需氧病原体的稳定敏感性测试的制作方法

专利名称：需氧病原体的稳定敏感性测试的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物学领域，且详细来说涉及用于测定需氧病原体对抗生素敏感性的组合物和方法。本发明的组合物和方法尤其适用于敏感性测试，包括四环素家族抗生素的敏感性测试，且尤其是涉及经7和9取代的四环素的敏感性测试，且最尤其是涉及替加环素(tigecycline)(TGC)的敏感性测试。
背景技术：
在开发抗生素期间，必须建立敏感性测试的质量控制(QC)范围(National Committeefor Clinical Laboratory Standards，2003.Methods for Dilution Antimicrobial SusceptibilityTests for Bacteria That Grow Aerobically；Approved StandardsM7-A6，第6版，第23卷，National Committee for Clinical Laboratory Standards Wayne，PA.，National Committee forClinical Laboratory Standards 2003.Methods for Dilution Antimicrobial Disk SusceptibilityTests；Approved StandardsM2-A8，第8版，第20卷.National Committee for ClinicalLaboratory Standards，Wayne，PA.)，其随后被临床微生物实验室利用以确定患者测试结果是否有效。使用由美国临床实验室标准委员会(National Committee for ClinicalLaboratory Standards)(NCCLS)所推荐的选定板的生物体对每种抗生素确定并随后定义这些QC范围。
通过一个称作M23研究的过程建立所述QC范围，所述过程涉及通过多个实验室使用不同批次和制造商的培养基进行多天测试来测试(National Committee for ClinicalLaboratory Standards 2003.Development of In Vitro Susceptibility Testing Criteria andQuality Control Parameters；Approved GuidelineM23-A2，第2版，第18卷.NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards，Wayne，PA.)。替加环素是一种目前临床开发中的甘氨酰四环素(glycylcycline)抗生素，并且是一种具有抵抗易感及多药物抗性生物体的等量活性的广谱抗生素(Sum，P.E.和P.Petersen，Bioorganic and MedicinalChemistry Letters 9，1459-1462，1999)。作为广谱抗菌剂的替加环素具有抵抗许多革兰氏(gram)阳性和革兰氏阴性临床相关病原体的有效活性，所述病原体包括抗性病原体，例如产生MRSA、VRE、PRSP和ESBL的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(Biedenbach D.J.，M.L.Beach和R.N.Jones，Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 40173-177，2001；Cercenado，E.，S.Cercenado，J.A.Gomez和E.Bouza，J.Antimicrob.Chemother.52138-139，2003；Milatovic，D.，F.-J.Schmitz，J.Verhoef和A.C.Fluit，Antimicrob.AgentsChemother.47400-404，2003；以及Petersen，P.J.，N.V.Jacobus，W.J.Weiss，P.E.Sum和R.T.Testa，Antimicrob.Agents Chemother.43738-744，1999)。在当对替加环素进行测试时获得美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)质量控制生物体的一致质量控制范围的研究期间，获得不一致的MIC(最低抑制浓度)值。
