者。当接纳时立即采集生物样品，例如，血。血中蛋白质和其他分子的复杂混合物被分解成生物标记谱。这可以通过使用任一技术或技术的组合实现，该技术可以基于某种物理或者化学性质可再现地区分这些分子。在一个实施方案中，分子被固定在基质上，然后通过激光解吸/电离飞行时间质谱分离和区分这些分子。通过特征性解吸模式产生波谱，该解析模式反映了每个分子或者其片段的质量/电荷比。在另一实施方案中，生物标记选自从细胞提取物得到的多种mRNA种类，并通过将该个体的mRNA种类与cDNAs阵列杂交得到生物标记谱。cDNA阵列的诊断用途是本领域中熟知的(见，例如，Zou，等人，Oncogene214855-4862(2002))。在再一个实施方案中，联合使用蛋白质和核酸分离方法可以得到图谱。
本发明还提供了试剂盒，该试剂盒可用于确定个体中脓毒的状态或者诊断SIRS。本发明的试剂盒含有至少一种生物标记。用于本发明的特定生物标记在本文中给出。该试剂盒的生物标记可用于产生根据本发明的生物标记谱。通常，试剂盒中的生物标记将至少以一定的特异性结合生物样品中所含的生物标记分子，其中该生物标记谱从该生物样品产生。试剂盒中化合物类别的实例包括，但不限于，蛋白质、其片段、肽、多肽、蛋白聚糖、糖蛋白、脂蛋白、糖类、脂质、核酸、有机和无机化学品，和天然和合成的聚合物。该生物标记可以是阵列的部分，或者该生物标记可以被分开和/或单独地包装。该试剂盒可以还含有至少一种内标，该内标用于产生本发明的生物标记谱。同样，内标可以是上述任一种化合物类别。本发明的试剂盒可以还含有试剂，该试剂可用于可检测地标记生物样品中所含的生物标记，其中生物标记谱从该生物样品产生。为此，试剂盒可以含有一组抗体或者它们的功能片段，这些抗体或者它们的功能片段结合下面列出生物标记的表的任一个表中所给出的生物标记的至少2、3、4、5、10、20或更多种。抗体自身可以被可检测地标记。试剂盒可以还含有特异生物标记结合组分，如适合体(aptamer)。如果生物标记含有核酸，那么试剂盒可以提供寡核苷酸探针，该探针能够与该生物标记或者生物标记的互补链形成双链体。寡核苷酸探针可被可检测地标记。
当生物标记被用于产生抗体时，本发明的试剂盒可以还包括药物赋形剂、稀释剂和/或佐剂。药物佐剂的实例包括，但不限于，防腐剂、增湿剂、乳化剂，和分散剂。通过包括多种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等等可以确保防止微生物的作用。可能还希望包括等渗剂，如糖、氯化钠，等等。通过包括延缓吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶，可以延长可注射的药物形式的吸收。
产生生物标记谱根据一个实施方案，本发明的方法包括从从个体采集的生物样品得到生物标记谱。生物样品可以是血液、血浆、血清、唾液、痰、尿、脑脊液、细胞、细胞提取物、组织样品、组织活检、粪便样品，等等。例如，从个体的群体可以得到参比生物标记谱，这些个体选自SIRS-阴性个体、SIRS-阳性个体、患有脓毒发作的个体和已经患有脓毒的个体。可以在脓毒发展的任一阶段，如感染、菌血症、严重脓毒、脓毒性休克或者MOD，得到已经患有脓毒的个体的参比生物标记谱。
在一个实施方案中，可以用分离方法产生生物标记谱，从而仅分析样品中生物标记的子集。例如，在样品中分析的生物标记可以由来自细胞提取物的mRNA种类组成，该细胞提取物已经被分级分离而仅获得样品中的核酸生物标记，或者生物标记可以由样品中蛋白质的总补体的一部分组成，所述蛋白质已经通过层析技术被分级分离。备选地，可以不用分离方法而产生生物标记谱。例如，可以用标记化合物询问(interrogate)生物样品，该标记化合物与样品的中的生物标记形成特异复合物，其中该特异复合物中标记的强度是该生物标记的可检测的特征。适于形成这种特异复合物的化合物是被标记的抗体。在一个实施方案中，使用具有可扩增的核酸作为标记的抗体检测生物标记。在再一个实施方案中，当两种抗体(每种缀合到核酸标记的一条链)与生物标记相互作用时，该核酸标记变得可被扩增，从而，两条核酸链形成可扩增的核酸。
在另一个实施方案中，生物标记谱可来自测定，如核酸的测定，其中生物标记是核酸或者它们的互补物。例如，生物标记可以是核糖核酸。使用选自核磁共振、核酸阵列、点印迹、狭线印迹、反转录扩增和RNA印迹分析的方法可以得到生物标记谱。在另一个实施方案中，通过对该生物标记特异的反应性抗体，或者该抗体的功能片段通过免疫学检测该生物标记谱。抗体的功能片段是抗体的片段，其至少保留结合完整抗体所结合的抗原的一定能力。该片段包括，但不限于，scFv片段、Fab片段和F(ab)2片段，这些片段可以通过重组方法或者酶产生。在另一实施方案中，不同于抗体的特异结合分子，如适合体，可用于结合该生物标记。在再一个实施方案中，生物标记谱可以含有感染物或者其组分的可检测方面。在再一个实施方案中，生物标记谱可以含有小分子的可检测方面，这些小分子可以包括蛋白质或者核酸的片段，或者可以包括代谢物。
