专利名称：：检测大分子和其它分析物的生物传感器的制作方法检测大分子和其它分析物的生物传感器专利案件文本0001本专利申请要求于2003年12月12日提交的美国临时专利申请号60/529,076的优先权.政府支持0002该工作由U.S.DepartmentofHealthandHumanServices/NationalInstitutesofHealth资助号CA94356支持.美国政府对本发明拥有一定权利.序列表0003下文附加序列表的纸印本及相同序列表的计算机可读形式，并在此引用作为参考.根据37C.F.R.1.821(1)，计算机可读形式中记录的信息与书面序列表一致.
背景技术：
：1.发明领域0004本发明涉及检测任何多肽、分析物、大分子复合物或其组合的试刑盒、分子信标(molecularbeacons)和方法.本发明涉及生物医学研究工具和诊断试剂盒.2.相关技术说明00051在我们的环境、食品供应、水供应和生物样品(血液、脑脊液、尿液等)中特定分子的检测、鉴定和定量可能非常复杂、昂责和耗费时间.这些方法包括气相层析、质谦分析法、DNA测序、免疫测定、基于细胞的测定、生物分子印迹和凝胶、以及无数其它多步猓化学和物理测定.0006对检测和测量生物学和环境样品中特定蛋白质水平的简便方法一直存在高度需求，检测和测量蛋白质水平是生物医学研究中最基础和最常运用的方法之一.尽管在研究和医学诊断中广泛应用基于抗体的蛋白质检测方法，但这些方法并不非常适于快速、高通量的平行蛋白质检测.0007以前，本专利发明人已经开发了检测蛋白质特定亚类即序列特异性DNA结合蛋白质(Heyduk，T.;Heyduk，E.NatureBiotechnology2002，20，笫171-176页；Heyduk，E,;KnoU，E.;Heyduk，T.Analyt.Biochem.2003，316，第1-10页；美国专利号6，S44，746和共同未决专利申请号10/062,064、PCT/US02/24822和PCT/US03/02157,在此引用作为参考)的荧光传感器方法.该方法基于将蛋白质的DNA结合位点分裂为两个DNA"半位点".得到的每个"半位点"含有短的互补单链区，所述互补单链区长度的设计在于为两个DNA"半位点"引入一些结合倾向，从而重新产生含有完整功能的蛋白质结合位点的双链体.将该倾向设计为低的，从而当蛋白质不存在时仅有小部分DNA半位点会结合.当蛋白质存在于反应混合物中时，其将仅与含有完整功能结合位点的双链体结合.该选择性结合将驱使DNA半位点的结合，且所述蛋白质依赖性的结合可用于产生报告靶蛋白质存在的光谱信号.本领域中使用术语"分子信标"描述上述测定，藉以强调在该测定中逸择性识别和报告该识别的信号的产生同时发生.已经对若干蛋白质开发了DNA结合蛋白质分子信标，显示了它们的广泛适用性(Heyduk，T.;Heyduk，E.NatureBiotechnology2002,20，笫171-176页,在此引用作为参考)已经确立了这些分子信标作用的物理机制，并将其用作检测存在与DNA结合蛋白质结合的配体的测定平台(Heyduk，E,;Knoll，E.;Heyduk，T，；Analyt.Bioch柳.2003，316，1-10;Knoll，E.;Heyduk,T.AnalytChem.2004，76，1156-1164;Heyduk，E.;Fei，Y.;Heyduk,T.CombinatorialChemistryandHigb-tfaroughputScreening2003,6，183-194,在此引用作为参考)尽管已经非常有用，但该测定局限于展示天然DNA结合活性的蛋白质.以适体(aptamers)作为"分子信标"00081为检测蛋白质开发方便、特异、灵敏的高通重测定仍然是极为重要的目标.这类测定应用于研究、药物开发及医学诊断中.识別靶蛋白质的抗体是到目前为止绝大部分蛋白质检测测定的中心.从随机序列核酸群体选择识別靶蛋白质的适体的体外方法的开发提供了笫一个真正的抗体替代方案.适体潜在的重要优点之一是，适体由易于增殖并合成的寡核苷酸組成.另外，可以使用标准核酸化学程序工程改造适体以含有报告基团(例如荧光探针).因此，将适体运用于多种形式的蛋白质检测测定中的巨大兴趣不足为奇.最有前景的路线之一是开发基于适体的、将识別靶蛋白质与产生报告该蛋白质存在的光学信号组合的传感器.0009已有若干已公开的报告证明基于适体的"分子信标"的精巧设计，其与特定靶蛋白质结合后产生荧光信号.所有这些设计依赖于适体中由靶蛋白质诱导的构象转变以产生荧光信号的变化.Yamomoto和Kumar(GenestoCells2000，5,389-396)描迷了识别HIVTat蛋白质后产生荧光增加的分子信标适体.由于荧光团-猝灭剂对接近度的改变产生荧光信号，而荧光团-猝灭剂对接近度的改变是由适体发夹和双链体形式之间由Tat蛋白质诱导的转变产生的.Hamagucbi等人(Analyt.Biochem,2001，294，126-131)描迷了识別凝血酶后产生荧光增加的分子信标适体.靶蛋白质不存在时，将该信标设计为形成使焚光团和猝灭刑紧密接近的茎环结构，该蛋白质存在时，迫使信标成为配体结合构象，从而导致荧光团和猝灭刑之间的分离增加及荧光信号的增强.Li等人(Biochem.Biopbys,Res.Commun.2002，292，31-40〉描迷了当靶蛋白质存在时从疏松的无规巻曲向紧密的单分子四元体(unimolecularquadrup，ex)转变的分子信标适体。这个由蛋白质诱导的适体构象变化导致附着到适体末端的荧光团探针之间接近度的变化，从而造成荧光信号改变.Fang等人使用类似方法(ChemBioChem.2003，4，829-834)设计识别PDGF的分子信标适体.这些例子说明了适体对于设计能够将蛋白质的存在转变为光学信号的传感器的巨大潜力.发明概述00010]发明人成功地推广了传感器设计，以大大扩展这些传感器的适用性，所迷传感器设计以前应用于检测与蛋白质结合的序列特异性多核苷酸和其它缺乏天然核酸结合活性的分析物.简而言之，通过体外选择从随机序列库中获得结合特定靶蛋白质的核酸，将所述核酸取代识別序列特异性DNA结合蛋白质的天然DNA序列.可以通过体外SELEX(通过指数富集的配体系统进化(systematicevolutionof里igandsbyexponentialenrichment))程序产生能够特异性结合缺少天然DNA结合活性的蛋白质的核酸(DNA或RNA)适体，这是充分确定的(Tuerk，C.;Gold,L.Science1990，249,505-510;Gold,L.;Polisky，B.;Uhlenbeck，O.;Yams,M.Ann.Rev.Biochem.1995，64，763-797;Wilson，D,S.;Szostak，J.W,A肌Rev,Bioch咖，1999，68，6II-647).SELEX涉及通过结合、洗去未结合序列及PCR扩增乾结合的序列的循环，从随机DNA(或RNA)序列库选择结合特异性靶的核酸序列.成功选择出与多种蛋白质和其它靶分子特异性结合的适体的众多实例(Turek1990、Polisky1995和Wilson1999)有力地指出，产生大量天然存在蛋白,质的适体是可能的.000111发明人已开发了组合物和方法，所述组合物和方法进一步使共同未决专利申请10/062，064(在此引用作为参考)中所迷基于接近度的测定能够在核酸结合因子、其配体和共调节物(coregulators)之外延伸到包括任何多肽(包括朊病毒或其它错折叠蛋白质)、分析物、小分子配体或大分子复合物.本发明涉及一组标记的适体的用途，其在各适体远尖端含有短的(优选约S-7个核苷酸)互补单链多核苷酸序列(称为"信号传导寡核苷酸(signalingoligo)").该组适体中的各个适体结合多肽或大分子复合物的特异且不同的表位，即，该組的笫一个适体结合多肽或大分子复合物的笫一个表位，而该组笫二个适体结合该多肽或大分子复合物的笫二个表位.当该多肽或大分子复合物存在时，笫一个适体结合笫一个表位，且笫二个适体结合笫二个表位，从而各适体远尖端的短互补单链多核苷酸序列可以彼此穗定结合，笫一个适体远尖端的短单链多核苷酸序列与第二个适体远尖端的短单链多核苷酸序列穗定结合后，笫一个适体上的标记被引到笫二个适体上的标记附近，从而产生可测重的信号，换言之，可以制备与任何多肽或大分子复合物结合的两个或更多个新核酸半位点，并将其用于基于接近度的测定中以检测任何多肽或大分子复合物.可以通缘柔性接头连接这组适体以形成二价适体构建体.(100012本发明的一个实施方案是包括制备第一个适体和笫二个适体的方法，所迷适体分别结合多肽或生物分子大分子复合物的笫一个表位和笫二个表位.可以使用体外选择制备适体，例如通过指数富集的配体系统进化(也称为SELEX;见Klug，S.;Famulok,M.,AHyouwantedtoknowaboutSELEX.Mol.Biol,Reports1994，20，97-107,在此引用作为参考.).另外，一个或多个先前存在的适体或天然存在的同源核睃序列可以经过修饰而在远尖端含有标记和短单链多核苷酸序列，并用于检测多肽、分析物或大分子复合物.00013在另一个实施方案中，本发明涉及包含笫一个适体构建体和笫二个适体构建体的二价适体，第一个适体构建体识別多肽或大分子复合物的笫一个表位，并含有第一个信号传导寡核苷酸，笫二个适体构建体识別多肽或大分子复合物的笫一个表位并含有笫一个信号传导寡核苷酸，其中笫一个适体构建体和笫二个适体构建体通过柔性接头连接到一起.在优选的实施方案中，出于检测目的，笫一个适体构建体含有笫一个标记，且笫二个适体构建体含有笫二个标记.000141可以预见该二价适体构建体可用于检测分子和大分子复合物之外的无数应用.可以在与抗体相同的许多途径中使用该二价适体，例如检测分子和复合物、纯化分子和复合物、封闭表位和抗原、促进生物的免疫应答(天然的和特异性的)、治疗疾病及赋予受试者被动免疫，优选的受试者为人类、农场动物或伴倡动物.000151进而可以预见该二价适体可用作治疗组合物，该治疗组合物阻断细胞或组织中分子的相互作用，或是促进细胞或组织中分子的相互作用，以在患者体内实现所需治疗结果.优选的患者包括人类、农场动物或伴佶动物.000161进而可以预见该适体构建体或二价适体构建体可以用于医学或善医诊断学或药物筛选，以帮助鉴定潜在的安全且有效的药物产物.附困简述00017]图1.检测蛋白质的分子信标的总体设计.(A)针对缺乏天然DNA结合活性的蛋白质所设计的变体.这种情况下的信标将由两个经开发识別该蛋白质两个不同表位的适体组成.(B)针对展示天然DNA结合活性的蛋白质所设计的变体，这种情况下的信标将由含有对应于蛋白质结合位卓的DNA序列的短的DNA双链体以及经开发识别该蛋白质不同表位的DNA(RNA)适体组成.00018图2.制备共适体(coaptamer)的方法，其中共适体针对(A)不同于第一个适体结合位点、或(B)不同于核酸结合位点的表位，所述核酸含有蛋白质天然结合位点.00019图3.DNA结合蛋白质分子信标(A)和基于针对蛋白质两个不同表位的适体检测该蛋白质的分子信标(B)的设计比较.00020困4.适体构建体，其含有在纤维蛋白原外部位(exosite)(60-18[29])和肝素外部位(G15D)结合凝血酶的适体.00021图5.荧光素标记的适体与凝血醉的结合.(A)通过荧光偏振检测60-1829适体(THR1)(50nM)的结合；(B)通过荧光强度变化检测G15D适体(THR2)(50nM)的结合；(C)以凝血酶对荧光素标记的G15D适体(THR2)(20nM)的定量平衡滴定.实线代表实验数据对描述适体和凝血酶之间形成1:1复合物的方程式的非线性拟合(nonlinearfh);(D)当十倍过量的未标记60-1829适体(THR3)存在时，以凝血醃对荧光素标记的G15D适体(THR2)(20nM)的定量平衡滴定.