免疫检测的制作方法
【专利说明】免疫检测
[0001] 本发明涉及检测和/或定量抗原特异性免疫球蛋白的免疫检测领域，更具体地涉 及用于过敏病症或疾病的诊断的免疫检测。
[0002] 发明背景
[0003] 过敏疾病在过去的数十年内流行增加，在世界的较发达地区流行增加最显著。过 敏反应是对在环境中通常无害的物质的免疫应答。机体识别物质作为威胁并针对其产生不 适当的放大的反应。引起反应的物质称为过敏原，并且这些可以包括如花粉、尘螨、动物皮 肩、霉菌孢子、胶乳、药物、昆虫毒液，和食物如坚果和蛋的物质。
[0004] 过敏反应是重要的健康问题，并导致重大经济损失，因此，关键是正确的诊断和治 疗。
[0005] 患有过敏反应的个体呈现各种疾病的临床症状。这些包括：呼吸症状（如打喷嚏、 气喘和急性支气管痉挛）、心血管症状（如低血压）、皮肤症状（如肿胀和荨麻疹）、胃肠道 症状（例如，呕吐和腹泻）或全身症状（包括全身性过敏反应）。常见的过敏紊乱包括哮 喘、湿疹和枯草热。一旦在初级保健情况中的患者呈现涉及刺激和炎症的症状，则临床医生 通常进行另外的测试以确定哪种过敏原引起过敏反应。结合临床症状和针对一种或多种过 敏原的免疫球蛋白的出现得到过敏反应的诊断。
[0006] 为了对过敏反应作出诊断，临床医生可以使用皮肤点刺测试（skin-pricktest)。 使用微量的疑似过敏原点刺皮肤以观察是否有反应。如果有，围绕点刺的皮肤将肿胀并变 红和发痒，这是针对该过敏原的免疫应答的典型标志。然而，由于皮肤点刺测试最明显的是 可令人不适，并且全面测试涉及大面积皮肤，因此，皮肤点刺测试不总是理想的。此外，如果 个体具有对任意过敏原的危及生命的反应，那么不建议进行这些测试。如果个体服用了抗 组胺药或三环类抗抑郁药，那么皮肤点刺测试可能是不可靠的。
[0007] 给定物质的抗原性可以源自该物质内的许多单一抗原。抗原成分（"成分"）可 以是蛋白质、多糖或能够刺激免疫应答的含有表位的任何其他实体。例如，如果物质是尘螨 (屋尘螨（Dermatophagoidespteronyssinus)，则其含有维持有机体生命的所有分子，但其 还含有由抗原成分如Derp1和Derp2组成的过敏原部分。特别地，Derp1和Derp2 是天然尘螨提取物的主要过敏原成分。一般地，在给定提取物中的过敏原分子的部分越少， 基于提取物的检测的灵敏度就越低。
[0008] 免疫球蛋白E(IgE)是在过敏疾病中起到主要作用的一类抗体。IgE结合到过敏原 并触发可以导致炎症的来自肥大细胞的物质的释放。在易感人群中，B细胞在应答初次暴 露于过敏原时产生过敏原特异性IgE。该IgE随后在血液中循环；结合到肥大细胞，并且在 随后暴露于相同过敏原时，可以开始级联的过敏反应。因此，特定的IgE成为已确定的针对 过敏疾病的标志物。
[0009] 免疫检测可用于检测对特定过敏原具有特异性的IgE水平。这些是评价在敏化受 试者中的各种过敏原特异性IgE抗体的存在以及可能对其定量的最重要的血液试验。
[0010] 免疫检测是用于检测在给定样品中的抗原或特定的抗原特异性抗体的存在的方 法。通过在特定抗原上孵育样品可以实现对结合于抗原特异性抗体的抗原（即，免疫复合 物）的检测。随后，抗原特异性抗体的存在可以使用各种技术可视化。一般地，免疫检测 需要将抗原固定在固体支持物上。免疫检测的类型包括ELISA(酶联免疫吸附检测）和 RAST(放射过敏原吸附检测，包括来自PhadiaAB的基于荧光的ImmunoCAP?检测形式）。