使用一种或多种分离方法可以产生生物标记谱。例如，适宜的分离方法可以包括质谱方法，如电喷雾电离质谱(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)(n是大于0的整数)、基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、表面增强的激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)、硅上解吸/电离(DIOS)、二级离子质谱(SIMS)、四极飞行时间(Q-TOF)、大气压化学电离质谱(APCI-MS)n、APCI-MS/MS、APCI-(MS)、大气压光电离质谱(APPI-MS)、APPI-MS/MS，和APPI-(MS)n。其他质谱方法可以包括四极、傅立叶变换质谱(FTMS)和离子阱。其他适宜的分离方法可包括化学萃取分配、柱层析、离子交换层析、疏水(反相)液体层析、等电聚焦、一维聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)或者其他层析，如薄层、气相或液相层析，或者它们的组合。在一个实施方案中，生物样品可以在应用分离方法前被分级分离。
通过不需要生物标记自身的物理分离的方法也可以产生生物标记谱。例如，可以用核磁共振(NMR)波谱学从分子的复杂混合物分辨生物标记谱。用NMR对肿瘤分类的类似用途在例如Hagberg，NMRBiomed.11148-56(1998)中公开。额外的方法包括核酸扩增技术，这些技术可用于产生生物标记谱而不用物理分离各个生物标记。(见例如，Stordeur等人，J.Immunol.，Methods 25955-64(202)和Tan等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 9911387-11392(2002))。
在一个实施方案中，使用激光解吸/电离飞行时间质谱产生生物标记谱，其中生物标记是蛋白质或者蛋白质片段，它们已经被入射激光辐射电离或者从固定支持物蒸发。通过每种蛋白的特征性飞行时间产生图谱，该特征性飞行时间取决于其质荷比(“m/z”)。多种激光解吸/电离技术也是本领域中公知的。(见，例如，Guttman等人，Anal.Chem.731252-62(2001)和Wei等人，Nature 399243-46(1999))。
激光解吸/电离飞行时间质谱允许在相对短的期限内产生大量信息。生物样品被应用于多种支持体之一，该支持体结合样品中的所有生物标记，或者这些生物标记的子集。细胞裂解物或者样品以少至0.5μL的体积被直接应用于这些表面，这些细胞裂解物或者样品被或者不被预先纯化或者分级分离。裂解物或样品在应用于支持体表面上时可以被浓缩或稀释。然后用激光解吸/电离在少至3个小时内产生样品的质谱。
在另一实施方案中，测定了来自该个体的细胞提取物的总mRNA，并且将从该生物样品所得多种mRNA种类用作生物标记。例如，使用本领域中公知的标准方法，通过将这些mRNA与探针阵列杂交可以得到图谱，该探针阵列可以含有寡核苷酸或者cDNA。备选地，可以将mRNA实施凝胶电泳或者印迹方法，如点印迹、狭线印迹或者RNA印迹分析，所有这些方法都是本领域中公知的(见，例如，Sambrook等人，“Molecular Cloning，第三版”，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(2001))。通过逆转录，然后如Stordeur等人(如前)公开的扩增并检测所得cDNA也可以得到mRNA图。在另一实施方案中，使用组合方法，如核酸阵列与质谱的组合，可以得到该图。
数据分析算法的使用在一个实施方案中，个体生物标记谱与参比生物标记谱的比较包括应用决策规则。该决策规则可以包括数据分析算法，如计算机模式识别算法。其他适宜的算法包括，但不限于，可以检测特征值的分布中的差异的逻辑回归或者非参数算法(例如，Wilcoxon有符号的秩检验)。决策规则可以基于1、2、3、4、5、10、20或更多种特征。在一个实施方案中，决策规则基于数百或者更多特征。应用决策规则也可以包括使用分类树算法。例如，参比生物标记谱可以含有至少三种特征，其中这些特征是分类树算法中的预测值。数据分析算法预测群体(或者类)中的成员，其准确度为至少约60％、至少约70％、至少约80％和至少约90％。
适宜的算法是本领域中公知的，一些算法在Hastie等(如前)中综述。这些算法将来自生物材料，如血样的复杂光谱分类以将个体区分为正常的或者具有特定病态的特征性生物标记表达水平。尽管这些算法可用于增加应用决策规则的速度和效率并避免研究人员偏倚，但是本领域技术人员将认识到不需要基于计算机的算法来实施本发明的方法。