实线表示实验数据对描述适体和凝血酶之间形成1:1复合物的方程式的非线性拟合.00022图6.凝血酶适体构建体与荧光素标记的G15D适体(THR2)之间竟争结合凝血酶的图解，不存在竟争刑(A)、存在150nMTHR3(B)、存在150nMTHR4(C)及存在150nMTHR7(D)时，含有和不含有凝血酶的50nM荧光素标记的G1SD(THR2)的荧光光谦.00023图7,探测凝血酶适体构建体和荧光素标记的G15D适体(THR2)之间竟争结合凝血醉的实验概要.使用不存在和存在竟争刑(250nM)时荧光素标记的G1SD适体(THR2)(50nM)的荧光强度确定存在竟争剂时结合的THR2百分数.凝血酶浓度为75iiM*困中所示解离常数值是从独立实验计算而来的，所述实验中，使用200nM焚光素标记的G15D适体(THR2)、200nM竟争剂和ISOnM凝血酶.00024图8.60-18[29]适体(THR3)对荧光素标记的G15D适体(THR2)和THR5构建体之间竟争结合凝血睐的影响.不存在竟争刑(A)、存在1000nMTHR3和200nMTHR5(B)、存在1000nMTHR3(C)及存在200n]yiTHR5(D)时，含有和不含有凝血錄(150nM)的200nM荧光素标记的G1SD(THR2)的荧光光谱，00025困9.通过凝胶电泳迁移率变动分析检测THR7适体构建体与凝血酶的结合.将4HnMTHR7样品与各种重的凝血酶(0至833nM)温育，温育15分钟后上样于天然10%聚丙烯酰胺凝胶上.(A)以SybrGreen染色的凝胶困像.(B)对应于THIT7-凝血酶复合物的条带的强度，其是凝血酶浓度的函数.00026图10,二价凝血睐适体构建体家族，其中通过9-27个核苷酸长度的polyT接头将G15D和60-1829适体与加个碱基对的DNA双链体连接.00027，图11.通过电泳迁移率变动分析(EMSA)检测图8所示凝血醉与二价适体构建体(各33nM)的结合，星号标示出最好地说明凝血蘇优先结合构建体的条带，凝血酶与含有27和17个核苷酸的polyT接头的构建体的结合优先于含有9个核苷酸的polyT接头的构建体.凝血醉浓度在0至400nM变化.00028图12.凝血眸信标的设计，通过17个核苷酸的polyT接头将G15D和60-1829适体与9个碱基对的荧光团(或猝灭剂)标记的"信号传导"双链体连接.(A)荧光素标记的G15D构建体(THR9)和dabcyl标记的60-1829构建体(THR8)的核苷酸序列(B)凝血酶信标信号传导机制，(C)向凝血醉信标添加凝血醉后检测的荧光信号变化.作为比较，也显示不存在dabcyl标记的60-18W1构建体(THR8)时以凝血酶对荧光素标记的G15D构建体(THR9)的滴定(仅有供体的曲线).00029]图13.凝血酶信标的设计，通过接头将G15D和60-181291适体与9个减基对的荧光团(或狰灭刑)标记的"信号传导"双链体连接，其中接头含有5个间隔区18单位(Spacerl8unit)(A)荧光素标记的G1SD构建体(THR21)和dabcyl标记的60-1829构建体(THR20)的核苷酸序列.(B)凝血酶信标信号传导机制.(C)向凝血酶信标添加凝血酶后检测的荧光信号变化.作为比较，也显示不存在dabcyl标记的60-18291构建体(THR20)时以凝血醉对荧光素标记的G15D构建体(THR21)的滴定(仅有供体的曲线).插图显示在与主图数据点对应的各种凝血醉浓度所记录的荧光发射光谱.00030图14.通过凝胶电泳迁移率变动分析检测凝血醉与图13所示信标(THR20/THR21)的结合.将凝胶对荧光素发射成像(即，仅信标中THR21成分可见).00031]图15.(A)在信标的两个不同浓度检測凝血蘇的灵敏度，红色圆圈50nMTHR21和95nMTHR20,蓝色圆圈5nMTHR21和9.5nMTHR20.(B)信标对凝血酶的特异性.以凝血酶(红色圆圈)和胰蛋白酶(蓝色圃圉)滴定S0nMTHR21和95nMTHR20.00032困16.由竟争剂适体构建体造成的凝血醉信标倌号的反转(reversal)在逐渐増加的竟争刑DNA浓度測量50nMTHR21、95nMTHR20和100nM凝血酵的荧光强度.将数据作为关于起始信标与凝血醉混合物信号(Fo)的相对荧光增加作困.空心蓝正方形THR7;实心黑圃圃THR14/THR15;实心红正方形THR16/THR17;实心蓝三角形THR18/THR19;空心洋红三角形THR3;绿色实心倒三角形THR4;空心烹色三角形非特异性单链DNA,00033困17描述用于检测蛋白质的分子信标.比较(A)DNA结合蛋白质分子信标，和(B)基于针对蛋白质两个不同表位的适体检测该蛋白质的分子信标的设计.困22描述凝血酶信标灵敏度对供体-受体对的依赖.在低凝血酶浓度，使用以荧光素-dabcyl对(三角形)、荧光素-德克萨斯红对(倒三角形)和焚光素-Cy5对(圆困)标记的信标測定10nM供体标记及11nM受体标记的信标的反应.显示四个独立实验的平均数和标准差.如围5所示计算信号变化(倍数)00039困23描述凝血酶信标的重复性和穗定性.(A)在四个不同的凝血酶浓度实施信标信号的五次独立测定.所示数据代表平均数+/-标准差.(B)随时间推移在四个凝血酶浓度监控凝血酶信标信号，直至最多24小时.所示数据代表5次独立测量的平均数+/-标准差.在所述实验中使用含有SnM荧光素标记适体(THR21)和S.5nM德克萨斯红标记适体(THR2"的信标.除了没有减除緩沖液背景，如困5所示计算信号变化(倍数).00040图24显示测定凝血醉信标的Z，-因子.困中部方格显示微量培养板孔的假色困像，对应于曲线困中所示实验(上半部分孔为+凝血蘇，下半部分孔为-凝血醉).在所述实验中使用含有SnM荧光素标记适体(THIU1)和5.5nM德克萨斯红标记适体(THR27)的信标.信号代表以供体激发测量的受体对供体发射(任意单位)比，00041困2S描述在复杂混合物中检測凝血酶.(A)不存在和存在过量无关蛋白质时，凝血蘇信标在lnM凝血醉浓度的反应.所示数据为4个独立实验的平均数和标准差.(B)在掺加各种量凝血醉的HeLa提取物中检测凝血蘇.所示数据为3次独立测重的平均数和标准差.细胞提取物中的凝血酶浓度为1.88nM(浅灰色条)；3.75nM(深灰色条)；7.5nM(黑色条).单独信标混合物的信号比存在细胞提取物(未添加凝血酶)时低~25%(未显示)，这与存在细胞提取物和特异性竟争剂时观察的信号基本相同.(C)以凝血酶信标监控凝血蘇原由因子Xa催化转化为凝血醉的时间进程.(D)检测血浆中的凝血酶.所示数据为4次独立测量的平均数和标准差，使用的血浆体积(每20pl测定混合物)为0.005pl(浅灰色条)；0.015pl(深灰色条)；0,045pi(黑色条)"特异性的"指未标记的凝血酶适体竟争刑(THR7)，而"非特异性的"指30个核苷酸的随机序列DNA.困A、B和D中的信号对应于以供体激发测重的受体对供体发射比，对于单独信标混合物(困A和D)和存在细胞提取物时的信标混合物(困B),将信号对数值1标准化.困C显示粗受体荧光强度(具有供体激发).00042图26描述传感器变体.00043困27描迷图26F所示传感器设计的实验证明.(A)传感器功能的原理.(B)以浓度逐渐增加的DNA结合蛋白质滴定供体和受体标记的传感器成分的混合物时，敏化受体荧光的増加.00044图28描迷图26G所示传感器设计功能发挥的实验证明.(A)传感器功能的原理.(B)向两个供体和受体标记的传感器成分的混合物(以"-"标记的光诤)添加含有与传感器元件互补的两个不同序列元件的单链DNA后，敏化受体荧光(以"+"标记的发射光谦)的増加.00045图29描述我们的传感器设计与基于单个靶大分子识别元件的测定相比特异性增加的实验证明，00046图30描述制备困26所示传感器适体的方法.00047图31概括了选择在不同于G15D适体结合位点的表位与凝血酶结合的适体.00048图32描述功能性凝血酶传感器的证明，所述传感器含有德克萨斯红标记THR27和荧光素标记THR35或THR36，其中含有对应于困31C中克隆20^6的序列.00049图33概括了同时选择在两个不同表位与凝血酶结合的两个适体.00050图34概括了选择在不同于CRP蛋白质DNA结合位点的位点与该蛋白质结合的适体.发明详述00051除非另外定义，在此使用的所有技术和科学术语，均具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同的意义.尽管在实施或测试本发明中可以使用与此处所述方法或材料相似或等价的任何方法或材料，但在此描述优选的方法和材料.为了本发明目的，定义下列术语.00052术语"适体"指任何多核苷酸，一般是在生物化学活性、分子识別或结合属性方面具有有用的生物活性的RNA或DNA.通常，适体具有分子活性，例如在多肽的特异性表位(区域)与该多肽结合，或具有醃活性.普遍接受的是可以通过体外进化方法合成和/或鉴定在其与任何多肽的结合中特异的适体.00053短语"天然同源结合元件序列"指作为核酸结合因子结合位点的核香酸序列.该天然同源结合元件序列优选为被天然存在的核苷酸结合因子识别的天然存在的序列.00054术语"分子识别构建体"指含有"表位结合剂"、并可以作为"分子信标"的构建体.分子识別构建体也优选含有"信号传导寡核苷酸"和"标记"第一个分子识別构建体和笫二个分子识别构建体可以通过"接头"连接到一起形成"二价分子识别构建体""分子信标"指任何基于化学制剂的体系，该体系使用可测贵的读出系统作为检测方法对分析物、多肽或其它生物分子、含有生物分子的大分子复合物或生物共调节物的存在进行检测或定量.分子识别构建体或二价分子识別构建体是特异性和灵敏度改进的特定类型的分子信标.oooss术语"适体构建体"指含有适体或天然同源结合元件序列、并可以作为"分子信标"的构建体.适体构建体也优选含有"信号传导寡核苷酸"和"标记".笫一个适体构建体和笫二个适体构建体可以通过"接头"连接到一起形成"二价适体构建体"，适体构建体是分子识别构建体的亚型.适体构建体或二价适体构建体也是特异性和灵敏度改进的特定类型的分子信标.00056术语"抗体"一般指识别并且可以与抗原表位结合的多肽或蛋白质.此处所用的抗体可以是如本领域所理解的完整抗体，即，由两个重链和两个轻链组成；或者，抗体可以是完整抗体的片段，例如Fab片段或含有高变区的肽.000571术语"表位结合剂"指能够与抗原、多肽、蛋白质或大分子复合物的特异性表位结合的任何物质.表位结合剂的非限制性实例包括配体和配体片段、受体和受体片段、抗体和抗体片段、适体和其它多核苷酸、辅蘇和其它共调节物、以及变构分子和离子.优选的表位结合刑包括适体、天然同源结合元件序列、抗体及其片段.1000S81术语"表位"一般指抗原、半抗原、分子、聚合物、朊病毒、病毒体、细胞、肽、多肽、蛋白质或大分子复合物的特定区域.表位可以由从大的多肽衍生的小肽组成.表位可以是多肽、蛋白质或大分子复合物的二维或三维表面或表面特征，其包含若干非邻接肽段或氨基酸基团.00059术语"信号传导寡核苷酸"指短的(一般2至15个核苷酸、优选5至7个核苷酸长度)单链多核苷酸.优选第一个信号传导寡核苷酸序列与第二个信号传导寡核苷酸互补.优选第一个信号传导寡核苷酸序列与笫二个信号传导寡核苷酸不能通过氩鍵结合形成穗定结合，除非通过笫三方试刑的介导使笫一个和第二个信号传导寡核苷酸彼此紧密接近，000601此处所用的术语"接头"或"接头分子"指附着到适体或适体构建体上的任何聚合物.该附着可以是共价的或非共价的.预想接头可以是氨基酸或核苷酸的聚合物.优选的接头分子是柔性的，并且不干扰核酸结合因子与该组核酸成分的结合.