生物分析器件以及生物分子分析装置的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物分子分析器件、以及使用了该器件的生物分子分析装置。
【背景技术】
[0002]近年，在癌症诊断领域中，为了在早期获知癌症发病的征候，对各种癌标志物进行了研究，实用化也在推进中。癌标志物是指来自癌细胞的分泌型生物因子，随着癌的发展而增加，出现在血中、尿中。已知有例如激素、细胞因子等蛋白质、微小RNA等核酸。早期的癌中，这些癌标志物的量少，检测困难，存在表达量原本就少的癌标志物时也同样。现在，作为主流的高灵敏度的癌标志物检测方法为使用抗体的免疫测定法，已知有ELISA和称为纳米微粒检测的手法。最近，作为具有更高灵敏度的免疫测定法，开发出能以单分子检测的数码化ELISA(非专利文献I)。在对血液中的癌标志物进行检测时，受到能够从患者采集的血液量的限制，需要从其中尽量多地捕捉极微量的癌标志物进行检测。例如，在从50μ1的血浆中检测时，由于早期癌中癌标志物在10 16?10 12M的浓度范围，因此需要的是对在50 μ I中存在3000分子左右的靶标分子进行定量的检测灵敏度。由此需要能够检测低浓度的癌标志物的超高灵敏度的检测装置。
[0003]现有技术文献
[0004]非专利文献
[0005]非专利文献1:Rissin DM et al, Nature B1tecnology, Jun 28(6) ;p595 —599(2010)
【发明内容】
[0006]发明要解决的课题
[0007]本发明涉及极微量的生物分子的定量方法、以及定量用器件的结构和装置构造。通常，为了高效率捕捉漂浮在溶液中的极微量的生物分子，需要提高目标生物分子和捕捉侧的分子的碰撞频度。因此，我们考察了使用I微米以下的微小的磁微粒作为捕捉侧的分子的方法。通过使用这些微小的磁微粒，可以增大每单位粒子数的表面积，也能够提高分子运动，因此能够提高与目标生物分子的反应效率。进而，在通过荧光色素标记来进行生物分子的检测时，若磁微粒的尺寸为激发波长、发光波长的同等或以下，则能够在不妨碍荧光色素的激发和发光的状态下进行观察。因此，即使不仅捕捉了目标生物分子的磁微粒、连未实现捕捉的磁微粒全部密集地固定在平面上，也能够无损定量性地获得荧光亮点。因此，能够使全部的捕捉了生物分子的磁微粒在一定面积的基板上展开，计数生物分子数，能够对极微量的生物分子进行定量。
[0008]按照以上所述，本方式中磁微粒的粒径越小则越能够提高捕捉效率且能够固定在一定面积上的微粒数也越能够达到高密度，因此对于高灵敏度检测和高速检测更有利。但是，另一方面，小的磁微粒由于磁化率低、难以集磁，因此，在平面基板展开时，需要强磁场和更长的集磁时间。此外，已经确认了:在这样的强磁场的存在下，磁微粒沿着磁束形成念珠状的聚集体，平坦的粒子层和粒子的块混杂而形成凸凹状。该现象尤其是在磁微粒浓度高的情况下常见。当形成大的粒子块时，由于其具有超过物镜的焦点深度的高度，因此会存在部分的脱离焦点的荧光亮点，有损定量性。即使为了将脱离的荧光亮点全部拾取而赋予自动聚焦功能，也由于解析变得复杂且拍摄需要花费时间而不利于高速检测。因此，需要将高浓度的微小磁微粒以高密度均一地固定的手段。
[0009]用于解决课题的手段
[0010]使用了如下方法，S卩，将包含微小的磁微粒的溶液用润湿性高的平面基板夹持并使液厚度在上下方向尽量薄，从一个平面基板侧提供磁场吸引磁微粒。或者使用如下器件，即，在同样的润湿性高的2片平面基板之间制造一定厚度的间隙，使磁微粒流入其中后，从一个平面基板侧提供磁场，将磁微粒固定在基板上。
[0011]发明的效果
[0012]通过将溶液用润湿性高的平面基板夹持并使液厚度在上下方向尽量薄，能够使磁微粒以分散状态像膜那样均一地固定在基板面上，因此对于基板上的荧光色素能够容易地对焦，还能够防止磁微粒包裹荧光色素而屏蔽激发光的效应。
【附图说明】
[0013]图1:用于说明本实施例的一般原理的图。
[0014]图2:用于说明本实施例的器件结构和原理的图。
[0015]图3:用于说明本实施例的原理的检验方法的图。
[0016]图4:用于说明本实施例的原理的检验结果的图表。
[0017]图5:用于说明本实施例的原理的检验结果的图表。
[0018]图6:用于说明本实施例的原理的检验结果的图。
[0019]图7:用于说明本实施例的原理的检验结果的图。
[0020]图8:用于说明本实施例的器件结构的图。