本发明概述了对ATCC质量控制生物体提供稳定、一致的敏感性测试值的新颖方法和组合物。
从本发明的下列摘要和描述并且从权利要求书可显而易见本发明的这些和其他实施例以及特征。

发明内容
在开发替加环素期间，进行了一些研究以建立用于最低抑制浓度(MIC)测试的QC范围。在第一项研究中，在预临床开发所涉及的年间，对所推荐的QC生物体的每一者建立预备QC范围。随着替加环素的开发进入第2阶段的临床研究，进行控制充分的NCCLS M23研究。第二项研究(第一M23研究)的结果显示QC范围比先前5年预临床经验期间所建立的范围低二分之一。遵循第一M23研究，接受已建立的QC范围。然而，研究实验室经验和进行微生物学测试用于临床试验的临床微生物实验室经验均具有QC的变化，其中替加环素因为MIC极高而常常超出范围。随后进行第二M23研究。将第二M23研究的结果与研究实验室和临床实验室经验所建立的QC极限进行比较。这些QC极限对于进行替加环素工作的那些研究人员来说变为可接受值。某些实验室进一步注意到当对QC生物体进行测试时，替加环素的MIC仍然不同并且产生超出范围的低值。这些值对应于由第一M23研究所建立的较低范围。
进一步注意到新鲜的Mueller Hinton肉汤(MHB)中所测定的替加环素MIC与老化MHB中所测定的MIC存在差异。当在新鲜的(＜1周)Mueller Hinton肉汤(MHB)中进行微肉汤(microbroth)稀释MIC测试时，MIC结果对应于所描述的第一M23研究中所发现的较低范围。本发明的一优选实施例为当在肉汤微稀释测试中测试替加环素时，培养基为新鲜制备且不超过12小时，并且当形成滴定板时不存在佐剂。然而，如果MHB老化(＞1周)，那么MIC结果与所描述的第二M23研究中的较高结果相关。当使用预制备培养基时(通常＞1周)，未观测到可变性，且可变性与第二M23研究相似。
因此，在技术中需要一种当对替加环素进行测试时，对ATCC质量控制生物体提供标准敏感性测试结果的有效方法。
本发明为所述技术提供当使用Mueller-Hinton II肉汤(MHB)培养基时，对替加环素提供标准MIC值的新颖方法和组合物。
替加环素是一种甘氨酰四环素，且来自于四环素家族并且在7和9位置具有取代基。替加环素进一步称为GAR-936。
本文所描述的本发明概述了新颖方法和组合物，其中可以表征细菌对抗生素的敏感性。这些方法和组合物增强抗生素(尤其是四环素抗生素)的效力。
在控制抗生素MIC值的可变性的努力中，发明者吃惊地且出乎意料地发现向培养基中加入佐剂使所测定的MIC标准化。发明者进一步吃惊地且出乎意料地发现向培养基中加入佐剂抑制早期峰的形成，并且使所测定的MIC标准化。
详细来说，为了控制MIC值的可变性，发明者进一步发现加入来源于例如大肠埃希氏菌(Escherichia coli)(E.coli)的微生物细胞质膜的佐剂使所测定的MIC标准化，所述佐剂充当氧气净化剂或还原剂。
本发明的一个实施例为提供对ATCC质量控制生物体提供敏感性测试结果的标准、一致值的培养基组合物。
本发明的另一个实施例为提供当对四环素进行测试时，对ATCC质量控制生物体提供敏感性测试结果的标准、一致值的培养基组合物。
本发明的另一个实施例为提供当对经7和9取代的四环素进行测试时，对ATCC质量控制生物体提供敏感性测试结果的标准、一致值的培养基组合物。
本发明的另一个实施例为提供当对替加环素进行测试时，对ATCC质量控制生物体提供敏感性测试结果的标准、一致值的培养基组合物。
广泛方面来说，本发明的方法和相关组合物提供对四环素，并且尤其是对在7和9位置经取代的四环素，且特别是对替加环素的标准敏感性测试结果。
已发现含有新替加环素(TGC)的组合物。当测试时，本发明组合物对ATCC质量控制生物体提供标准敏感性测试结果。
提供包含替加环素、培养基和佐剂作为组份的组合物。当测试时，本组合物对ATCC质量控制生物体提供标准敏感性测试结果。
本发明进一步包含用于测定微生物敏感性的套组，所述套组包含密封或与培养基和佐剂接近的一种或一种以上抗生素。
在各种条件下，使用NCCLS程序通过肉汤微稀释测定TGC的MIC。将MHB在2℃、室温下无氧储存，并且加入Oxyrase以测定各种条件的影响。用杀菌时间动力学证实用肉汤微稀释液所观测到的老化与新鲜培养基结果间的MIC差异。