优逸的接头分子包含12个间隔区18氨基确酸酶部分(GlenResearch,Sterling,VA),另一个优选的接头分子是polydT.00061短语"体外进化"一舦指逸择与生物分子、特别是肽或多肽结合的适体的任何方法.也将体外进化称作是"体外选择"、"SELEX"或"通过指数富集的配体系统进化".简而言之，体外进化涉及筛选随机多核苷酸库中与生物分子结合或具有特定的可选择活性的特定多核苷酸.一般而言，所述特定的多核苷酸(即适体)代表该库非常小的级分，罔此，采用一轮适体扩増(通常通过聚合睐链反应)以增加潜在有用的适体的表现度.采用连续几轮选择和扩增从而指数增加特定且有用的适体的丰度.在Famulok，M.;Szostak，J.W.,InVitroSelectionofSpecificLigandBindingNucleicAcids，Angew.Ch咖.1992,104,IOOI.(Angew.Chem.IntEd,Engl.1992，31，979-988);Famulok，M.;Szostak，J,W.，SelectionofFunctionalRNAandDNAMoleculesfromRandomizedSequences,NucleicAcidsandMolecularBiology,Vol7，F.Eckstein,D.M.J,Lilley编,SpringerVerlag，Berlin,1993,pp.271;KIug，S.;Famulok，M.，AllyouwantedtoknowaboutSELEX;Mol.Biol.Reports1994，20，97-107;及Burgstaller，P.;Fa咖lok，M.Syntheticribozy咖sandthefirstdeoxyribozyme;Angew.Chem.1995，107,1303-1306(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995，34，1189-1192)中描述了体外进化，在此引用作为参考.00062在本发明的实践中，使用体外进化产生与任何给定多肽或大分子复合物的不同表位结合的适体.针对含有目的表位的"底物"选择适体.此处所用的"底物"是含有适体可以结合的表位、并且用于选择适体的任何分子实体.00063此处所用的术语"标记"指可附着于多核苷酸、多肽、适体、核酸成分或其它底物材料的任何物质，其中底物可以通过检测方法检测，适用于本发明的标记的非限制性实例包括但是不限于发光分子、化学发光分子、荧光染料、荧光猝灭刑、有色分子、放射性同位素、闪烁体、质量标记(massivelabels)(通过质责变化而检测)、生物素、抗生物素蛋白、链審抗生物素蛋白、A蛋白、G蛋白、抗体或其片段、Grb2、聚组氡酸、Ni2+、Flag标记、myc标记、重金属、酶、碱性裤酸酶、过氧化物蘇、萤光素睐、电子供体/受体、吖夂锵酯(acridiniumesters)和比色底物，技术人员将易于识别可以在本发明的搮作中采用的上文未提及的其它有用标记.在另一个实施方案中，本发明涉及包括笫一个表位结合刑和笫二个表位结合刑的试刑盒，第一个标记附着于笫一个表位结合剂，笫二个标记附着于第二个表位结合刑，其中(a)当笫一个表位结合刑和笫二个表位结合刑标记分别与多肽的笫一个表位及该多肽的第二个表位结合时，(b)第一个标记和笫二个标记相互作用以产生可检测的信号.在优选的实施方案中，表位结合刑是包含适体、标记和信号传导寡核苷酸的适体构建体.然而，表位结合刑可以是抗体或抗体片段，该试剂盒可用于多肽、分析物或大分子复合物的检测，并同样可用于研究或医学/善医学诊断应用.00079在另一个实施方案中，本发明涉及诊断疾病的方法，其包括步骤(a)从患者获得样品，(b)将样品与笫一个表位结合刑和笫二个表位结合刑接触，和(c)使用检测方法检测样品中的多肽、分析物或大分子复合物的存在，其中样品中多肽、分析物或大分子复合物的存在指示疾病是否存在于患者中.在优选的实施方案中，(a)笫一个表位结合剂是附着有笫一个标记和笫一个信号传导寡核苷酸的笫一个适体，(b)第二个表位结合剂是附着有笫二个标记和笫二个信号传导寡核苷酸的笫二个适体，所述笫二个信号传导寡核苷酸与笫一个信号传导寡核苷酸互补，且(c)检测方法是荧光检测方法，其中，(d)当笫一个适体结合多肽且笫二个适体结合该多肽时，(e)第一个信号传导寡核普酸与笫二个信号传导寡核苷酸彼此结合，并且(f)使笫一个标记与笫二个标记接近，从而出现荧光的变化.优选的样品包括血液、尿液、腹水、细胞和组织样品/活组织检查.优选的患者包括人、农场动物和伴侣动物.000801在另一个实施方案中，本发明涉及从样品中筛选有用试刑的方法，其包括步骤(a)将样品与笫一个表位结合剂和第二个表位结合剂接触，和(b)使用检测方法检测样品中有用试剂的存在.优选的试剂包括多肽(包含笫"个表位和笫二个表位)、结合多肽的分析物(在这种情况下，该方法另外包括向筛选混合物添加多肽的步骤)和可能的治疗组合物.在优选的实施方案中，(a)笫一个表位结合刑是附着有第一个标记和笫一个信号传导寡核苷酸的笫一个适体，(b)笫二个表位结合剂是附着有第二个标记和笫二个信号传导寡核苷酸的笫二个适体，所述笫二个信号传导寡核苷酸与笫一个信号传导寡核苷酸互补，且(c)检测方法是荧光检测方法，其中，(d)当笫一个适体结合多肽且第二个适体结合该多肽时，(e)笫一个信号传导寡核苷酸与笫二个信号传导寡核苷酸彼此结合，并且(f)使笫一个标记与笫二个标记接近，从而出现荧光的变化.00081在下列实施例中描述了本发明的优选实施方案.从在此公开的本发明说明书或实践考虑，在此权利要求范围内的其它实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的.本说明书及实施例意闺仅为示例性的，本发明范围和精神在实施例后权利要求书中指出.实施例1:制备特异性适体构建体的一般方法介绍00082以下公开的是检测样品中蛋白质、蛋白质复合物或者与蛋白质结合的分析物的快速且灵敏的方法.该方法基于由蛋白质驱动的两个核酸构建体的结合，所述两个核酸构建体含有能够识别蛋白质上两个不同表位的适体(也称为"适体构建体")(困1A),这两个适体建构体也包含通过柔性接头附着于适体的短互补信号传导寡核甘酸.两个适体同时与靶蛋白质结合后，使互补寡核甘酸(也称为"信号传导寡核甘酸")相对接近，这促使其结合以形成穗定双链体.将荧光探针附着于信号传导寡核苷酸末端，提供了检测由蛋白质诱导的两个适体构建体结合的方法(困1A),在蛋白质具有天然核酸结合活性的情况下，可以用含有该蛋白质天然结合位点的核酸序列取代适体之一(图1B)"本发明的发明人已开发了检测DNA结合蛋白质的方法，所迷方法描述于Heyduk，T.和Heyduk，E.MolecularbeaconsfordetectingDNAbindingproteins.NatureBiotechnology,20,171-176,2002、Heyduk，E,，Knol里,E.，和Heyduk，T,MolecularbeaconsfordetectingDNAbindingproteins:mechanismofaction,Analyt,Biochem.316,1-10，2003、及共同未决专利申请号09/928,385(其以美国专利号6，S44，746授权)、10/062,064、PCT/US02/24822和PCT/US03/02157中，所有文献均在此引用作为参考.该方法基于将蛋白质的DNA结合位点分裂为两个DNA"半位点"(困3A).得到的每个"半位点"含有短的互补单链区，所述互补单链区长度的设计在于为两个DNA"半位点"引入一些结合倾向，从而重新产生含有完整功能性同源蛋白质结合位点的双链体，将该倾向设计为低的，从而当蛋白质不存在时将仅有小部分DNA半位点结合.当蛋白质存在于反应混合物中时，其将仅与含有完整且功能性结合位点的双链体结合.所述选择性结合将驱使DNA半位点的结合，且该蛋白质依赖性的结合可用于产生报告靶蛋白质存在的光谦或其它信号.00089科学文献中使用术语"分子信标"描述该测定，藉以强调选择性识别和报告信号的产生同时发生这一事实.已经为若干蛋白质开发了DNA结合蛋白质分子信标(Heyduk和Heyduk，2002),显示了它们的广泛适用性.已经确立了这些分子信标作用的物理机制(Heyduk，Knoll和Heyduk，2003)，并也已将其用作检测存在与DNA结合蛋白质结合的配体的测定平台(Heyduk,E.，Fei，Y.，和Heyduk,T.HomogenousfluorescenceassayforcAMP.CombinatorialCh柳stryandHigh-throughputScreening6,183-194，2003),尽管已经非常有用，但该测定局限于展示天然DNA结合活性的蛋白质.00090已经充分确定，可以通过体外选择方法产生能够特异性结合缺少天然DNA结合活性的蛋白质的核酸(DNA或RNA)适体(Ellington,A.D.，和Szostak，J.W.InvitroselectionofRNAmoleculesthatbindspecificligands.Nature346，818-822,1990;Tuerk,C.，和Gold,L.Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment:RNAligandstobacteriophageT4DNApolymerase.Science249，505-510，1990;Gold,L.，Polisky，B.，Uhlenbeck，O.和Yams,M.DiversityofOligonucleotideFunction.Ann.Rev.Biochem.64，763-797，1995;及Wilson,D,S.和Szostak，J，W.Invitroselectionoffunctionalnucleicacids.Ann.Rev.Biochem.68，611-647,1999;所有文献均在此引用作为参考).体外选择涉及通过结合、洗去未结合序列及PCR扩增把结合的序列的循环，从随机DNA序列库选择结合特异性底物靶的核酸序列.成功选择出与多种蛋白质和其它靶分子特异性结合的适体的众多实例(Ellington和S加stak，1990;Tuerk和Gold,1990;Gold等人，1995;Wilson和S加stak，1999)有力地指出，产生任何及所有蛋白质的适体是可能的.[00091在本实施例中描述了基于核酸的蛋白质检测分子信标的崭新概念，其中蛋白质不限于具有天然DNA结合活性的蛋白质.凝血酶的例子(见上文)为本发明提供了实验验证.结果与讨论00092困3B阐明了识别任何靶蛋白质的分子信标的总体概念.该设计与前面及上文所述DNA结合蛋白质的分子信标具有一些相似性(图3A).使用识别蛋白质两个不同表位的两个适体作为"半位点"的功能性等价物，而不是将含有天然蛋白质结合位点的DNA双链体分裂为两个"半位点".通过柔性接头将含有荧光团(笫一个标记)和猝灭刑(第二个标记)的短互补寡核苷酸(信号传导寡核苷酸)附着于这两个适体(困3B).靶蛋白质不存在时，由于互补信号寡核普酸太短不能促进结合，所以这两个适体构建体不结合.当靶蛋白质存在时，该蛋白质与两个适体的优先结合将驱动这两个适体构建体的结合，从而由于使第一个和笫二个标记紧密接近而导致荧光信号变化，000931选择凝血酶作为模式非DNA-结合-蛋白质体系以提供困3B所迷概念的实验验证.以前已经有两个实验室鉴定了选择性识别该蛋白质两个不同表位的DNA适体(Bock,L.C.,Griffin,L.C.，Latham,J.A.，Vermass，E.H.