[0021]图9:用于说明本实施例的抗原分子的捕捉方法和荧光标记方法的一例的图。
[0022]图10:用于说明本实施例的核酸分子的捕捉方法和荧光标记方法的一例的图。
[0023]图11:用于说明本实施例的生物分子分析装置的构造的一例的图。
【具体实施方式】
[0024]实施例中，对将解析对象即生物分子捕捉至磁微粒的方法、具有用于二维地示出该微粒的平滑的支撑基板的器件的结构、以及将该微粒导入、固定在支撑基板上并观察的步骤予以公开。作为支撑基板，只要是可良好地透磁的材质和厚度则没有限定，特别优选石英玻璃基板、硅基板等。此外，作为用于将溶液密封在支撑基板上的覆盖基板材，可以使用可透过可见光的无机玻璃、光学聚合物。支撑基板和覆盖基板均是润湿性越高越好，洗涤后的玻璃等更容易获得。但是，PDMS(聚二甲基硅氧烷)等疏水性聚合物也可以在利用02等离子体、导入羧基对表面进行亲水化处理后利用。基板的润湿性在蒸馏水的接触角为10?30°左右时是充分的，为了获得更好的效果，接触角小于10°较佳。
[0025]在支撑基板的正下方设置用于将磁微粒吸引至支撑基板的磁场发生装置。磁场发生装置具有对磁场的开放/关闭或强弱进行切换的功能是理想的。磁场发生装置可以使用电磁石、可动式的永磁石、可动式的电磁石、在支撑基板和磁石之间具有可动式的磁场屏蔽板的永磁石或电磁石。使用的磁石的磁力可以根据所使用的磁微粒而区分使用。特别是粒径为300nm以下的磁微粒的固定需要强磁场，需要以0.1T以上的表面磁束密度吸引数秒钟。但是，此时所必需的磁力也根据磁微粒的粒径或铁素体含量、溶剂、磁微粒的表面修饰而变化。
[0026]以下，将在该支撑基板上具有该覆盖基板、在这些基板间具有用于封入溶液的一定的空间、进而在支撑基板侧具有磁场发生装置的结构体称为器件。该器件按照能够对支撑基板整面进行扫描的方式设置在可动台上使用。
[0027]观察按照以下步骤进行。首先，将含有捕捉了目标生物分子的磁微粒的反应液置于支撑基板上，然后打开磁场发生装置使其产生磁场，将反应液内的全部磁微粒吸引、固定在支撑基体上，再对固定在支撑基板上的磁微粒和其上结合的经荧光标记的生物分子照射激发光并进行拍摄。通过对观察到的亮点数进行计数而求出目标生物分子浓度。
[0028]实施例中，对解析对象生物分子为抗原性蛋白质(以下称为抗原)的例子予以公开。公开了一种免疫学的分析方法，其特征在于，准备作为解析对象的抗原，使前述解析对象即抗原与结合有针对抗原的抗体的磁微粒和经荧光体标记的抗体结合，对标记的荧光体进行检测。进行捕获的磁微粒的制作方法、荧光标记的方法在实施例中有详细记载。
[0029]此外，实施例中公开了将作为解析对象的生物分子二维地展开并通过磁场固定的器件、以及搭载了器件的生物分子分析装置，该生物分子分析装置的特征在于，具有用于对前述荧光体的荧光进行测定的单元。
[0030]以下参照附图对上述以及此外的本发明的新特征和效果进行说明。在此，为了使大家彻底理解本发明而对特定实施方式进行详细说明，但本发明不受在此记载的内容的限定。
[0031]实施例1
[0032]本实施例中记载本发明的原理和检验。已知如图1所示，在通常平行配置的2片平面基板101中封入有溶液102时，当以一定的速度V沿着X方向移动上侧的平面基板101时，位于基板表面附近的流体将随之具有同程度的流速vi ( N V)，而下侧的固定的平面基板101表面的溶液102的流速则随着靠近基板表面101而减少至O。这是由于所封入的溶液102和平面基板101之间产生摩擦力的缘故，润湿性越高的平面基板101对流体的运动的影响越大。因此，如图2所示，用润湿性高的平面基板201夹持溶液202使液厚度h在上下方向尽量薄，使得溶液202几乎都存在于基板表面201附近，能够使流速最高的中央部的流速v2也受到抑制。在该状态下使磁微粒203分散在溶液中后，通过磁束密度B的磁场204在一个基板表面侧吸引磁微粒203时，虽然由于磁微粒203的移动而产生流速，但由于横向的流动受到限制，因此能够向着磁场204方向垂直地移动。此时，磁微粒203能够以分散状态像膜那样均一地固定在基板面，因此对基板上的荧光色素的对焦能够容易进行，还能防止磁微粒203包围荧光色素而屏蔽激发光的效应。
[0033]为了确认这些效果，制作了图3所示的按照在载玻片301上抬起了一条边的状态配置覆盖玻璃302的器件。通过在2片玻璃的间隙注入含有磁微粒303的溶液304、改变进行观察的χ坐标的位置，可以以I个基板观察在O?150 μπι内改变液厚度的情况。其中，覆盖玻璃302为倾斜状态，在I个