不管用于产生生物标记谱的方法，都可以应用算法比较生物标记谱。例如，适宜的算法可应用于使用气相色谱产生的生物标记谱，如Harper，“Pyrolysis and GC in Polymer Analysis”Dekker，New York(1985)中所讨论的。此外，Wagner等人，Anal.Chem 741824-35(2002)公开了一种算法，该算法提高了基于通过静态飞行时间二级离子质谱(TOF-SIMS)得到的光谱对个体分类的能力。此外，Bright等人，J.Microbiol.Methods 48127-38(2002)公开了通过分析MALDI-TOF-MS光谱以高确定性(79-89％正确分类率)区分细菌株系的方法。Dalluge，Fresenius J.Anal.Chem.366701-11(2000)讨论了使用MALDI-TOF-MS和液相色谱-电喷雾电离质谱(LC/ESI-MS)对复杂生物样品中生物标记谱分类。
生物标记通过产生生物标记谱可以实施本发明的方法，这些生物标记谱可以诊断或者预测脓毒或者SIRS。因为图谱产生足够实施本发明，所以组成该图谱的生物标记不必已知或者被随后鉴定。
可用于根据本发明的方法确定个体中脓毒状态或者诊断SIRS的内源生物标记在本文中被统称为“宿主应答生物标记”。可用于产生本发明的生物标记谱的生物标记可以包括公知提供关于应答感染中免疫系统的状态的信息的那些生物标记；然而，这些生物标记不总是同等地提供信息。这些生物标记可以包括激素、自身抗体、可溶的和不可溶的受体、生长因子、转录因子、细胞表面标记和可溶的标记，这些生物标记来自宿主或者来自病原自身，如外壳蛋白、脂多糖(内毒素)、脂磷壁酸，等等。其他生物标记包括，但不限于，细胞表面蛋白，如CD64蛋白；CD11b蛋白；HLA II类分子，包括HLA-DR蛋白和HLA-DQ蛋白；CD54蛋白；CD71蛋白；CD86蛋白；表面结合的肿瘤坏死因子受体(TNF-R)；模式识别受体如Toll样受体；可溶的标记如白介素IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、和IL-18；肿瘤坏死因子α(TNF-α)；新喋呤；C-反应蛋白(CRP)；原降钙素(PCT)；6-酮F1α；血栓烷B2；白三烯B4、C3、C4、C5、D4和E4；γ干扰素(IFNγ)；α/β干扰素(IFNα/β)；α淋巴毒素(LTα)；补体组分(C′)；血小板活化因子(PAF)；缓激肽、一氧化氮(NO)；粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)；巨噬细胞抑制因子(MIF)；白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)；可溶性肿瘤坏死因子受体(sTNFr)；可溶性白介素受体sIL-lr和sIL-2r；转化生长因子β(TGFβ)；前列腺素E2(PGE2)；粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)；和其他炎症介质。(在Oberholzer等人，Shock 1683-96(2001)和Vincent等人，“The Sepsis Text，”Carlet等人，编者，(Kluwer AcademicPublishers，2002)中综述)。通常和在临床上与菌血症有关的生物标记也是用于本发明的生物标记的候选者，条件是这些生物标记在生物样品中通常和经常发生。生物标记可以包括低分子量化合物，它们可以是蛋白质或者核酸的片段，或者它们可以包括代谢物。低分子量化合物，如代谢物的存在或者浓度可以反映与脓毒和/或SIRS有关的表型变化。具体地，小分子量生物标记的浓度的变化与应答SIRS和/或脓毒过程中任何生理变化产生的细胞代谢的变化相关，这些生理变化为诸如低体温或者高体温、心率或者呼吸率增加、组织低氧、代谢性酸中毒或者MOD。生物标记还可以包括编码蛋白质生物标记的RNA和DNA分子。
生物标记还可以包括与白细胞调节，如嗜中性粒细胞活化或者单核细胞失活有关的至少一种分子。CD64和CD11b的表达增加被认为是嗜中性粒细胞和单核细胞活化的信号。(Oberholzer等人，如前和Vincent等人，如前中综述)。可用于本发明的那些生物标记包括与巨噬细胞裂解产物相关的生物标记，如细胞因子代谢变化的标记(见，Gognon等人，Cell 110119-31(2002)；Oberholzer，等人，如前；Vincent，等人，如前)。
生物标记可以还包括公知参与或者被发现参与炎症过程的信号因子。信号因子可以启动细胞内事件级联，包括受体结合、受体活化、细胞内激酶的活化、转录因子的活化、基因转录和/或翻译水平的变化，和代谢过程的变化，等。为了本发明的目的，这些分子活化的信号分子和过程被全体定义为“与脓毒途径有关的生物分子”。相关的预测性生物标记可以包括与脓毒途径有关的生物分子。