[0011] 由于体外过敏反应诊断免疫检测仅需要提供血液样品，其对于个体而言更方 便，因此其用作皮肤试验的供选择的方案。然而，已在报导（Bernstein等人，Allergy Diagnostictesting:anupdatedpracticeparameter.Part2.AnnAllergyAsthma Immunol2008Mar;100(3suppl)S66-S121)中发现，血液试验的灵敏度比皮肤试验低高达 25-30 %〇
[0012]目前的针对具有可能的过敏反应的个体的血液试验的临床实践是针对样品，如血 液中的结合于物质的免疫球蛋白的存在进行广泛测试。所述物质是过敏原或抗原物质，如 花生、狗皮肩或桦树花粉。其可以作为物质的天然提取物，或从天然提取物中分离的成分出 现在免疫检测中，但两者绝不平行出现。这样的检测有助于临床医生做出"对花生过敏"或 "对桦树花粉过敏"的决定，但没有另外的信息。此外，每例过敏患者具有独特的过敏原特异 性IgE谱（profile)。如果仅使用单个成分，当特定抗原成分可能被遗漏或尚未确定时，过 敏反应会被遗漏。由于大多数物质含有至少一种抗原成分，因此过敏反应是复杂的。事实 上，已知抗原成分之间的一些交叉反应性。例如，已知来自桦树花粉的过敏原BetV1和来 自花生的过敏原Arah8是可交叉反应的，并且对这些之一具有特异性的免疫球蛋白也可 以结合于另一个。
[0013] 仅在有限的情况下使个体经受第二次血液试验，该第二次血液试验试图分析个体 具有的免疫球蛋白所针对的物质的成分。这可能是关键的，由于某些成分特异性免疫球蛋 白的存在可以表明对物质的潜在的过敏反应，而其他不能。例如，吃花生（含有Arah8) 的具有针对BetV1的IgE抗体的桦树花粉过敏患者可以由于交叉反应抗体的存在而不是 过敏反应而经历口腔发痒（口腔症状）。
[0014] 本发明试图改善针对过敏反应的免疫检测的灵敏度和质量，实际上是针对任何物 质的免疫检测。其提供用于在试验样品中定量具体免疫球蛋白水平的更灵敏的免疫检测。 在改善免疫检测的灵敏度和质量时，在试验样品中的具体免疫球蛋白的检测限也得到改 善。此外，个体可以接受更特异性的诊断，其实现对临床症状的精确管理。
[0015] 发明概沐
[0016] 本发明的目的是提供一种改进的免疫检测，其具有提高的灵敏度和质量。具体地， 本发明是一种检测和/或定量物质特异性免疫球蛋白水平的方法。本发明还涉及能够实现 这样的检测和定量的系统。该方法可以用于诊断在个体中对过敏原或过敏反应的敏化，特 别是当考虑到患者的症状时。
[0017] 更具体地，本发明的目的是提供改进的免疫检测，其提供更灵敏的诊断工具并且 其可以甚至有利地直接用于初级保健情况中。
[0018] 这些目的是通过新颖地提供每种关注的物质的多种形式来实现的。例如，关注的 物质可以源自花生。如果需要，可以包括一种以上物质，从而以多种形式提供每种测试的物 质。例如，物质作为天然提取物提供，并且一种或多种抗原成分源自该物质。作为实例，这 可以是作为一种形式的花生的天然提取物和抗原成分Arahl、Arah2和Arah5。如果 使用固体支持物，则这些离散的物质形式分别地固定在固体支持物上。因此，在免疫测定中 分别评估每种形式，并由每种形式获得不同的结果。因此，对于每种测试的物质，多种形式 产生多种结果。在有关花生的实例中，将获得4种各自的结果，针对天然提取物有一种和针 对每种成分各有一种。当分析结果时，可以组合一种或多种物质形式，例如，可以总结两种 或多种抗原成分的结果。由这些结果可以定量样品中的物质特异性免疫球蛋白的水平。如 果个体具有结合于测试的物质的特异性免疫球蛋白，则这些结果的分析系统使得临床医生 更精确地评估。对于存在于方法中的单个抗原成分（或多个抗原成分），结果将显示抗原成 分特异性免疫球蛋白的存在和/或水平。
