一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法
【技术领域】
[0001]本发明属于环境对鱼体遗传毒理学评价领域，具体涉及一种检测水体中鱼类肌肉组织细胞基因损伤程度的方法。
【背景技术】
[0002]重金属是污染水体及危害鱼类食用安全性的重要因素。鱼体过多富集重金属，会导致机体的DNA损伤。检测其中鱼体DNA损伤，判断其遗传毒理对其食用安全性评价具有重要意义。彗星实验(Comet assay)又称单细胞凝胶电泳实验，是一种灵敏性高的遗传毒性研究方法，已被用作检测诸如DNA单链和双链断裂、碱性位点、不完全修复位点、DNA交联等多种类型的DNA损伤。
[0003]鲤科鱼类是中国居民的主要膳食鱼肉来源，因此，检测分析鲤科鱼肉遗传毒性程度对评价鲤科鱼肉重金属残留、膳食摄入风险、食用安全性及确保人类健康具有极其重要的应用意义。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，目的是检测鱼类食用安全性。
[0005]鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，按以下步骤实现:
[0006]一、称取鱼肌肉组织0.8mg，放入离心管中，加入400 μ L 4°C预冷的PBS，用科弯剪剪成糜状，然后用匀浆器研磨，过100目筛网，再用2mL的PBS冲洗并滤去碎组织，取400 μ L滤液，置于离心管待用，获得细胞悬液；步骤一的操作全程于O?4°C下进行；
[0007]二、彗星实验采用双层凝胶结构，双层凝胶制备好后，将载玻片放置在4°C冰箱中
0.8?1.2h，然后放入4°C预冷的新配制细胞裂解液中，4°C下避光裂解1.5h ;
[0008]三、裂解后将载玻片取出，用双蒸水冲洗，然后放入盛有4°C的新配制电泳缓冲液的水平电泳槽中静止30min，再在4°C，300mA，0.7V/cm的条件下电泳20min ；
[0009]四、电泳结束后将载玻片用去离子水冲洗3次，晾干后移去盖玻片，将载玻片用50 μ I EB染液染色15?20min，然后用双蒸水清洗，盖上盖玻片，用荧光显微镜观察彗星图像，在100倍荧光显微镜下随机选取8?12个清晰细胞核图像进行观察并用CCD拍摄彗星图像，然后计算细胞受损率或用casp软件分析图像，再使用spss统计软件分析结果，即完成鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验。
[0010]本发明优点在于具有高灵敏性，无需放射性示踪，并且这种技术只需要少量细胞，操作简单、直观、检测快速和具有良好经济性，相比试剂盒更为廉价。在评价复合污染毒性时，可充分考虑污染物之间的相互作用，是评价复合污染的有效生物监测手段。相对其他DNA损伤检测方法，节约了时间和成本，可以检测的鱼类DNA损伤，为判断是否具有毒理学安全，是否具有人体食用安全性提供依据。此外本发明还为鱼体遗传毒性进行定性、定量化评价提供支持，了解其江河水产质量、水质情况及其鱼体遗传毒理现状，可为进一步的江河流域鱼类食用安全性评价打下基础。
[0011]本发明方法利用鱼类，取其肌肉组织细胞进行彗星实验，使用casp软件可计算出细胞的TM值。当TM〉I时就可认为发生了 DNA损伤。通过视野内计数观察受损细胞所占比例数，判断DNA损伤情况。根据受损率，为该流域鱼类的毒理学安全评价提供理论基础。
【附图说明】
[0012]图1为实施例中鲤鱼肌肉彗星实验结果图；
[0013]图2为实施例中鲫鱼肌肉彗星实验结果图。
【具体实施方式】
[0014]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的任意组合。
[0015]【具体实施方式】一:本实施方式鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，按以下步骤实现:
[0016]一、称取鱼肌肉组织0.8mg，放入离心管中，加入400 μ L 4°C预冷的PBS，用科弯剪剪成糜状，然后用匀浆器研磨，过100目筛网，再用2mL的PBS冲洗并滤去碎组织，取400 μ L滤液，置于离心管待用，获得细胞悬液；步骤一的操作全程于O?4°C下进行；
[0017]二、彗星实验采用双层凝胶结构，双层凝胶制备好后，将载玻片放置在4°C冰箱中
0.8?1.2h，然后放入4°C预冷的新配制细胞裂解液中，4°C下避光裂解1.5h ;
[0018]三、裂解后将载玻片取出，用双蒸水冲洗，然后放入盛有4°C的新配制电泳缓冲液的水平电泳槽中静止30min，再在4°C，300mA，0.7V/cm的条件下电泳20min ；
[0019]四、电泳结束后将载玻片用去离子水冲洗3次，晾干后移去盖玻片，将载玻片用50 μ I EB染液染色15?20min，然后用双蒸水清洗，盖上盖玻片，用荧光显微镜观察彗星图像，在100倍荧光显微镜下随机选取8?12个清晰细胞核图像进行观察并用CCD拍摄彗星图像，然后计算细胞受损率或用casp软件分析图像，再使用spss统计软件分析结果，即完成鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验。
[0020]本实施方式中使用casp软件可计算出细胞的TM值；当TM>1时就可认为发生了DNA损伤。通过视野内计数观察受损细胞所占比例数，判断DNA损伤情况。根据受损率，为该流域鱼类的毒理学安全评价提供理论基础。
[0021]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤一中鱼肌肉取自鲤科鱼类胸腔背部、侧线与背鳍间肌肉。其它步骤及参数与【具体实施方式】一相同。
[0022]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】二不同的是:步骤一中的操作全程于2°C下进行。其它步骤及参数与【具体实施方式】一相同。
[0023]【具体实施方式】四:本实施方式与【具体实施方式】一至三之一不同的是:步骤一中PBS的浓度为0.01mol/L, pH为7.2?7。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至三之一相同。
[0024]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】一至四之一不同的是:步骤二中细胞裂解液的配制:2.5mol/L NaCU100mmol/L Na2EDTA、1mmoI/L Tris、临用前加 10% DMSO和1% Triton X-100。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至四之一相同。
[0025]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】一至五之一不同的是:步骤二中将载玻片放置在4°C冰箱中lh。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至五之一相同。
[0026]【具体实施方式】七:本实施方式与【具体实施方式】一至六之一不同的是:步骤二中双层凝胶的制备方法如下:
[0027](I)取45mg正常熔点琼脂糖溶于6mL PBS，微波炉加热使其充分溶解，制备成
0.75%正常熔点琼脂糖溶液，然后浇注到磨砂载玻片上，盖上盖玻片并于室温下贮存至琼脂糖凝固，移去盖玻片，获得第一层琼脂糖；
[0028](2)取1mg低熔点琼脂糖溶于2mL PBS，微波炉稍加热使其充分溶解，制备成
0.5%低熔点琼脂糖溶液，待温度降至35?38°C，取400 μ L细胞悬液与其混匀，然后将所得混合液加到第一层琼脂糖上，盖上盖玻片，