因此，尽管本发明的方法可以使用无偏的方法鉴定预测性生物标记，但是技术人员清楚与生理应答或者与多种信号途径相关的生物标记的特定组可以是具体关注的主题。这对于如下情况尤其是如此来自生物样品的生物标记与阵列(例如，抗体阵列或核酸阵列)接触，其中该阵列可通过与生物标记的直接和特异相互作用用于检测多种生物标记的量。在该情况中，阵列组分的选择可基于如下提示，即具体途径与个体中脓毒或者SIRS的状态的确定有关。特定生物分子具有可以预测或者诊断脓毒或SIRS的特征的指示可以导致预期在生理上以一致方式被调节的其他生物分子同样可以提供预测或者诊断特征。然而，技术人员将明白，由于生物系统的复杂性这种预期可能不被实现。例如，如果特定mRNA生物标记的量是预测性特征，如果另一生物标记的表达在翻译后水平上被调节，那么该另一生物标记的mRNA表达中的一致变化可能不能被检测。此外，生物标记的mRNA表达水平可以受到多种会聚途径的影响，这些途径可以与对脓毒的生理应答有关或者无关。
可以从任一生物样品得到生物标记，作为实例但不限制，该生物样品可以是血液、血浆、唾液、血清、尿、脑脊液、痰、粪便、细胞和细胞提取物，或者其他生物流体样品、来自宿主或患者的组织样品或者组织活检样品。从个体所得的确切的生物样品可以不同，但是采样优选侵入性最小并且容易通过常规技术实施。
通过任一常规技术可以实施表型变化的检测。通过临床观察和检测可以实现体温、呼吸率、脉搏、血压、或其他生理参数的检测。生物标记分子的检测可以包括，例如，指出存在、浓度、表达水平、或者任何其他与生物标记分子相关的值的检测。生物标记分子的检测形式通常取决于用于从生物样品形成这些生物标记谱的方法。例如，通过考马斯蓝染色或者通过银染可以检测通过2D-PAGE分开的生物标记，所述染色方法是本领域中成熟的。
分离有用的生物标记预期有用的生物标记将包括还没有鉴定或者与相关生理状态有关的生物标记。在本发明的一方面，有用的生物标记被鉴定为来自生物样品的生物标记谱的组分。这种鉴定可以通过本领域中任一种熟知的方法实施，该方法包括免疫测定或者自动化微测序。
一旦鉴定了有用的生物标记，就可以通过许多熟知的分离方法之一分离该生物标记。因此，本发明提供了分离可以诊断或者预测脓毒的生物标记的方法，该方法包括从个体的群体得到参比生物标记谱，鉴定可以预测或者诊断脓毒或者脓毒发展阶段之一的参比生物标记谱的一种特征，鉴定与该特征相应的生物标记，并分离该生物标记。一旦分离，例如，如果该生物标记是蛋白，那么该生物标记就可用于产生结合该标记的抗体，如果该生物标记是核酸，那么该生物标记可用于开发特异寡核苷酸探针。
技术人员将容易明白可以进一步表征有用的特征以确定该生物标记的分子结构。以这种方式表征生物分子的方法是本领域中熟知的并且包括高分辨率质谱、红外光谱、紫外分光法和核磁共振。确定核酸生物标记的核苷酸序列、多肽生物标记的氨基酸序列，和糖生物标记的组成和序列的方法是本领域中熟知的。
本发明应用于SIRS患者在一个实施方案中，当前描述的方法被用于筛选尤其处于患脓毒的危险中的SIRS患者。从SIRS阳性患者采集生物样品，并将该样品中生物标记谱与来自最终发展成脓毒的SIRS-阳性患者的参比图相比较。将该患者的生物标记谱归类成相应于发展成脓毒的SIRS-阳性群体的参比图可以诊断该SIRS-阳性患者将同样发展成脓毒。然后可以启动治疗方案以阻止或者防止脓毒的发展。
在另一实施方案中，当前描述的方法被用于证实患者患有SIRS的临床怀疑。在该情况中，将样品中生物标记谱与患有SIRS或者不患有SIRS的个体的参比群体比较。将该患者的生物标记谱归类为相应于一个群体或者另一群体可以用于诊断该个体患有SIRS或者不患有SIRS。
实施例下面的实施例是本发明所包括的实施方案的代表并且绝不限制本发明所包括的主题。
1.1接受和分析的生物样品为患者志愿者的两个群体建立参比生物标记谱。第一个群体(“SIRS组”)代表患有SIRS并且在“天1”进入本研究但是在它们的住院期间没有发展成脓毒的患者。第二个群体(“脓毒组”)代表同样患有SIRS并且在天1进入本研究但是在进入研究至少数天后通常发展成脓毒的患者。约每24小时从每个研究组采集血样。脓毒组中脓毒的临床怀疑在“时间0”发生。“时间-24小时”和“时间-48小时”分别代表脓毒组中脓毒发作的临床怀疑前24小时和48小时采集的样品。即，来自脓毒组的样品包括在进入研究当天(天1)、脓毒的临床怀疑前48小时(时间-48小时)、脓毒的临床怀疑前24小时(时间-24小时)、和脓毒发作的临床怀疑当天(时间0)采集的样品。