，和Toole,J.J.Selectionofsingle-strandedDNAmoleculesthatbindandinhibithumantbrombin，Nature3S5,564-S66，1992;及Tasset,D.M.，Kubik,M.F.，和Steiner，W.Oligonucleotideinhibitorsofhumanthrombinthatbinddistinctepitopes,J.Mol.Biol.272，688-98，1997，在此引用作为参考),显示一个适体(G15D;困4中的THR4)与肝素外部位结合，而显示其它适体(60-1829，；困4中的THR3)与纤维蛋白原外部位结合.作为开发可用于识別凝血酶的一组适体构建体的笫一个步騍，我们制备了多种适体构建体，其中上迷适体通过柔性接头共价连接(困4).这些实验的笫一个目的是确定以柔性接头连接两个适体构建体，是否将真正产生二价适体构建体，所述二价适体构建体与一组单独适体构建体相比，能够以更高的亲和力结合凝血酶.这些实验的笫二个目的是确定合适的接头长度、以及两个适体的5'和3'末端关于接头的合适定向，00094用荧光素标记单独的适体(困4中的THR1和THR2)以便于确定多种凝血醃构建体的亲和力.凝血蘇和荧光素标记的60-18P9适体(THR1)之间形成复合物可方便地继之以荧光偏振(困5A),而荧光素标记的G15D适体(THR2)结合可继之以荧光强度的变化(闺5B).两个适体均在纳摩尔浓度范围内结合凝血酶(困5A和5B).在THR2情况下，结合的定量分析(困5C)获得Ka值为6,3nM,这是比先前所提出的略高的亲和力(Bock等人，1992)，这可以通过我们使用的真正平衡结合测定对比先前使用的非平衡测定来解释，在10倍过量的未标记60-1829适体(THR3)的存在下结合THR2时(困5D)，仅观察到亲和力的微小且不显著的降低.这显示G15D和60-1829适体确实独立地与凝血酶的两个不同表位结合.00095在下一步稞中，评价困4所示多种适体构建体与THR2竟争结合凝血睐的能力.困6说明了实施这些实验的方式.记录存在和不存在凝血酶时的HR2荧光光详(田6A)凝血醉引起THR2荧光增强约50%.然后加入未标记的竟争刑适体构建体(困6B-D)凝血酶在竟争刑存在下对THR2荧光的微小作用将是有效竟争刑的特点.与困5C和D所示数据相符，THR3不是竟争剂(困6B).THR4(未标记的THFU变体)如预期能够竟争(困6C).然而，THR7(二价适体构建体之一)是比THR4好得多的竟争刑(困6D),当THR7存在于溶液中时，在凝血酶存在下没有检测到THR2荧光变化.困7显示以困4所示所有构建体进行竟争实验的概括.00096显示所有二价适体构建体比单独适体更紧密地与凝血酶结合(Kd在pM范闺内)，从而为以下预期提供了验证以柔性接头连接识别蛋白质两个不同表位的适体，将产生高亲和力凝血嗥配体.另外，这些数据显示通过舍有IO个间隔区18单位的较长接头连接两个适体，产生对凝血酶的稍好的亲和力(比较THR5与THR6的结合).同样，这些数据显示，如THR7中那样的适体关于接头的定向产生较好的亲和力(比较THR6与THR7的亲和力).因此，在所有后续实验中使用具有如THR7中适体定向的构建体.00097图8所示实验的目的是证实凝血酶的两个表位对于二价适体构建体的高亲和力结合均很重要.THR2和二价适体构建体的结合之间的直接竟争证实、由THR2(肝素外部位)识別的表位对于二价适体结合是必要的.为了证明笫二个表位也是重要的，我们比较了不存在和存在过量未标记的THR3时，二价适体构建体(THR5)与THR2竟争结合凝血醉的能力.我们预期，如果THR5的高亲和力结合需要两个凝血醃表位，则当THR3存在时，人们应当观察到THR5与THR2竟争的能力降低，这的确是在困8所示实验中观察到的.单独的THR5是非常有效的THR2竟争剂(比较图8D与8A)。THR3单独不是THR2的竟争剂(比较图8A和C).在THR3存在下，THR5是比单独的THR5较差的竟争剂(比较图8B与8C).我们因此推断二价适体构建体与凝血酶的高亲和力结合涉及笫一个和笫二个适体表位.000981)二价适体构建体-凝血酶复合物足够穗定以在天然聚丙烯酰胺凝胶电泳后仍存在(图9A).我们利用这一特征使用EMSA确定该复合物的化学计量，以观察THR孓凝血蘇复合物形成.我们以凝血酶滴定THR7，其中两种分子均为高浓度.在这种条件下，该结合是化学计量的.形成的复合物关于凝血醉与THR7比率的作图确实显示该复合物的1:1化学计量(图9B).000991)进行困10和11所示实验以测试是否可以使用二价适体构建体的备选设计来制备这些构建体.我们设计了困IO所示的二价适体构建体，从而所述jl价适体构建体完全由DNA制成，避免使用非DNA接头(在此情况下使用polydT作为接头)(图IO).这样可以为设计这种构建体潜在地提供更多柔性，并且可以降低制备适体构建体的成本.通过柔性接头末端的DNA双链体将两个适体连接到一起(图10).本发明该方面旨在模仿信号传导"信标"的设计(图3B)，其中信号传导功能涉及接头末端DNA双链体的形成，所述接头将适体与双链体连接.测试三个不同长度的polydT接头(7、17和27个核苷酸)以确定髙亲和力结合的最小接头长度要求.困11显示以凝血酶同时滴定困IO所示构建体的结果.适体构建体-凝血酶复合物形成后继之为EMSA.各构建体以高亲和力结合凝血酶.然而，与具有17和27个核苷酸接头的构建体相比，具有7个核苷酸polydT接头的构建体对凝血醉显然具有显著较低的亲和力.检查以星号标记的条带最好地说明了这一点，所述条带显示，在凝血醉的这个特定浓度，几乎所有17和27个核苷酸polydT接头构建体都被凝血酶结合，而大部分(~50%)7个核苷酸polydT构建体保持未结合，概括而言，困10和11中所示结果显示，困IO所示二价适体构建体的备选设计是可行的，并且至少17个核苷酸长的polydT接头对于构建体与凝血醉的结合更是最理想的，所述polydT接头将适体与DNA双链体连接.000100困3-11所示实验数据证明，在凝血醉及与凝血酶两个不同区域结合的两个适体的情况下，困3B所示信号传导信标发挥功能的所有必要条件均符合.基于困3-11所示实验提供的信息，我们设计并测试了凝血酶信号传导信标.困12A和B所示信标是THR16/THR17二价适体构建体的衍生物.使用17个核苷酸长的polydT接头将适体与7个核苷酸的互补寡核苷酸(信号传导寡核苷酸)连接，所迷互补寡核苷酸的5'和3'分别用荧光素和dabcyl标记.向THR8和THR9的混合物添加凝血酶，导致蛋白质依赖性的荧光强度猝灭.不存在dabcyl标记的配偶体(THR8)时，向THR9添加凝血酶后，没有观察到荧光变化.这些数据显然显示，的确观察到预期的THR8和THR9之间由凝血酶驱动的结合(如困12B所示)，并由此获得功能性凝血醉信号传导信标.000101尽管非常可重复并且特异，但由凝血蘇诱导的荧光变化的量级最初并不很大(~20%).我们因此通过用更柔性的间隔区18接头取代polydT接头以求改进凝血醉信号传导信标的这一特性(困13A和B).我们推论，polydT接头尽管是柔性的，但是也展示一些残留的刚性(Mills,J.B.，Vacano，E.，和Hagerman，P.J.Flexibilityofsingle-strandedDNA:useofgappedduplexhelicestodeterminethepersistencelengthsofpoly(dT)andpoly(dA)，J,Mol.Biol.285，245-57，1999;在此引用作为参考)，当两个适体与凝血醃结合时，所述残留的刚性可能阻止信号传导双链体的结合.困13所示倌标仅在接头性质上不同于困12所示信标.其余另外序列相同.困13C显示，向THR20和THR21的混合物添加凝血蘇后，观察到蛋白质浓度依赖性的荧光猝灭，而当凝血醃仅加入THR21时，没有检测到荧光变化，在此特定信标的情况下，该信标对凝血醉的反应要大很多(荧光降低约2倍)，该情况下的焚光信号变化程度与我们以前用检测DNA结合蛋白质的信标(见上文)所观察到的相当.我们由此推论获得了功能性凝血醉信标，且与具有polydT接头的设计相比，利用更柔性的间隔区18接头的设计在凝血酶结合后产生更好的信号变化，我们接下来实施了一系列实验以进一步表征该凝血醉信标的行为.000102实施困14所示实验，以证实当存在THR20和凝血酶时，荧光素标记的适体构建体(THR21)的确被整合到穗定的复合物中，困15显示了说明凝血酶检测的灵敏度(困15A)和凝血酶检测的特异性(困15B)的结果.因为凝血蘇与二价适体构建体的结合非常紧密(pMKd),而且由于测定似乎仅受荧光素信号检测灵敏度限制，所示可以通过改变适体构建体的浓度来控制凝血睐检测的灵敏度.这在困15中得到说明，其中使用SOnMTHR21和75nMTHR20,可以检测到约10nM的凝血酶，而当使用浓度为1/10的适体构建体时(SnMTHR21和7,5nMTHR20),可以检测到1/10浓度(约1nM)的凝血蘇.使用甚至更低的适体构建体浓度(500pMTHR21和750pMTHR22),可以检測到约100pM的凝血酶(未显示)，但是荧光素标记的适体构建体的这个低浓度接近我们仪器的灵敏度极限，而且数据质量相应降低.我们比较了适体构建体对凝血醉的反应与对胰蛋白酶的反应，以证明凝血醃检测的特异性，所迷胰蛋白酶是与凝血酶属于相同家族、并且与凝血酶共有结构同源性的蛋白酴.添加胰蛋白酶后没有检測到信号(闺15B),显示适体构建体对凝血酶的高度特异性.0001031困16显示竟争实验的结果，其中测试了多种适体构建体解离预先形成的凝血酶-适体构建体复合物的能力.所获数据显示所有二价适体构建体到目前为止都是远比任何单独的表位特异性适体更有效的竟争刑，与以荧光素标记的单独适体(见上文，THR2;闺6)进行的类似实验一致，在二价适体构建体中，THR18/THR19(具有27个核苷酸长的polydT接头的构建体)和THR16/THR17(具有17个核苷酸长的polydT接头的构建体)是最有效的竟争刑，随后为THR14/THR1S(具有7个核苷酸长的polydT接头的构建体)和THR7(具有间隔区18接头的构建体)，因此，看来尽管间隔区18接头增加的柔性对荧光信号变化的重级有益，但其也导致比含有更刚性的polydT接头的构建体略为降低的凝血醉结合亲和力，所述荧光信号变化由适体构建体信号变化产生.结论0001041我们获得了提供二价适体构建体的基本物理化学表征的数据，所述二价适体构建体含有识别凝血酶两个不同表位的两个适体.该二价构建体对凝血酶具有比该二价构建体的单独适体成分高很多的亲和力.这提示向适体"半位点"的混合物添加凝血酶应当诱导两个"半位点"的结合，从而作为使荧光团和猝灭刑紧密接近的结果，所述结合产生荧光信号.使用信标构建体的实验充分证实了这个预测.我们预期可能为大量耙蛋白质开发类似信标.我们也指出，也可以采用在此描述的信标设计来改进检测展示天然DNA结合活性的蛋白质的信标(困1A).在此情况下，可以用DNA双链体(含有蛋白质结合位点序列)取代适体"半位点"之一，所述DNA双链体通过柔性接头与信号传导互补寡核苷酸连接.实施例3:样品中的分析物检测材料000105纯化的凝血酶由Dr.RayRezaie(St.LouisUniversity)赠送，因子Xa、凝血酶原、卵清蛋白、牛血清清蛋白、SSB、胰蛋白酶和血浆均购自Sigma(St.Louis,MO).HeLa细胞提取物来自ProteinOne(CollegePark,MD).德克萨斯红曙NHS和SybrGreen来自molecularProbes(Eugene,OR)，CyS-NHS和Cy3-NHS来自AmershamBiosciences(Piscataway，NJ)，及AMCA-suIfoNHS来自Pierce(Rockford，IL).