当在新鲜制备的培养基中测试时，与用粉末商业制备和老化(7天)培养基(MIC分别为0.03-0.12和0.12-0.25μg/ml)相比，2至3倍稀释的TGC对参照菌株更具活性。在测试之前储存在无氧条件下的老化培养基与新鲜的培养基相似(MIC 0.03-0.12μg/ml)。加入Oxyrase导致与新鲜培养基相似的MIC(MIC 0.06-0.25μg/ml)。当在新鲜与老化培养基中测试TGC时，杀菌时间动力学证明活力生长有显著(＞3log10)差异(图1)。
本文所揭示及所主张的本发明提供这些和其他实施例。


图1展示新鲜和老化Mueller-Hinton肉汤中替加环素(TGC)抵抗大肠埃希氏菌ATCC 25922的抗菌活性。
图2展示向培养基中加入Oxyrase的HPLC分析和早期峰形成的抑制。
图3展示向新鲜和老化培养基中加入Oxyrase的HPLC分析和早期峰形成的抑制。
图4展示早期峰的质子核磁共振谱。
具体实施例方式
在以下描述中，利用了医药学技术中所使用的许多术语和活体外敏感性测试。为了清楚并一致地理解包括对所述术语所给范畴在内的说明书和权利要求书，提供下列定义。
佐剂意谓增强医学治疗效力的物质，并且进一步意谓自身可能具有或不具有抗菌活性但与足量抗生素组合用于稳定和增强敏感性测试的物质。佐剂包括选自以下各物质的群组的那些物质半胱氨酸、巯基乙酸盐、抗坏血酸、丙酮酸盐和触酶。本文所描述的方法和组合物包括使用来源于例如大肠埃希氏菌的微生物的细胞质膜的佐剂，所述佐剂用作稳定剂。OXYRASE是由Oxyrase，Mansfield，OH 44901销售的微生物(例如大肠埃希氏菌)的细胞质膜的商标，其在本文中进一步称为Oxyrase或Oxyrase酶系统。Osyrase也称为生物催化氧还原剂。此外，为氧还原剂并且为那些来源于微生物(例如含有氧气净化膜片段的大肠埃希氏菌)的细胞质膜的物质的佐剂可单独使用或与其他佐剂组合使用。
佐剂作用意谓在佐剂存在下，所选抗生素的效力增加。此作用可通过培养微生物来展示，诸如(例如)在有和没有佐剂的情况下于有效含量的一种或一种以上抗生素存在下能够生长的传染剂或临床分离株，或其可行的提取物。存在佐剂增加抗生素，特别是四环素家族抗生素，且尤其是经7和9取代的四环素，且特别是替加环素的效力。可以定性或定量的术语描述细菌生长。定量结果的一实例可以简单地指示可以由肉眼真实确定的生长或无生长。如所述技术所了解，定量结果的一实例可以比较在培养基中的天数与生长指数。生长指数的实例包括简单等级符号(例如“-、+-、1+、2+、3+和4+”)和数字标记(例如0至999)，例如由BACTEC 12B培养系统所产生的符号和标记(BectonDickinson，Cockeysville，Md.，USA)。佐剂作用的显著方面在于微生物的生长特征存在可观察的改变，所述改变自身揭示于本发明敏感性测试的内容中。
佐剂敏感性测试意谓在活体外检验中组合使用佐剂与四环素抗生素以用于建立微生物的抗生素敏感性图案的目的。在佐剂敏感性测试中，将含有微生物(例如，微生物的同源群体或微生物的类型/变体/分离株等的混合物)的样品暴露于包含抗生素、佐剂和培养基的组合物中，并且基于样品中微生物的生活力测定样品中微生物对所述抗生素的敏感性。佐剂敏感性测试是本发明方法的一个实施例。所述敏感性测试可以在如所述技术已知的包括Mueller-Hinton琼脂或Mueller-Hinton肉汤的标准固体或肉汤培养基中或者在其他等效培养基中完成。所述培养基形式必须补充有如本文所讨论的以适当组合形式且适当浓度的适当抗生素与佐剂。敏感性测试的目的在于测定对四环素，且尤其是对经7和9取代的四环素，并且进一步特别是对替加环素的抗菌敏感性。
如所述技术中所了解，敏感性微生物意谓微生物以使得所述临床分离株或传染剂无感受态、无感染性或无活力的方式受抗生素有害地影响(Yao，J.D.C.等人，InMurray，P.R.等人编辑，Manual of Clinical Microbiology，ASM Press，Washington，D.C.(2003)第1039-1073页)。
如本文所使用的敏感与敏感性同义。当确定例如临床分离株或传染剂的微生物对所给抗生素敏感时，所述抗生素被说成具有抵抗所述分离株或传染剂的活性，或对所述分离株或传染剂呈活性。