1.2分析来自生物样品的mRNA使用本领域中普通技术人员公知的方法对从患者分离的血样进行提取以除去mRNA。适宜的RNA分离方法在例如，RNAMETHODOLOGIES，A LABORATORY GUIDE FOR ISOLATIONAND CHARACTERIZATION，第二版，R.E.Farrell，Jr.，编者，Academic Press(1998)55-104页中发现。可以如RNA queousTM系统(无苯酚总RNA分离试剂盒，目录号1912，版本9908；Austin，Texas)所描述的使用基于过滤的总RNA分离方法。用于RNA分离和随后操作的步骤在被转让给Source Precision Medicine的WO 03/040404中进一步描述。
所选RNA种类一旦被分离，就可以使用信使特异引物或随机引物扩增。从来自公开数据库如Unigene(National Center for BiotechnologyInformation，National Library of Medicine，Bethesda，Maryland)的数据设计特异引物。使用本领域普通技术人员公知的原理，利用RT-PCR(见WO 03/040404，22页，24-32行)，用所设计的引物特异扩增样品中存在的特异RNA序列。可以使用恒温或者热循环仪，如ABI9600、9700、或7700循环仪(Applied Biosystems，Foster City，California.)扩增RNA序列。然后使用例如，如TaqManTM系统(PCRReagent Kit，Protocol，部分编号402823，修订A(1996)，AppliedBiosystems，Foster City，California)中描述的荧光-标记的检测引物检测所扩增的RNA。通过本领域中熟知的技术(见，例如，WO03/040404，23页，5-13行)实施RNA检测和定量。
从患者的血液分离RNA并纯化该RNA后，用下面的方案扩增该RNA并将其与72-元基因表达阵列反应，该阵列具有表1中阐明的核酸探针。
材料1.Applied Biosystems TaqMan逆转录试剂盒(P/N 808-0234)。试剂盒组分10×TaqMan RT缓冲液，25mM氯化镁，脱氧NTP混合物，随机六聚体，RNA酶抑制剂，MultiScribe逆转录酶(50U/mL)，和无RNA酶/DNA酶的水(来自Ambion的DEPC处理的水(产品号9915G)或者等价物)。
方法2.从-80℃制冷机取出RNA样品，室温解冻并立即置于冰上。
3.对于每次RT反应制备下面的逆转录酶试剂混合物每次反应(mL)10×RT缓冲液10.025mM MgCl222.0dNTPs 20.0随机六聚体 5.0RNA酶抑制剂 2.0逆转录酶2.5水 18.5总的80.0mL4.在1.5mL微量离心管中使每种RNA样品达到总体积20mL并加入80mL RT反应混合物。通过上下吸液混合该溶液。
5.将该样品在室温孵育10分钟。
6.然后将样品在37℃孵育1小时。
7.最后将样品在90℃孵育10分钟。
8.将样品在微量离心机中短时间离心。
9.如果将立即实施PCR，将样品置于冰上。否则将样品保存在-20℃备用。
10.使用18sRNA和β-肌动蛋白mRNA作为对照对所有RT样品运行PCR质量对照。
如上面描述的使用引物探针和第一条链cDNA。根据下面的步骤实施检测结合到72元基因表达阵列的扩增的RNAs材料1.每种目的基因的20×引物/探针混合物；18S内源对照的20×引物/探针混合物；2X TaqMan Universal PCR Master混合物；从血样提取的RNA转录的cDNA；Applied Biosystems 96-孔光学反应板；AppliedBiosystems Optical Caps，或者光学透明膜；和Applied Biosystem Prism7700序列检测器。
方法2.制备每种引物/探针混合物的原液，该原液含有目的基因的引物/探针、18S内源对照的引物/探针，和2×PCR Master混合物。下面的实施例阐明了对于一种基因使用一式四份样品试验两种条件(2个板)的典型设置。
1×(每孔)2×Master混合物12.5020×18S引物/探针混合物 1.2520×目的基因引物/探针混合物1.25总的 15.00μL3.通过将95μL cDNA稀释到2000μL水中制备cDNA靶标的原液。调节cDNA的量使得Ct值为10到18，通常12到13。
4.将15μL引物/探针混合物移液到Applied Biosystems 96-光学反应板的适宜的孔中。
5.将10μL cDNA储存液移液到Applied Biosystems 96-光学反应板的每个孔中。
6.用Applied Biosystems Optical Caps，或者光学透明膜密封板。
7.用AB Prism 7700序列检测器分析该板。
当使用TaqMan形式时，产生荧光的阈值水平所需的扩增循环数提供了对相应于样品中每种基因的mRNA的量的半定量估计。当以这种方式实施时，检测的平均变异系数(SD/平均值×100)通常小于5％，并且可以小于2％。在例如Hirayama等人，Blood 9246-52(1998)中描述了定量实时PCR扩增的方法。在例如WO 03/040404的20-23页中描述了定量实时扩增的额外的方面，并且这些方法的修改方案是本领域中熟知的。