[0019] 重要的是要注意，只有当足量的物质特异性免疫球蛋白和所述物质两者均存在于 检测中时，才可以确定体外诊断试验的阳性。具体地，如果检测中存在物质的不足或低质 量，则物质特异性免疫球蛋白将不能充分结合于所述物质，这导致差的检测性能（例如，低 灵敏度）。
[0020] 因此，在第一个方面，本发明提供了：
[0021] -种用于检测样品中物质特异性免疫球蛋白的存在或不存在的方法，所述方法包 括使所述样品与多种形式的所述物质基本上同时接触，并测定是否形成免疫复合物，其中 至少一种形式是天然提取物。
[0022] 优选的是，至少一种形式是抗原成分或抗原成分的组合。
[0023] 优选的是，所述方法可以用于定量样品中物质特异性免疫球蛋白的水平。进一步 优选的是，所述方法可以供选择地或另外地用于定量抗原成分特异性免疫球蛋白的水平。 因此，本发明的方法可以包括定量物质和/或抗原成分特异性免疫球蛋白的水平的一个或 多个步骤。
[0024] 在本发明的另一个优选的方面，所述方法可以用于实现个体中过敏反应的诊断。 个体提供用于该方法中的样品。因此，本发明的方法可以包括测定个体的敏化状态的一个 或多个步骤。供选择地或另外地，该方法可以用于测定个体的物质特异性或抗原成分特异 性免疫球蛋白的状态。
[0025] 如本文所使用，敏化是指患者之前已经暴露于物质，并且免疫球蛋白已经针对该 物质升高。进一步暴露可以导致如先前所讨论的过敏症状。
[0026] 在第二个方面，提供了用于定量样品中物质特异性免疫球蛋白水平的方法，所述 方法包括使所述样品与多种形式的所述物质接触，并测定所述免疫球蛋白对所述物质形式 的反应性水平，其中至少一种形式是天然提取物。
[0027] 在第三个方面，提供了用于提高物质的结合能力的方法，其包括选择性去除一种 或多种成分。优选的是，将所述物质制备成天然提取物。结合能力涉及物质特异性结合元 件如免疫球蛋白结合于物质的能力。所述物质（本文描述为改性的或贫化的物质）可以用 于本发明的任何方法、阵列或试剂盒中。
[0028] 在第四个方面，提供了阵列，其包括设在离散位置处的多种形式的物质，其中至少 一种形式是所述物质的天然提取物。所述阵列可以用于本发明的任何方法或试剂盒中。
[0029] 优选的是，至少一种抗原成分或抗原成分的组合作为所述物质的形式提供。因此， 1种或多种形式可以是抗原成分或抗原成分混合物。
[0030] 在第五个方面，提供了试剂盒，其包括：阵列，其包括上述的在离散位置处提供的 多种形式的物质；和一种或多种检测结合剂。
[0031] 在第六个方面，提供了测定个体的物质特异性免疫球蛋白状态的方法，其包括使 来自所述个体的样品与多种形式的所述物质基本上同时接触，其中至少一种形式是天然提 取物，并测定是否形成免疫复合物。
[0032] 在第七个方面，提供了用于诊断个体中对物质的过敏反应的方法，所述方法包括 使来自所述个体的样品与多种形式的物质基本上同时接触，其中至少一种形式是天然提取 物，并且具有一种或多种形式的免疫复合物的存在表明存在对该物质的敏化和/或过敏反 应。
[0033] 附图简沐
[0034] 图1 :图1显示来自实施例1的结果。其为显示过敏原特异性免疫球蛋白（IgE) 浓度（分类得分中的反应性）对尘螨提取物（天然提取物）、Derp1和Derp2 (两种成 分）的平均荧光信号的条形图。
[0035] 图2是显示来自实施例1的结果的另外