所有其它试刑均为可通过商业获得的分析级，000106在该工作中使用的寡核苷酸构建体列于表l,寡核苷酸从耶普大学KeckOligonucleotideSynthesisFacility或从IDT(CoralviHe，IA)获得.在寡核苷酸合成中使用适当的氨基礴酸酶整合5'荧光素和3'dabcyl.使用染料的NHS醋通过寡核苷酸合成后修饰将所有其它荧光团整合到m核苷酸中，所迷寡核苷酸在适当位点含有5'氨基或C6氨基-dT.如前所述(Heyduk,E.;Heyduk，T.Anal.Biochem.1997，248，216-227)通过反相HPLC纯化用荧光探针标记的寡核苷酸*通过Heyduk,E.;Heyduk，T.;Claus，P.;Wisniewski，J.R,J.Biol.Chem.1997，272，19763-19770中所迷两步法以铕整合物((Eu3+)DTPA-AMCA)修饰寡核苷酸.对荧光团在260nm的吸光度贡献校正后，从在260nm的UV吸光度计算所有寡核苷酸的浓度.表i<table>Complextableseetheoriginaldocumentpagex</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>TTHR22GOTTG。TOTGOTTGGSEQIDNO:23(间隔区")3(3ACAGTHR25GOTTOGTOTGOTTGGSEQIDNO:24(间隔区18)i、ACGACAGTHR29GAACGAGAGTOCSEQIDNO:25XXXXXMCGCATCTTHR325'荧光素AGATGCGSEQIDNO:26XXXXXTTGAACTGGACCTHR33QGTCCAOTTCAATTSEQIDNO:27OCACTCnrCGTTCTHR42GGTTGGTGTGOTTGGSEQIDNO:28XXXXXAACGACAGTHR43CTGTCGTT(间隔区18》SEQK)NO:29TTGAGTCAGCGTCGAGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTCACTGTGCTGCGGCTATHR445'荧光素CT(TCGSBQIDNO:30TT(间隔区18)sTTGAGTCAGCGTCGAQCATHR455'生物素SEQIDNO:31TAGCCGCAGCACAGTGAATHR49CACCTGATCGCTCCTCSBQIDNO:32GTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAGOATGCACAGGCACAATHR50AGCCGCCATTCCATAGSEQIDNO:33TONNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN卿CAGGATGCCGATCAGOTGTHR515,荧光素CACCTOSEQIDNO:34ATCGCTCCTCGTTHR525'生物素TTGTGCCTGSEQIDNO:351XSCATCCTOTHR535'荧光素.-AGCCGCSEQIDNO:36CATTCCATAGTGTHR545'生物素CACCTGATCSEQIDNO:37QGCATCCTG选择凝血錄适体的共适体选摔凝血蘇适体的共适体羊链DNA传感器组分单链DNA传感器组分单链DNA传感器的靶选棒凝血蘇适体的共适体选棒凝血蘇适体的构建体，其含有33个核苷酸的随机DNA序列T冊43引物lT肌43引物2同时选择两个凝血醉适体的构建体，其舍有30个核脊酸的随机DNA序列同时逸摔两个凝血酶适体的构建体，其含有30个核普酸的随机DNA序列T肌49引物lT冊49引物2T冊50引物3T冊50引物440<table>complextableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>荧光測量000107在50mMTris(pH7.5)、100mMNaCl、5mMKC1、lmMMgCl2中进行所有荧光测量.在AmincoBowmanSeries2荧光分光光度计(SpectronicInstruments,Rochester,NY)上记录荧光光谦，对緩冲液和仪器反应校正光谱，以TecanSpectraFluorPlusmicroplatereader(ResearchTrianglePark,NC)读取微量培养板中的荧光，另外，在MolecularImagerFX(BioRad，Hercules,CA)上对微量培养板成像，并且通过使用QuantityOne软件(BioRad)积分对应于单独孔困像的区域，来确定荧光强度.分别以100和20fil体积进行96孔板和384孔板中的实验，依赖于特定仪器，由于以不同仪器得到的不同緩冲液背景读数(取决于仪器的灵敏度)、以及各仪器可用的不同的激发和发射波长，记录到略为不同的信标信号变化，000108在铕螯合物-Cy5标记的信标的情况下，在实验室建立的仪器(Heyduk，T.;Heyduk，E,AnalyticalBiochemistry2001，289，60-67)上记录时间分辨的荧光，所述仪器采用脉冲氮激光器作为激发源，以激光脉冲后延迟30jis将发射积分100ps.确定凝血醉适体解离常軟的竟争測定000109测定竟争刑存在和不存在时的THR2荧光强度.凝血酶、THR2和竟争剂(存在时)的浓度分别为150nM、200nM和200nM.在这些条件下，适体与凝血蘇的结合基本是化学计量的.使用前述方法(Matlock，D.L.;Heyduk，T.Biochemistry2000，39，12274-12283)计算这些实验条件下THR2解离常数与竟争刑解离常数的比率.由电泳迁移率变动分析(EMSA)测定凝血錄适体结合000110将5微升417nM的THR7样品与各种重的凝血酶(0至833nM)温育，温育15分钟后，加入1>1130%的Ficoll，并于TBE緩冲液中在10%聚丙烯酰胺凝胶上运行样品.运行后用SybrGreen将凝胶染色30分钟，并使用MoleculaeImagerFX(BioRad)获得凝胶闺像.通过使用QuantityOne软件(BioRad)积分对应于单独条带困像的区域，来确定凝胶条带强度.基于适体的分子信标设计000111图17B说明了缺少天然序列特异性DNA结合活性的蛋白质的分子信标总体概念.该设计与发明人先前所述DNA结合蛋白质分子信标(Heyduk，T.;Heyduk,E.NatureBiotechnology2002，20,171-176;Heyduk，E.;Knoll，E,;Heyduk，T,Analyt.Bioch柳.2003,316，1-10;KnoU，E.;Heyduk,T.Analyt.Ch柳.2004,76，1156-1164;Heyduk，E.;Fei，Y.;Heyduk，T.CombinatorialChemistryandHigh-tbroughputScreening2003，6，183-194)共有一些普遍相似性(图17A),使用识别蛋白质的两个非重叠表位的两个适体作为"半位点"的功能性等价物，而不是将含有天然蛋白质结合位点的DNA双链体分裂为两个"半位点".通过柔性接头将含有荧光团和猝灭刑的短互补"信号传导"寡核苷酸附着于这两个适体(田17B).靶蛋白质不存在时，由于互补寡核苷酸太短而不能促进有效退火，所以所述两个适体"半位点"不能结合.适体"半位点"与靶蛋白质的结合使这两个"信号传导"革核苷酸相对接近而增加其局部浓度.这导致"倌号传导"寡核苷酸一退火，这使荧光团和猝灭剂紧密接近而导致荧光信号变化.二价凝血酶适体的特性0001121我们使用凝血酶作为模式系统进行困17B所示概念的"理论证据"证明.凝血酶是涉及凝血級联系统的蛋白水解酵，并且天然不结合DNA或RNA.两个实验室以前已开发了选择性识别该蛋白质两个不同表位的DNA适体(Bock，L.C.;Griffin，L.C.;Latham，J.A.;Vermass，E.H.;Toole，J.J.Nature1992，355,564-566,Tasset，D.M.;Kubik，M.F.;Steiner，W.J.Mol.Biol.1997，272，688-698)显示一个适体(G15D;THR4，表1)与肝素结合外部位结合(Bock，1992)，而显示另一个(60-18291;THR3，表l)与纤维蛋白原结合外部位结合(Tassetl997),作为开发识别凝血醉的信标的笫一个步骤，我们已制备了多种适体构建体，其中上列适体通过柔性接头共价连接.这些实验的笫一个目的是确定以柔性接头将识别蛋白质表面上两个不同表位的两个适体连接是否将产生二价适体，该二价适体能够以比单独适体更高的亲和力结合该蛋白质，这类二价适体构建体的该特性是困17B所述测定工作所必需的必要条件.因为不可能预测长的柔性接头对这些二价构建体亲和力的影响，所以有必要通过实验来解决这个问趙.这些实验的第二个目的是确定合适的接头长度及两个适体的5，和3'末端关于接头的合适定向.0001131用荧光素标记单独适体(THR1(表1),对纤维蛋白原结合外部位特异，及THR2(表l),对肝素结合外部位特异)以便于确定多种凝血醉构建体的亲和力.凝血蘇和荧光素标记的60-1829适体(THR1)之间形成复合物可以方便的继之为荧光偏振(未显示)，而荧光素标记的G15D适体(THR2)结合后可以继之为荧光强度的变化(困18A).两个适体均在纳摩尔浓度范围内结合凝血酶(未显示关于THR1和田18A的数据).在THR2的情况下，结合的定量分析(田18A)获得Kd值6.3nM.所述Kd比先前提出的略高(Bock1992，Tassetl997)，这可能是因为我们使用真正平衡结合测定而先前使用的是非平衡方法.当在IO倍过量未标记的60-1829适体(THR3)中结合THR2时(田18B)，仅观察到亲和力微小且不显著的降低(Kd为17.7nM).如前所述，这证实G1SD和60-1829适体独立地结合凝血酶的两个不同表位.0001141在下一步驟中，评价多种适体构建体与THR2竟争结合凝血酶的能力.测量存在和不存在竟争剂时添加凝血蘇后THR2荧光强度的变化，并且按照材料和方法中所述计算存在竟争剂时与凝血醃结合的THR2的量.在这些实验中所用的适体浓度下，通过荧光偏振测定检测不到适体-适体相互作用(未显示)，说明竟争数据正确地报告了THR2和竟争刑结合凝血酶的相对亲和力.THR3不是竟争剂(困18C),与困18A和B中所示数据一致.THR4(未标记的THR2变体)能够如所预期地发生竟争(困18C).在此情况下，竟争的定量分析显示THIM结合凝血酶是THR2的1.7倍，说明用荧光素标记该适体对适体与凝血錄的结合具有微小的(不显著的)负作用.显然所有二价适体构建体都是优于THR4的竟争剂(困18C).THR7似乎是最好的竟争剂，在1:1比时基本完全阻断了THR2的结合，在此情况下，竟争的定量分析揭示THR结合凝血酶的紧密性至少是THR2的65倍(估计的THR7Kd<97pM)困18C所示数据证实了预期，即以柔性接头连接识别蛋白质上两个不同表位的两个适体将产生高亲和力的凝血醉配体.另外，这些数据显示通过较长接头(含有IO个间隔区18单位与5个间隔区18)连接两个适体，产生对凝血酵稍好的亲和力(比较THR5与THR6的结合).同样，这些数据显示，如THR7中那样的适体关于接头的定向产生较好的亲和力(比较THR6与THR7的亲和力).因此，在所有后续构建体中，使用如THR7中那样的.逸体定向000115二价适体构建体(THR7)与凝血蘇之间的复合物足够稳定以在天然聚丙烯酰胺凝胶电泳后仍存在(困18D).