1.3数据分析和结果对于每个样品，检测了结合到表达阵列上的72种不同的cDNA探针的mRNA的浓度。在该实例中，每种mRNA是一种生物标记，并且样品中每种mRNA的浓度是该标记的一种特征。通过这些生物标记与阵列的多种cDNA探针形成特异双链体的能力确定生物标记的浓度。该阵列的cDNA探针相应于编码蛋白的基因，所述蛋白包括如表1中所示的多种细胞因子、趋化因子或者生长因子、细胞标记、蛋白酶或蛋白酶抑制剂、受体、转录调节剂，和酶。用星号指出的阵列上存在的探针在WO 03/040404的46-52页描述。
表1
1.3.1交叉验证可以用多种方法鉴定特征，这些特征可提供将个体分成SIRS或者脓毒组的决策规则的信息，这些方法在下文描述。当决策规则是基于来自相对少的生物标记谱的大量特征时，选择偏倚可以影响为决策规则提供信息的特征的鉴定。(见Ambroise等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 996562-66(2002))。当数据被用于选择特征，并且对所选的特征实施有条件的估计性能而不考虑选择过程中的变异性时，将发生选择偏倚。结果是对分类准确度的过高估计。如果不对选择偏移调整，那么分类准确度可以达到100％，甚至决策规则是基于随机输入参数时也是如此(Id.)。可以在性能估计过程中包括特征选择来避免选择偏倚，而不管该性能估计过程是10倍交叉验证或者一种自举方法(见，例如，Hastie等人，如前，7.10-7.11，被并入本文作为参考)。
在本发明的一个实施方案中，通过10倍交叉验证检测模型性能。通过将数据随机分配到10个排他性组进行10倍交叉验证。然后依次将每组排除，并用模型拟合剩下的9组。将所拟合的模型应用于被排除的组，产生所预测的类别概率。通过简单地产生预测类别可以将预测的类别概率与实际的类别成员资格比较。例如，如果脓毒的概率为，例如，大于0.5，那么该预测的类别是脓毒。
偏差(Deviance)是比较概率与实际结果的一种量度。本文中，“偏差”被定义为 其中P为特定类别的类别概率。当对于实际的类别类别概率高时，偏差减小。两种模型可以对给定数据做出相同预测，然而优选的模型将具有更小的预测偏差。对于10倍交叉验证中的10次迭代的每一次迭代，对于该迭代期间模型拟合之外的病例计算预测偏差。结果是10个无偏偏差。通常，将这10个偏差相加产生对总数据集的模型性能(即，准确度)的概括。因为实际上10种不同的模型适合时，交叉验证不能证明特定模型的性能。相反，通过通常的建模方法产生10种模型，并且交叉验证证明了该方法的性能。从该方法得到的第11种模型将具有头10个的预测性能。使用10倍交叉验证通常导致模型的性能小于100％，但是当决策规则应用于训练组之外的样品得到的生物标记时，预期10倍交叉验证后所得性能更准确地反映该决策规则的生物学上有意义的预测准确度。
分类树分析分析该数据的一种方法是使用分类树算法，该算法研究大数据集中的模式和关系。“分类树”是使用一系列问题将特定患者分类到特定类别(例如，脓毒或者SIRS)的递归划分，这些问题被设计使得将该患者准确置于一个类别中。每个问题询问患者的条件是否满足给定预测值，每个问题被用于使用者沿着分类树下降直到可以确定该患者进入的类别。本文中，“预测值”是一系列特征的值的范围。在该实例中，特征是核酸生物标记的浓度。核酸生物标记可选自表2-10中任一个所列的那些生物标记，但是技术人员将明白其他核酸生物标记也可以用于本发明。“条件”是在个体的生物标记谱中检测特征的单一的、特定值。在该实例中，“类别名”是脓毒和SIRS。从而，分类树使用者将首先提问在该个体的生物标记谱中检测的第一种核酸生物标记浓度是否在第一个特征的预测范围的给定范围内。第一个问题的回答将在确定该个体为SIRS或者脓毒中是决定性的。另一方面，对第一个问题的回答还可以指导使用者询问在该个体的生物标记谱中检测的第二种核酸生物标记浓度是否在第二个特征的预测范围的给定范围内。再次，对该第二个问题的回答可以决定或者指导使用者进一步沿着分类树向下直到患者的分类被最终确定。
1.3.3多重累加回归树使用一种自动化的灵活的建模技术将特征的集合归类为属于两个群体之一，该技术使用多重累加回归树(MART)。MART模型使用最初偏移量，该偏移量指定应用于所有预测的常数，然后指定一系列回归树。该模型的拟合由每种树中决定点的数目指定、用于拟合的树的数目、和指定特定树怎样根本地影响MART模型的“粒度常数”指定。对于每次迭代，回归树被拟合以估计拟合标准的最陡峭的下降的方向。在该方向采取具有该粒度常数指定的长度的步骤。这样MART模型由最初的偏移量加上回归树提供的步骤组成。再次计算观察值和预测值之间的差异，并继续进行该循环，导致预测的不断完善。该过程持续预定的循环数或者直到引发停止规则。