敏感性测试意谓活体外检验，其中如技术中所了解，测定例如临床分离株或传染剂的微生物对一系列抗菌化合物(尤其是四环素，包括经7和9取代的四环素并且特别是替加环素)的敏感性(Jorgensen，J.H.等人，InMurray，P.R等人编辑的Manual of ClinicalMicrobiology，ASM Press，Washington，D.C.(2003)第1102-1107页；Jorgensen，J.H.等人，InMurray，P.R.等人编辑的Manual of Clinical Microbiology，ASM Press，Washington，D.C.(2003)第1108-1127页)。(National Committee for Clinical Laboratory Standards，2003.Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically；Approved StandardsM7-A6，第6版，第23卷，National Committee for Clinical LaboratoryStandards Wayne，PA.，National Committee for Clinical Laboratory Standards 2003.Methodsfor Dilution Antimicrobial Disk Susceptibility Tests；Approved StandardsM2-A8，第8版，第20卷.National Committee for Clinical Laboratory Standards，Wayne，PA.)。本文所描述的敏感性测试的目标为更精确地测定包括经7和9取代的四环素的四环素抗生素，且特别是替加环素的抗菌敏感性测试结果。
如所述技术中所了解，抗生素意谓所述技术所已知的对传染剂的生活力、完整性、传染性或感受态具有有害影响的化合物的任一者(参看Yao等人，InMurray，P.R.等人编辑的Manual of Clinical Microbiology，ASM Press，Washington，D.C.(2003)第1039-1073页和Inderlied，C.B.等人，InMurray，P.R.等人编辑的Manual of ClinicalMicrobiology，ASM Press，Washington，D.C.(2003)第1149-1177页)。(Kucers，A.等人，The Use of Antibiotics第4增刊J.B.Lippincott Co.Philadelphia，Pa.(1987)；和Lorian，V.编辑的Antibiotics in Laboratory Medicine第2增刊，Williams & Wilkins，Baltimore，Md.)。详细来说，一类重要的抗生素是四环素，包括经7和9取代的四环素，且特别是替加环素。术语抗生素与如本文所用的抗菌剂、治疗剂或药物同义。所有抗生素都是药物或治疗剂，但不是所有药物或治疗剂都是抗生素。
如本文所使用的四环素或者尤其是四环素家族抗生素意谓如所述技术所了解的具有氢稠四苯结构作为核的抗生素(Yao，J.D.C.等人，InMurray，P.R.等人编辑，Manual ofClinical Microbiology，ASM.Press，Washington，D.C.(2003)第1051-1052页)。(Kucers，A.等人，The Use of Antibiotics第4增刊J.B.Lippincott Co.Philadelphia，Pa.(1987)第979-1044页)，并且尤其是经7和9取代的四环素和甘氨酰四环素。适用于本发明方法的四环素的实例包括(但不限于)四环素、氯四环素、氧四环素、二甲基氯四环素、去甲金霉素、甲烯土霉素(methacycline)、赖氨四环素(lymecycline)、氯莫环素(clomocycline)、脱氧土霉素(doxycycline)和米诺环素(minocycline)适用于本发明方法的甘氨酰四环素的实例包括(但不限于)N，N-二甲基甘氨酰基酰氨基9-氨基米诺环素(DMG-Mino)、N，N-二甲基甘氨酰基酰氨基9氨基-6-脱甲基-6-脱氧四环素(DMG-DMDOT)和替加环素。相当期望具有与上文指定的四环素或甘氨酰四环素化合物的任一者同源的化学结构的四环素和甘氨酰四环素亦可用于本发明的方法。