我们利用这一观察并使用电泳迁移率变动分析(EMSA)(Fried,M.G;Cr0thers，D.M.NucleicAcidRes.1981，9，6505-6525)确定复合物的化学计量，以观察THR7-凝血醉复合物形成.我们以凝血醃滴定THR7，其中两种分子均为高浓度.在这种条件下，该结合是化学计量的.形成的复合物关于凝血酶与THR7比率的作困显示该复合物的1:1化学计量(困18D)，与以下观点一致，即两个适体(THR7组分)在THR7-凝血酶复合物中结合其各自表位.检测凝血膝的基于适体的分子信标[000116上述实验数据证明，使困17B所示信号传导信标设计成功执行的所有必要条件均符合.基于这些数振，我们设计了困19A所示凝血酶信标.使用5个间隔区18接头将凝血酶适体与7个核苷酸("nt")的互补寡核苷酸连接，所述互补寡核苷酸的5'和3'分别用荧光素和dabcyl标记.与羊独适体相比，这两种构建体的混合物结合凝血酶紧密得多(~36倍)(困18C)，这与对二价适体构建体观察到的高亲合力凝血酶结合一致，其中两个适体以柔性接头永久连接.向荧光团和猝灭刑标记的THR20和THR21的混合物添加凝血酶，导致蛋白质浓度依赖性的荧光强度猝灭(困19C).观察到的最大猝灭为约40%,不存在dabcyl标记的配偶体(THR20)时，向THR21添加凝血醉后，没有观察到荧光变化(困19C)，提示由于蛋白质诱导的信号传导寡核苷酸接近度的增加导致其退火而发生荧光猝灭，如困19B所示.在信标组分和凝血醃的纳摩尔浓度，约15分钟的温育足以产生信标的最大反应.我们也测试了与困19中所示类似的凝血酶信标，但是其中使用17个核苷酸的polydT接头取代间隔区18接头.尽管观察到凝血醉依赖性的荧光猝灭，但狰灭为含有间隔区18接头的构建体的约1/2.可能是polydT接头尽管是柔性的，但是展示一些残留的刚性(Mills,J.B.;Vacano，E.;Hagerman,P.J.J.Mol.Biol.1999，285,245-257)，当两个适体与凝血酶结合时，所述残留的刚性可能阻止信号传导双链体的结合.当以胰蛋白酶(与凝血酶结构相似的蛋白水解蘇)滴定困19所示信标时，没有观察到荧光强度的改变.我们推断获得了困17B所示设计的功能性凝血酶信标.信标性能的改进000117在接下来一组实验中，我们寻求通过使用备选供体-受体标记对改进信标的性能.以前已显示，在采用FRET作为读出的测定中，受体发射的增强提供了可能更好的信号背景比、更高的动态范围和更好的灵敏度(Heyduk，E.;Knoll，E，;Heyduk，T.Analyt.Biochem.2003，316，1-10).我们制备了一系列与困17B所示类似的凝血酶信标构建体，但是其中将多种荧光供体和荧光受体的組合整合到信号传导寡核苷酸中来取代荧光素-dabcyl对，使用用适当染料的NHS薛标记的THR21(或用适当染料的NHSBS标记的THR28)和THR27制备这些信标。困20显示信标的荧光光谦(不具有和具有凝血酶添加物)，所述信标用荧光素-德克萨斯红(困20B)、荧光素-Cy5(图20C)和Cy^Cy5(图20D)标记，在所有情况下均获得功能性信标.在各个具有荧光供体和荧光受体的信标的情况下，观察到敏化受体发射的凝血酶浓度依赖性的大增加(困20插困和图21A-D).作为比较，闺20A说明了在荧光团-猝灭刑对(荧光素-dabcyl)情况下存在凝血酶时观察到的荧光猝灭.困21E说明了以铕螯合物-Cy5供体-受体对获得的结果，所述供体-受体对使得能使用时间分辨的FRET(TR-FRET)作为检测方法(Selvin，P.R.;Rana，T.M.;Hearst,J,￡)J.Am.Ghein.Soc.1994，116，6029-6030;Sclvin，P,R;Hearst，J.E.Proc.Natl.Acad.SciUSA1994,91，10024-10028;Matthis，G.Clinic.Chem.1995,41，1391-1397)利用TR-FRET可能消除由于光散射产生的背景并促进直接激发的受体荧光从而进一步改善信标的信号背景比.困21F概括了具有多种供体和受体探针组合的信标变体的性能.困形显示与不存在蛋白质时观察到的信标背景信号相比，存在饱和浓度的凝血醉时的信号变化倍数.该比率在约2(在荧光素-dabcyl对的情况下)至约22(在铕螯合物-Cy5对的情况下)之间变化.因此，可以通过选择最佳供体-受体对和使用敏化受体发射作为信号检测模式而获得信标性能的相当大改进.具有荧光供体和荧光受体的信标变体的其它优点是，可以通过受体与供体信号比的双色测定测量其反应.这种比率表(ratkmietric)测量提供了更加抵抗非特异性作用的更稳定的信号，所述非特异性作用由样品中存在的添加刑造成的光吸收、光散射或荧光猝灭引起.以最优化的供体-受体对获得的信号背景比増加导致该信标灵敏度增加.这在困22中得到说明，困22显示三种选择的信标变体对低浓度凝血醉的反应.在荧光素-dabcyl标记的信标的情况下(存在饱和浓度的凝血醉时最低的(约2倍)信号变化)，仅可以在测试的最高凝血醃浓度(lnM)检测到统计学显著的信号变化.在用荧光素-德克萨斯红标记的信标的情况下(在饱和凝血酴浓度约S倍信号变化)，可以在较低的凝血蘇浓度(200pM)检测到统计学显著的倌号变化.在用荧光素-CyS标记的信标的情况下(在饱和凝血醉浓度约1S倍信号变化)，已经可以在最低的凝血醉浓度(S0pM)检测到统计学显著的信号变化.000118困23说明了凝血蘇信标信号极好的重复性和穗定性.以S个独立测量在4个凝血醉浓度测量倌标信号.变异系数在测定的各个蛋白质浓度都小(困23A).信标信号穗定至少24小时(困23B).000119以困17B所示的信标产生信号要求三个分子接触的同时存在各适体与蛋白质之间的两个接触以及两个互补"信号传导"寡核苷酸之间的接触.这些接触的每一个为信标-蛋白质复合物的总穗定性提供其自己的自由能贡献.由于自由能与复合物平衡解离常数之间的指数关系，所以如果缺少任何上列三个分子接触，则复合物的总穗定性将大大降低.因此预期，这里描述的分子信标应当比基于单个分子接触的测定(例如基于单个适体的测定)展示更高的蛋白质检测特异性.为了说明所述概念，我们比较了单个凝血酶适体和凝血酶信标对SSB(大肠杆菌(五.co/,')的单链DNA结合蛋白质)的反应，所述SSB是具有结合单链DNA的高度非特异性亲和力的蛋白质(数据未显示).纳摩尔浓度的SSB与单独的荧光素标记的适体(THR1，表l)产生大信号(如通过荧光偏振测定所测得的).SSB在与结合该适体所需的凝血醃浓度非常相似的浓度范围产生反应.因此，单个凝血酶适体在SSB和凝血酶之间展示非常低的分辦力.相反，凝血酶信标暴露于纳摩尔SSB浓度不产生任何显著的信标反应，而在相同浓度范围内的凝血醉产生大的信标反应.因此，凝血酶信标在SSB和凝血酶之间展示极好的分辨力，说明该信标的增强的特异性.000120在此所述测定设计的笫一个应用是均匀高通量蛋白质检测.Zhang等人(Biomol.Screening1999，4，67-73)开发了简单的统计学参数，可以使用所述参数评价测定在髙通量方式中的用途.在该蛋白质存在和不存在时从大量重复测重计算Z'-因子.Z'值为l表示理想的测定，Z'值为0.5至1表示很好的测定.Z'值低于0.5表示不是很适于高通量应用的测定.凝血酶信标Z，值为0.94(困24),这显示其将是卓越的A通量测定.检测复合物混合物中的凝血睐000121接下来的一系列实验解决了凝血醉信标的特异性及其检测细胞提取物和血浆中凝血酶的能力.信标对lnM凝血醉的反应不受100和1000倍过量的无关蛋白质影响(卵清蛋白，闺2SA).同样，100倍过量的因子Xa(另一个与凝血蘇结构相似的凝血蛋白酵)不影响信标对1nM凝血酶的反应(困25A).1000倍过量的因子Xa轻微地削弱倌标反应，但是在这些条件下仍然可容易检测1nM凝血蘇(困25A).不存在凝血酶时，最高达lfiM浓度的卵清蛋白和因子Xa对信标信号没有影响(困25A).我们推断该信标对凝血酵具有高度选择性.000122为了测试是否该信标可以检测复合物混合物中的凝血酶，我们以各种量的凝血酶掺加到HeLa细胞提取物中并测定信标对该混合物的反应(困25B).低纳摩尔浓度的凝血醉易于检测，将总共8叫蛋白质加入20pl测定，该量属于使用细胞提取物的实验的一般范围内.添加细胞提取物后观察到的信号可以通过添加特异性竟争刑(未标记的凝血酶适体)而完全消除，证实在细胞提取物中观察到的信号是由于凝血睐.在以细胞提取物进行工作时，我们遇到的一个困难是细胞提取物中存在的核酸醉降解寡核苷酸(测定成分).我们测试了多种缓冲液添加刑以发现凝血酶信标在细胞提取物存在下在足够长的时期保持穗定的条件.我们发现，添加高浓度的随机序列30个碱基对双链DNA(l矽fiM)、高浓度的20个核普酸随机序列单链DNA(0.1jtM)和2.5mMEGTA,在细胞提取物存在下保护凝血酶信标免于降解，而不显著影响该信标对凝血蘇的反应。在上列添加刑存在下获得田25B所示数据.000123由于凝血酶是血浆蛋白质，所以我们确定了是否该可以使用该信标检测血浆中的该蛋白质.血浆中所有凝血酶以其前体凝血酵原的形式存在，所迷凝血醉原经闳子Xa蛋白水解加工转化为凝血酵.尽管与凝血酶相比灵敏度大大降低(>20倍)(数据未显示)，但凝血酶信标识别凝血酶原.困25C所示实验充分说明这一点，所迷实验中，作为时间的函数监控凝血醃原存在时的信标的敏化受体发射.在箭标标记的点将因子Xa加入混合物，启动凝血酶原向凝血酶的转化.所述转化导致时间依赖性的信标信号增加，这与该信标对凝血酶高很多的灵敏度一致.因此，为了检測血浆中的凝血酶，将因子Xa包括于测定混合物中(困25D)加入的血浆量增加导致信标信号的成比例增加(困2SD).仅当测定中存在因子Xa时，添加血浆引起信标反应.添加血浆后观察到的信号可以通过添加特异性竟争刑(未标记的凝血醉适体)而完全消除，证实在细胞提取物中观察到的信号是由于凝血酶.20W反应体积中，5nL血浆样品引起可测量的信标反应.总而言之，困25所示实验证实了凝血醉信标检测复杂生物混合物中蛋白质的功能性.讨论000124此处所迷基于适体的分子信标设计是我们以前开发的分子信标的推广，所迷分子倌标用于检测序列特异性DNA结合蛋白质(闺17).在此提出的以凝血酶作为模式蛋白质的实验为该设计的可行性提供了理论根据.我们相信该设计将具有若干重要的优势.由于在此所述的分子信标设计不限于任何特异性蛋白质，其将可普遍应用于很多蛋白质，我们的信标在靶蛋白质存在下的信号传导，要求两个不同适体协同识别该蛋白质的两个羊独表位，这将引起该信标的特异性增强和亲和力(即检测灵敏度)增加.两个适体的这种协同行为，也将使得能够使用具有适度亲和力的适体以产生以高亲和力和特异性结合靶蛋白质的分子信标.适体(信标組分)在其结构上不要求任何加工来修整其构象分布以允许蛋白质存在时不同状态之间的"转换".这类加工可以依赖于该适体的特定序列(结构)，且这种核酸构象改变的能力学平辨不一定是微不足道的问趙.由于目前信标设计中的信号传导元件("信号传导"寡核苷酸)与其适体组分分离，所以任何适体序列(及结构)应当与我们的信标设计一致.添加"信号传导"寡核苷酸同样未必将对适体(信标组分)的亲和力和特异性产生不利影响，因此，任何蛋白质(可能为其获得识別该蛋白质两个不同表位的两个适体)将是根据困17方案开发分子信标的良好靶.000125可以相对简单地获得识别该蛋白质不同表位的抗体.类似地，没有理由不能为许多靶蛋白质开发识别不同表位的适体，而且已经提供了若干实例(Jayasena，S.D.ClinicalChem.1999，45，1628-1650).有几种可能的途径实现该目标.