每棵树中分枝的数目是尤其有意义的拟合参数。如果每个树仅有一个分枝，那么该模型仅考虑一个特征并且不能组合两个预测值。如果每棵树有两个分枝，那么该模型可以容纳特征之间的二路相互作用。使用三棵树，该模型可以容纳三路相互作用，等等。
使用特征和公知的类别状态(例如，脓毒或SIRS)为数据集确定预测类别状态中特征集的值。MART提供了个体特征对分类决策规则的贡献或者重要性的量度。具体地，可以检测对给定树分枝单个特征的选择时该单个特征对该决策规则的贡献程度以通过这些特征对决定最终的决策规则的重要性对这些特征排序。对同一数据集重复MART分析可以产生特征的稍微不同的排序，特别是关于对于建立决策规则较不重要的那些特征。可用于本发明的预测性特征和它们的相应生物标记的集合可以随着本文提出的那些集合而稍微改变。
MART技术的一个实现在R统计编程环境中的一个模块，或者“包”中发现(见Venables等人，Modern Applied Statistics with S，第四版(Springer，2002)；www.r-project.org)。使用R版本1.7.0和1.7.1计算该文件中的报导的结果。实现MART的模块(Greg Ridgeway编写)被称为“gbm”并且可以免费下载(见www.r-project.org)。该MART算法被修改以适于十倍交叉验证。粒度参数被设置为0.05，gbm包的内部停止规则是基于在每个标记的迭代处忽略20％的数据组。迭代的程度被设为1，因此不考虑这些特征之间的相互作用。Gbm包基于百分数估计每个特征的相对重要性，对于生物标记的所有特征，相对重要性的累积等于100％。具有最高重要性的特征占总重要性的至少90％，该具有最高重要性的特征被报告为可能具有预测值。注意到在拟合每个MART模型中停止规则为模型拟合和特征选择贡献了一个随机组分。因此，基于相同数据的多个MART建模运行可以选择稍微不同，或者可能完全不同的特征集合。这些不同的集合传达相同的预测信息；因此，所有集合都可用于本发明。预期给MART模型拟合足够的次数将产生生物标记谱内的预测特征的所有可能的集合。因此，公开的预测值的集合仅代表可用于将个体分类到群体的那些特征的集合。
使用上述MART分析从多种样品得到的核酸生物标记谱的数据。在该分析中，时间0小时脓毒群体由23名患者组成，SIRS群体由24名患者组成，而时间-24小时和时间-48小时群体分别由24名脓毒个体和21名SIRS个体组成。分析了相应于表1中所列的所有72种生物标记的特征。
对于时间0小时群体，拟合模型包括23棵树，并且该模型不允许特征间的相互作用。使用10倍交叉验证，该模型正确地分类了24名SIRS患者中的19名和23名脓毒患者中的15名，模型灵敏度为65％，特异性为79％。这些生物标记以重要性在表2中排列，该重要性通过该模型确定。排除0重要性的所有特征。用符号“-1”指出的标记随着脓毒的发展在脓毒阳性群体中以渐高的水平表达，而具有符号“1”的那些生物标记以渐低的水平表达。
表2通过MART分析得到的特征重要性时间0小时样品
对于时间-24小时群体，拟合模型包括12棵树，并且该模型不允许特征间的相互作用。使用10倍交叉验证，该模型正确地分类了21名SIRS患者中的15名和24名脓毒患者中的17名，模型灵敏度为71％，特异性为71％。这些生物标记以重要性在表3中排列，该重要性通过该模型确定。
表3通过MART分析得到的特征重要性时间-24小时样品
对于时间-48小时群体，拟合模型包括9棵树，并且该模型不允许特征间的相互作用。使用10倍交叉验证，该模型正确地分类了21名SIRS患者中的8名和24名脓毒患者中的20名，模型灵敏度为83％，特异性为38％，准确度为62％。这些生物标记以重要性在表4中排列，该重要性通过该模型确定。
表4通过MART分析得到的特征重要性时间-48小时样品
1.3.4逻辑回归分析逻辑回归分析提供来自上述分析的数据流的另一种方法。“信号强度”相当于特定核酸生物标记的浓度。给定核酸生物标记的信号的缺乏导致分配的信号强度为“0”。然后从合并的SIRS和脓毒群体的图谱得到给定核酸生物标记的信号强度的标准差(SD)。如果SIRS和脓毒群体之间信号强度没有变化(即SD＝0)，那么不进一步考虑信号强度。在回归分析前，使用本领域中熟知的方法检测信号强度。检测算法通常在Hastie等人，如前，11章中描述。
1.3.5Wilcoxon带符号的秩检验分析在再一个方法中，可以用非参数检验如Wilcoxon带符号的秩检验鉴定单个目标生物标记。生物标记谱中的特征被分配“p值”，其表示生物标记可被用于将个体分类为特定参比群体的确定性程度。通常，具有预测值的p值低于约0.05。具有低p值的生物标记可被自身用于分类个体。备选地，两种或多种生物标记的组合可用于分类个体，其中基于生物标记的相对p值选择组合。通常，对于生物标记的给定组合，优选具有更低p值的那些生物标记。也可以以这种方式用至少3、4、5、6、10、20、30或更多种生物标记的组合对个体分类。技术人员将明白任一给定生物标记的相对p-值可以根据参比群体的大小而变。
使用Wilcoxon带符号的秩检验，与具有表1中所列探针的表达阵列形成特异双链体(即，杂交)的生物标记通过与给定时间的脓毒和SIRS群体比较而被分配p值。即，p值被分配给来自从时间0小时、时间-24小时、和时间-48小时所得生物样品得到的生物标记谱的特征。这些p值分别在表5、6和7中列出。根据该分析，在时间0(表5)的脓毒和SIRS群体分别含有23和24名患者；在时间-24小时和时间-48小时(表6和7)的脓毒和SIRS群体分别含有24和21名患者。
表5特征的p值时间0小时
表6特征的p值时间-24小时
表7特征的p值时间-48小时
备选地，非参数检验(例如，Wilcoxon带符号的秩检验)可用于基于正向脓毒发展的群体中特征的渐进性出现或者消失发现特征的p值。在该检验形式中，首先检测给定特征的基线值，该检测使用脓毒和SIRS组进入研究(天1样品)时的数据。然后将脓毒和SIRS样品中特征强度与例如，-48小时样品中的特征强度比较以确定该特征强度是否从其基线值增加或者减少了。最后，将p值分配给脓毒群体和SIRS群体中特征强度与基线的不同。当检测p值中与基线的这些不同时得到了下面表8-10中所列的p值。
表8与基线不同的特征的p值时间0小时
表9与基线不同的特征的p值时间-24小时
表10与基线不同的特征的p值时间-48小时
现在参考某些代表性实施方案和细节完全描述了本发明，对本领域中技术人员显而易见的是，可以对这些本发明进行更改和修饰而不背离本文中提出的本发明的精神或范围。
权利要求
1.试剂盒，其含有选自表2-10任一个中所列的核酸群的至少两种核酸宿主应答生物标记和它们的互补序列。
2.权利要求1的试剂盒，其中该至少两种核酸宿主应答生物标记选自表2中所列的核酸群和它们的互补序列。
3.权利要求1的试剂盒，其中该至少两种核酸宿主应答生物标记选自表3中所列的核酸群和它们的互补序列。
4.权利要求1的试剂盒，其中该至少两种核酸宿主应答生物标记选自表4中所列的核酸群和它们的互补序列。
5.权利要求1的试剂盒，其中该至少两种核酸宿主应答生物标记选自表5中所列的核酸群和它们的互补序列。
6.权利要求1的试剂盒，其中该至少两种核酸宿主应答生物标记选自表6中所列的核酸群和它们的互补序列。
7.权利要求1的试剂盒，其中该至少两种核酸宿主应答生物标记选自表7中所列的核酸群和它们的互补序列。
8.权利要求1的试剂盒，其中该至少两种核酸宿主应答生物标记选自表8中所列的核酸群和它们的互补序列。
9.权利要求1的试剂盒，其中该至少两种核酸宿主应答生物标记选自表9中所列的核酸群和它们的互补序列。
10.权利要求1的试剂盒，其中该至少两种核酸宿主应答生物标记选自表10中所列的核酸群和它们的互补序列。
11.试剂盒，其含有能够与选自表2-10任一个中所列的核酸群的至少两种宿主应答生物标记杂交的至少两种寡核苷酸探针。
12.生物标记谱，其含有至少两种特征，该至少两种特征有助于以至少约60％的准确度预测个体包括在参比群体中，其中所述特征是核酸的可检测的特征，并且其中参比群体选自正常参比群体、SIRS-阳性参比群体、受感染的/SIRS-阴性参比群体、脓毒阳性参比群体、处于脓毒发展阶段的参比群体、通过常规技术在约0-36小时后证实患有脓毒的SIRS-阳性参比群体、通过常规技术在约36-60小时后证实患有脓毒的SIRS-阳性参比群体、和通过常规技术在约60-84小时后证实患有脓毒的SIRS-阳性参比群体。
13.分离宿主应答生物标记的方法，该方法包括(a)从个体的群体得到参比生物标记谱；(b)鉴定所述参比生物标记谱的特征，该特征可以预测或者诊断脓毒或者脓毒的一个阶段，其中该特征相应于一种核酸；(c)鉴定与所述特征相应的宿主应答生物标记；和(d)分离所述宿主应答生物标记。
全文摘要
脓毒的早期预测或诊断有利地允许在该疾病从最初阶段快速发展到与高死亡率有关的更严重的阶段如严重脓毒或者脓毒性休克之前实施临床干预。使用分子诊断方法实现早期预测或诊断，该方法将个体的生物标记表达谱与从一种或多种对照或者参比群体得到的图谱比较，该参比群体可以包括患脓毒的群体。认识该个体的生物标记谱中脓毒发作的特征性特征使得临床医生可以从一个时间点从个体分离的体液诊断脓毒的发作。因此，在一段时间内监视患者的必要性被避免了，有利地允许在脓毒的严重症状发作前实施临床干预。
文档编号C12Q1/70GK1829730SQ200380108646
公开日2006年9月6日 申请日期2003年11月12日 优先权日2002年11月12日
发明者R·艾维, T·根特尔, R·穆尔, M·汤斯, N·巴丘尔, R·罗森斯坦, P·戈登鲍姆, S·施, D·科珀蒂诺, J·加雷特, G·泰斯 申请人:贝克顿迪金森公司