笫一条途径使用分离结合和未结合蛋白质的核酸的不同方法进行体外选择(SELEX),这里的基本原理是，在不同的区分方法中，可以优先展示蛋白质的不同区域，从而导致适体被引导至该蛋白质表面的不同区域.选择的凝血酶适体是这类途径的实例(Bock，1992;Tasset，1997).笫二条途径可以是产生对应于靶蛋白质分子不同区域的肽的适体.有实验证据显示可以使用这种策略开发能够识別完整蛋白质的适体，用作开发适体的把的肽源自所迷蛋白质(Wei，X.;Ellington,A.D.Proc.NatL.Acad.Sci.USA1996，93，747S-7480)这种途径已被广泛用于产生识别蛋白质的抗体.也可以通过两步连续SELEX产生识別蛋白质不同表位的两个适体，所述两步连续SELEX中，笫二步涉及在第一步所选适体的饱和浓度存在下选择适体.我们确认了所述使用凝血酵作为棋式体系的程序(Heyduk，E.和Heyduk，T.，未发表)，最后，我们开发了全新的体外选择策略，以产生经过特定设计以在我们的分子信标设计中起作用的适体对(Heyduk，E"Kalucka，J"Kinnear，B"Knoll，E"和Heyduk，T.，未发表).因此，可利用多种路线获得识别蛋白质非重叠表位的适体对.实施例4:传感器设计变化000126本分子信标的多种变化可应用于本发明的实践中，困26中描述了这些传感器设计的变体，并在此概括(见上文).经证实，困26F所示传感器设计有效地检测DNA结合蛋白质.向供体和受体标记的传感器组分的混合物滴定cAMP反应元件结合蛋白质(CRP)(DNA结合蛋白质的实例)后，伴随敏化受体荧光强度增加(困27).000127在困28中证实了田26G所示传感器设计，图A描迷了传感器功能的原理.向两个供体和受体标记的传感器组分的混合物添加单链DNA后，伴随着敏化受体荧光强度的增加(困28,B，带+号的线)，所述单链DNA含有与传感器元件互补的两个不同序列元件.在此特定情况下的传感器含有德克萨斯红标记的THR29和THR32,0001281通过实验证实了本分子信标传感器设计与基于单靶大分子识别元件的测定相比增加的特异性(困29),传感器识别靶分子包括三个分子接触的同时存在，所述分子接触的每一个为该复合物的总穗定性提供自由能(AG)贡献.由于自由能与复合物平衡解离常数之间的指数关系，所以如果缺少任何上列三个分子接触，则导致分子识別高特异性的复合物总穗定性将大大降低.纳摩尔浓度的非特异性单链DNA结合蛋白质("SSB")与单个荧光素标记的适体(THR1,表l)产生大信号(如通过荧光偏振测定所测得的).SSB在与凝血醉结合该适体所需浓度非常相似的浓度范围内产生反应.因此，单个凝血酶适体在SSB和凝血酶之间展示非常低的分辨力.(困B)凝血醃传感器(THR21(荧光素标记的)和德克萨斯红标记的THR27的混合物)暴露于纳摩尔SSB浓度，不产生任何显著的信标反应(虚线)，而凝血酶在相同浓度范闺内产生大的信标反应.(困C).因此，凝血酶信标在SSB和凝血酶之间表现出极好的分辨力，说明该信标的增强的特异性.制备变体传感器适体的方法000129图30概括了选择可用于实施本发明的适体的方法，困A描述了在与第一个适体结合的蛋白质存在下选择第二个适体.信号传导寡核苷酸位于含随机序列构建体的5'末端，且互补信号传导寡核苷酸通过长的柔性接头附着于笫一个适体，使用该型随机DNA(或RNA)构建体选择共适体，将向能够在不同于笫一个适体表位的位点结合蛋白质、并且将在困26A所示传感器中起作用的适体偏倚l0001301困B中描述了备选情况，该困描述同时逸择与蛋白质两个不同表位结合的两个适体.条(在引物l和引物4末端)表示含随机序列的适体构建体5'末端和3'末端的短互补序列.使用这类随机DNA(或RNA)构建体选择适体，将向能同时在蛋白质两个不同表位结合该蛋白质、并且将在困26A所示传感器中起作用的适体偏倚，0001311在另一个备选实施方案中，可以在与双链DNA结合的蛋白质存在下选择第二个适体(困30,困C).条表示与信号传导寡核苷酸互补的短序列.(在含随机序列的构建体的5'末端)，所述信号传导寡核苷酸通过长的柔性接头附着于双链DNA.使用这类随机DNA(或RNA)构建体选择共适体将向能够在不同于蛋白质的双链DNA结合位点的位点结合该蛋白质、并且将在困17B所示传感器中起作用的适体偏倚.0001321在另一个备选实施方案中，可以在与抗体结合的蛋白质的存在下选择笫二个适体，所述蛋白质在该蛋白质的不同表位与抗体结合(困30,困D).条表示与信号传导寡核苷酸互补的短序列(在舍有随机序列的构建体的5'末端)，所述信号传导寡核苷酸通过长的柔性接头附着于该抗体，使用这类随机DNA(或RNA)构建体选择共适体将向能在不同于抗体表位的位点结合该蛋白质、并且将在困17C所示传感器中起作用的适体偏倚.000133在过量含G15D适体的构建体(THR22)存在下，使用SELEX程序，从含有33个核苷酸随机序列的构建体(THR11)开始，选择在不同于G15D适体结合位点的表位结合凝血酶的适体(困31,困A).困B描述所示各轮选择后获得的单链DNA的凝血醉结合活性.可测量的凝血酶结合活性在笫4轮选择后出现，并且在笫12轮选择后达到最大值.在过量THR22存在下测量结合.克隆笫12轮选择后获得的DNA，并且对从单独克隆获得的DNA进行测序.困C描述了单独克隆的序列比对(使用ClustalX),显示从四个独立选择实验获得的克隆.使用下列适体构建体对与含随机序列的构建体进行这些选择THR22和THR11;THR25和THR11;THR42和THR11;THR43和THRU.若干高度保守序列家族在田C中显而易见.000134困32中描述了功能性凝血酶传感器，其包含德克萨斯红标记的THR27和荧光素标记的THR3S或THR36,所述THR27和THR35或THR36含有对应于田31C克隆20-26的序列.THR35与THR36区别在于克隆20-26序列側翼DNA序列长度.显示含有20nM(困A)或100nM(围B)所示凝血酶传感器及所示凝血酶浓度的微量培养板孔的荧光困像(敏化受体发射).作为比较，显示包含THR21和THR27的传感器.0001351困33概括了同时选择在两个不同表位结合凝血酶的两个适体.使用SELEX程序，从两个含有30个核苷酸随机序列的构建体(THR49和THR50)开始选择适体(困A).困B显示所示各轮选择后获得的单链D^fA混合物的凝血酶结合活性.可测量的凝血酶结合活性在笫6轮选择后出现，并且在笫"轮选择后达到最大值，克隆笫14轮选择后获得的DNA，并且将从单独克隆获得的DNA进行测序.田C描述了克隆的序列比对(使用ClustalX)若干高度保守序列家族显而易见.0001361为cAMP反应元件结合蛋白("CRP")开发基于适体的分子信标.选择适体以在不同于该蛋白质的DNA结合位点的位点结合，在过量含CRP结合位点的构建体(与MIS11杂交的MIS10X3)存在下，使用SELEX程序，从含有33个核苷酸随机序列的构建体(MIS12)开始进行选择(困34,困A)困34，困B中描迷了所示各轮选择后获得的单链DNA的CRP结合活性，可测量的CRP结合活性在笫6轮选择后出现，并且在第12轮选择后达到最大值.在过量与MIS11杂交的MIS10X3存在下测量结合.克隆笫l2轮选择后获得的DNA，并且将从单独克隆获得的DNA进行测序.困C描述了克隆的序列比对(使用ClustalX).可以确定约16个核苷酸的保守核心序列.权利要求1.检测样品中多肽的方法，其包括步骤(a)将样品与第一个适体构建体和第二个适体构建体接触，及(b)通过检测方法检测第一个适体构建体、第二个适体构建体及多肽的结合；其中(c)第一个适体构建体能够结合多肽的第一个表位，且第二个适体构建体能够结合该多肽的第二个表位，(d)第一个适体构建体包含(i)能够结合第一个表位的第一个适体、(ii)第一个信号传导寡核苷酸和(iii)第一个标记，以及(e)第二个适体构建体包含(iv)能够结合第二个表位的第二个适体、(v)与第一个信号传导寡核苷酸互补的第二个信号传导寡核苷酸和(vi)第二个标记。2.权利要求1的方法，其中所述第一个和笫二个信号传导寡核苷酸各由至少S个核苷酸且不多于7个核苷酸組成.3.权利要求1的方法，其中所述笫一个适体包含天然同源结合元件序列，且使用体外进化选择第二个适体.4.权利要求1的方法，其中所述第一个标记是荧光供体，且所述第二个标记是荧光受体.5.权利要求1的方法，其中所述第一个标记是荧光受体，且所述笫二个标记是荧光供体.6.权利要求l的方法，其中所述检测方法检测荧光变化，7.权利要求21的方法，其中所述检测方法是FRET.8.权利要求1的方法，其中使用体外进化选择第一个适体和第二个适体.9.权利要求1的方法，其中所述多肽不天然结合天然同源结合元件序列，10.权利要求9的方法，其中所迷多肽是凝血醉.11.权利要求10的方法，其中所述笫一个适体结合凝血酶的纤維蛋白原外部位且笫二个适体结合凝血酶的纤维蛋白原外部位.12.权利要求ll的方法，其中所述笫一个标记是荧光素.13.权利要求12的方法，其中所述检测方法是荧光偏振.14.权利要求12的方法，其中所述笫二个标记是dabcyl，且所述检测方法是检测荧光素荧光强度的变化.15.权利要求l的方法，其中所述笫一个适体构建体和笫二个适体构建体通过接头连接在一起.16.权利要求l的方法，其中所述接头是柔性的间隔区18接头.17.检测样品中分析物的方法，其包括步稞(a)将样品与笫一个适体构建体、笫二个适体构建体及多肽接触，及(b)通过检测方法检测笫一个适体构建体、笫二个适体构建体、多肽及分析物的结合；其中(c)在分析物存在下，笫一个适体构建体能够结合多肽的笫一个表位，且笫二个适体构建体能够结合该多肽的笫二个表位，及(d)笫一个适体构建体包舍能够结合笫一个表位的笫一个适体、第一个信号传导寡核苷酸和笫一个标记，以及(e)笫二个适体构建体包含能够结合笫二个表位的笫二个适体、与笫一个信号传导寡核苷酸互补的笫二个信号传导寡核苷酸和笫二个标记.18.权利要求17的方法，其中所述笫一个信号传导寡核苷酸和笫二个信号传导寡核苷酸各由至少5个核苷酸且不多于7个核苷酸组成.19.权利要求17的方法，其中所述笫一个适体包含天然同源结合元件序列，且使用体外进化选择第二个适体.20.权利要求17的方法，其中所述笫一个标记是荧光供体，且所述笫二个标记是荧光受体.21.权利要求17的方法，所述第二个标记是荧光供体.22.权利要求17的方法，23.权利要求22的方法，24.权利要求17的方法，第二个适体.25.权利要求17的方法，合元件序列.26.权利要求17^方法，象变化.27.权利要求26的方法，合该药物.28.权利要求27的方法，肽是HMG-CoA还原酶.其中所述第一个标记是荧光受体，且其中所述检测方法检测荧光变化.其中所述检测方法是FRET.其中使用体外进化选择笫一个适体和其中所迷多肽不天然结合天然同源结其中所述多肽在结合分析物后经历构其中所述分析物是葯物且该多肽能结其中所迷分析物是抑制素药物且该多29.权利要求17的方法，其中所迷分析物是见于环境中的毒素.30.权利要求17的方法，其中所述笫一个适体构建体和笫二个适体构建体通过接头连接到一起.31.权利要求30的方法，其中所述接头是柔性的间隔区18接头.32.制备包含笫一个和第二个适体构建体的一组适体构建体的方法，其包括步錄(a)选择针对笫一个底物的笫一个适体，所述笫一个底物包含第一个表位，以及选择针对笫二个底物的笫二个适体，所述笫二个底物包含笫二个表位，其中笫一个适体能结合笫一个表位且笫二个适体能结合第二个表位，(b)将笫一个标记附着于笫一个适体并将第二个标记附着于笫二个适体，(c)将笫一个信号传导寡核苷酸附着于笫一个适体并将笫二个信号传导寡核苷酸附着于笫二个适体，其中所述笫二个信号传导寡核苷酸与第一个信号传导寡核苷酸互补，及(d)从而(i)笫一个适体构建体包含笫一个适体、笫一个标记和第一个信号传导寡核苷酸，及(ii)笫二个适体构建体包含笫二个适体、笫二个标记和笫二个信号传导寡核苷酸.33.权利要求32的方法，其中所述笫一个底物是多肽，且所述笫二个底物是与笫一个适体结合的多肽，其中笫一个适体遮蔽笫一个表位.34.权利要求32的方法，其中所述第一个底物是多肽或大分子复合物，且所迷笫二个底物是与笫一个适体结合的多肽或大分子复合物，其中笫一个适体(a)附着于笫一个信号传导寡核苷酸或笫一个标记，且(b)遮蔽笫一个表位.35.权利要求32的方法，其中所述笫一个底物是基本由笫一个表位组成的多肽片段，、且所述笫二个底物是基本由第二个表位组成的多肽片段.36.权利要求32的方法，其中所述笫一个倌号传导寡核苷酸和笫二个信号传导寡核苷酸各由至少5个核苷酸且不多于7个核苷酸組成.37.权利要求32的方法，其中所迷笫一个适体包含天然同源结合元件序列，且使用体外进化选择第二个适体.38.权利要求32的方法，其中所述第一个标记是荧光供体，且所迷笫二个标记是荧光受体.39.权利要求32的方法，其中所述笫一个标记是荧光受体，且所迷笫二个标记是荧光供体.40.权利要求32的方法，其中使用体外进化选择笫一个适体和笫二个适体.41.权利要求32的方法，其包括以柔性接头将笫一个适体构建体与第二个适体构建体连接的步稞.42.二价适体构建体，其包含笫一个适体、笫一个标记、笫一个信号传导寡核苷酸、笫二个适体、笫二个标记、笫二个信号传导寡核苷酸和接头，其中笫一个适体能结合笫一个表位且笫二个适体能结合第二个表位.43.权利要求42的二价适体构建体，其中所述笫一个表位和笫二个表位是相同多肽的不同且非重叠表位.44.权利要求42的二价适体构建体，其中所述接头是柔性接头.45.权利要求44的二价适体构建体，其中所迷接头是间隔区18.46.权利要求44的二价适体构建体，其中所述接头是脱氣胸苷聚合物.47.权利要求42的二价适体构建体，其中所述笫一个标记是荧光供体.48.权利要求47的二价适体构建体，其中所述笫二个标记是荧光受体.49.权利要求42的二价适体构建体，其中所述第一个和第二个信号传导寡核苷酸长度至少为5个核苷酸且长度不多于7个核苷酸，50.权利要求42的二价适体构建体，其中所述笫一个适体包含天然同源结合元件序列.51.权利要求50的二价适体构建体，其中使用体外进化选择笫二个适体.52.权利要求42的二价适体构建体，其中使用体外进化选择笫一个适体，53.权利要求42的二价适体构建体，其中所述多肽是凝血酶，所述笫一个标记是荧光素，所述笫二个标记是dabcyl,所述笫一个表位是肝素外部位，所述第二个表位是纤维蛋白原外部位，且所述接头是间隔区18,54.权利要求43的二价适体构建体，其中所述多肽是凝血酶，所述笫一个标记是荧光素，所述笫二个标记是dabcyl,所述笫一个表位是肝素外部位，所述笫二个表位是纤维蛋白原外部位，且所迷接头是间隔区18.55.试剂盒，其包括附着有笫一个标记的笫一个表位结合刑和附着有笫二个标记的笫二个表位结合刑，其中(a)当笫一个表位结合刑和第二个表位结合刑标记分別结合多肽的笫一个表位及该多肽的笫二个表位时，(b)笫一个标记和笫二个标记相互作用以产生可检測的信号.56.权利要求55的试刑盒，其中所述笫一个表位结合刑是抗体，57.权利要求SS的试剂盒，其中所述笫一个表位结合剂是笫一个适体构建体，所述适体构建体包含笫一个适体、笫一个标记和笫一个信号传导寡核苷酸.58.权利要求57的试剂盒，其中所述笫二个表位结合剂是笫二个适体构建体，所述适体构建体包含第二个标记和与笫一个信号传导寡核苷酸互补的笫二个信号传导寡核苷酸.59.权利要求S8的试剂盒，其中所述第一个信号传导寡核苷酸和笫二个信号传导寡核苷酸长度至少为5个核苷酸且长度不多于7个核苷酸.60.权利要求58的试剂盒，其中所迷第一个适体包含天然同源结合元件序列.61.权利要求S8的试剂盒，其中使用体外进化选择笫二个适体.62.权利要求55的试剂盒，其中所述笫一个标记是荧光供体，且所迷第二个标记是荧光受体.63.权利要求62的试刑盒，其中所迷第一个标记是荧光素，且所述笫二个标记是dabcyl.64.权利要求55的试刑盒，另外包括多肽，其中多肽能结合分析物.65.权利要求5S的试刑盒，另外包括一套使用所述试剂盒的印刷说明书.66.诊断疾病的方法，其包括步稞(a)从患者获得样品，(b)将该样品与笫一个表位结合剂和笫二个表位结合刑接触，并(c)使用检测方法检测样品中多肽的存在，其中样品中存在多肽指示患者中是否存在疾病.67.权利要求66的方法，其中(a)第一个表位结合剂是附着有第一个标记和笫一个倌号传导寡核苷酸的第一个适体，(b)笫二个表位结合剂是附着有第二个标记和笫二个信号传导寡核苷酸的笫二个适体，所述笫二个信号传导寡核苷酸与笫一个信号传导寡核苷酸互补，及(c)检测方法是荧光检测方法，其中，(d)当笫一个适体结合多肽且第二个适体结合该多肽时，(e)笫一个信号传导寡核苷酸和笫二个信号传导寡核苷酸彼此结合，且(f)使笫一个标记与笫二个标记接近从而发生荧光变化.68.权利要求66的方法，其中所迷样品选自血液、尿液、腹水和组织样品.69.权利要求66的方法，其中所述患者是人，70.诊断疾病的方法，其包括步稞(a)从患者获得样品，(b)将该样品与笫一个表位结合剂、第二个表位结合剂以及多肽接触，所述多肽包含笫一个表位和第二个表位，并且(c)使用检测方法检测样品中能够结合该多肽的分析物的存在，其中分析物的存在指示患者中是否存在疾病.71.权利要求70的方法，其中(a)笫一个表位结合剂是附着有笫一个标记和笫一个倌号传导寡核苷酸的笫一个适体，(b)笫二个表位结合剂是附着有第二个标记和笫二个信号传导寡核苷酸的第二个适体，所述笫二个信号传导寡核苷酸与笫一个信号传导寡核苷酸互补，及(c)检测方法是焚光检测方法，其中，(d)当分析物结合多肽时，(e)笫一个适体结合该多肽且笫二个适体结合该多肽，且(e)笫一个信号传导寡核苷酸和笫二个信号传导寡核苷酸彼此结合，且(f)使笫一个标记与笫二个标记接近从而发生荧光变化.72.权利要求70的方法，其中所述样品选自血液、尿液、腹水和组织样品.73.权利要求70的方法，其中所述患者是人.74.从样品中筛选有用试刑的方法，其包括步稞(a)将该样品与笫一个表位结合刑和笫二个表位结合刑接触，并且(b)使用检测方法检測样品中有用试刑的存在.75.权利要求74的方法，其中所述有用试刑是包含第一个表位和笫二个表位的多肽，76.权利要求74的方法，另外包括将样品与多肽接触的步骤，所迷多肽能够结合分析物，其中所迷有用试刑为分析物.77.权利要求74的方法，其中所述有用试刑为可能的治疗组合物.78.权利要求74的方法，其中(a)第一个表位结合刑是附着有第一个标记和笫一个信号传导寡核苷酸的笫一个适体，(b)笫二个表位结合刑是附着有笫二个标记和笫二个信号传导寡核苷酸的笫二个适体，所迷笫二个信号传导寡核苷酸与第一个信号传导寡核苷酸互补，及(c)检测方法是荧光检测方法，其中，(d)当第一个适体结合多肽且笫二个适体结合该多肽时，(e)笫一个信号传导寡核苷酸和笫二个信号传导寡核苷酸彼此结合，且(f)使第一个标记与笫二个标记接近从而发生荧光变化.79.权利要求78的方法，其中所述有用试刑是包含笫一个表位和笫二个表位的多肽.80.权利要求78的方法，另外包括将样品与多肽接触的步骤，所述多肽能够结合分析物，其中有用试刑为分析物.81.权利要求78的方法，其中所迷有用试刑为可能的治疗組合物.82.药物組合物，其包括权利要求"-54中任一项中提出的二价适体构建体.83.促进样品中分子相互作用的方法，其包括步壤向样品施用权利要求42-54中任一项中提出的二价适体，并使第一个表位和笫二个表位密切接近以影响分子相互作用，其中第一个表位和笫二个表位在单独的分子实体上.84.权利要求83的方法，其中所述样品选自细胞、组织、脑脊液、血液、体外反应混合物和环境系统.85.检测样品中多肽的方法，其包括步稞(a)将样品与笫一个分子识别构建体和笫二个分子识别构建体接触，并且(b)通过检测方法检测笫一个分子识別构建体、笫二个分子识别构建体及多肽的结合；其中(c)笫一个分子识别构建体能结合该多肽的笫一个表位，且笫二个分子识別构建体能结合该多肽的笫二个表位，(d)笫一个分子识別构建体包含(i)能结合笫一个表位的笫一个表位结合刑、(ii)笫一个信号传导寡核苷酸和(m)第一个标记，且(e)笫二个分子识別构建体包含(iv)能结合第二个表位的第二个表位结合刑、(v)与笫一个倌号传导寡核苷酸互补的笫二个信号传导寡核苷酸和(vi)笫二个标记.86.权利要求8S的方法，其中所述笫一个表位结合刑是适体.87.权利要求86的方法，其中所述第二个表位结合刑是适体.88.权利要求86的方法，其中所迷笫二个表位结合刑是抗体.89.权利要求86的方法，其中所述笫二个表位结合刑是含有多肽结合位点的双链多核苷酸，90.权利要求8S的方法，其中所述第一个表位结合刑是抗体.91.权利要求90的方法，其中所述笫二个表位结合刑是第二个抗体.92.权利要求卯的方法，其中所述第二个表位结合刑是含有多肽结合位点的双链多核苷酸.93.权利要求8S的方法，其中所述笫一个表位结合剂是含有多肽笫一个结合位点的双链多核苷酸.94.权利要求93的方法，其中所述第二个表位结合刑是含有多肽笫二个结合位点的双链多核苷酸，95.权利要求85至94中任一項的方法，其中所述检测方法逸自等离子体共振、荧光共振能量转移("FRET")、FCCS、荧光猝灭、荧光偏振、产生有色产物、化学发光、闪烁现象、生物发光和发光共振能量转移.96.权利要求95的方法，其中所迷检测方法是发光共振能童转移.97.权利要求85至96中任一项的方法，其中所述多肽是凝血酶或cAMP反应元件结合蛋白质("CRP")98.权利要求85至97中任一项的方法，其中所迷样品选自血液、尿液、腹水、细胞样品和组织样品.99.分子信标，其包括第一个分子识別构建体和笫二个分子识别构建体；其中(a)笫一个分子识别构建体能结合多肽的笫一个表位，且笫二个分子识别构建体能结合该多肽的笫二个表位，(b)笫一个分子识别构建体包含(i)能结合笫一个表位的笫一个表位结合刑、(ii)笫一个信号传导寡核苷酸和(iii)笫一个标记，及(c)第二个分子识别枸建体包含(iv)能结合笫二个表位的笫二个表位结合剂、(v)与第一个信号传导寡核苷酸互补的第二个信号传导寡核苷酸和(vi)第二个标记.100.权利要求99的分子信标，其中所述笫一个表位结合刑是适体，101.权利要求100的方法，其中所述笫二个表位结合剂是适体.102.权利要求100的方法，其中所述笫二个表位结合刑是抗体.103.权利要求100的方法，其中所述笫二个表位结合刑是含有多肽结合位点的双链多核苷酸.104.权利要求99的方法，其中所述笫一个表位结合剂是抗体.105.权利要求104的方法，其中所述笫二个表位结合剂是笫二个抗体，106.权利要求10《的方法，其中所述笫二个表位结合剂是含有多肽结合位点的双链多核苷酸.107.权利要求99的方法，其中所述第一个表位结合刑是含有多肽第一个结合位点的双链多核苷酸.108.权利要求107的方法，其中所述笫二个表位结合剂是含有多肽笫二个结合位点的双链多核苷酸.全文摘要所述内容为可以使用一组共适体构建体用于鉴定和定量任何多肽或大分子复合物的组合物和方法。构建结合大分子构建体的多肽的独特表位的适体构建体。这些适体构建体含有表位结合位点、共适体结合位点和可检测标记。在同源多肽、分析物-多肽复合物或其它大分子复合物的存在下，共适体彼此结合以产生可检测的信号。共适体构建体可以通过接头连接以产生二价适体构建体。文档编号C12Q1/68GK101208437SQ200480036874公开日2008年6月25日申请日期2004年12月10日优先权日2003年12月12日发明者E·克诺尔,E·黑杜克,T·黑杜克申请人:圣路易斯大学