临床分离株意谓引起感染的细菌剂的纯化菌株，所述临床分离株来源于受所述传染剂感染的患者。一种或一种以上临床分离株可来源于相同患者，或者相同的分离株可来源于不同患者，例如医院发作期间所见(Pittet等人，Archives of Internal Medicine1551177-1184，(1995))。所述临床分离株通常由样本处理和培养方法的组合来纯化。同样地，这些临床分离株有活力，并且因此可用于关于活体外检验(例如敏感性测试)中的抗生素敏感性作进一步分析和测试。用于纯化这些临床分离株的程序包括所述技术中所已知的方法和程序，尤其是那些由Kent，P.T.等人，″Public Health MycobacteriologyAGuide for the Level III Laboratory″，U.S.Department of Health and Human Service，Centersfor Disease Control，Atlanta，Ga.(1985)第31-70页所描述且用于分离分枝杆菌(Mycobacterium)的方法和程序或由Pfyffer，G.E.等人，InMurray，P.R.等人编辑的Manual of Clinical Microbiology，ASM Press，Washington，D.C.(2003)第532-559页))和Brown，J.M.等人，InMurray，P.R.等人编辑的Manual of Clinical Microbiology，ASMPress，Washington，D.C.(2003)第502-531页))所概述的用于分离诺卡氏菌属(Nocardiaspp.)的方法和由Funke，G.等人，InMurray，P.R.等人编辑的Manual of ClinicalMicrobiology，ASM Press，Washington，D.C.(2003)第472-501页))所概述的用于分离棒状杆菌(Coryneform)革兰氏阳性杆状病毒的方法。
如所述技术所了解，传染剂意指传染微生物，尤其是传染细菌。根据本发明方法，尤其相关的传染剂包括那些引起疾病的传染剂(Isenberg，H.D.等人，InMurray，P.R.等人编辑的Manual of Clinical Microbiology，ASM Press，Washington，D.C.1995第5-18页)。据说具有由所述传染剂引起的疾病的人类或动物患者具有由所述传染剂引发的传染，或者将受所述传染剂传染。据说引起疾病的传染物为致病性。据说通常不为致病性的细菌与患者正常细菌丛的部分为共生体。在一些情形下，例如当患者免疫功能不全(immune compromise)或受到免疫抑制时(例如，受HIV感染，或者具有AIDS复合体，或者在经历器官移植之后)，所述共生微生物可引起传染。患者可感染一种或一种以上传染剂。
最低抑制浓度(MIC)是肉眼所探测的完全抑制生物体在微滴定孔中生长的抗菌剂的最低浓度(National Committee for Clinical Laboratory Standards，2003.Methods forDilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically；ApprovedStandardsM7-A6，第6版，第23卷，National Committee for Clinical Laboratory StandardsWayne，PA.)。
将含有微生物的样品暴露于本发明的组合物意在混合微生物与组合物，或者另外提供微生物与组合物之间的接触。
因此，在本发明的最广泛实施例中，本发明涉及一种用于表征微生物对抗菌化合物的敏感性的方法。在另一个实施例中，受测试的微生物是传染剂或临床分离株。在另一个实施例中，待测试的微生物是从采集自被怀疑受非所需细菌感染或处于受非所需细菌感染风险下或被鉴定为受非所需细菌感染的患者的样品中获得。本发明的敏感性测试在本文中称为佐剂敏感性测试。所述敏感性测试的结果表现存在于样品中的受调查微生物(例如临床分离株或传染剂)关于本文所描述的佐剂作用的特征。也就是说，本发明的佐剂敏感性测试鉴定存在于样品中的微生物是否对受测试抗生素具敏感性。优选地，由于本发明的佐剂敏感性测试的结果，抗生素，且尤其是包括经7和9取代的四环素的四环素且特别是替加环素被鉴定为对存在于样品中的微生物具敏感性。然而，同样重要的是，由于本发明的敏感性测试的结果，其中抗生素，尤其是与佐剂组合的四环素被鉴定为对存在于样品中的微生物具敏感性。
本发明进一步涉及一种用于稳定ATCC质量控制生物体的敏感性测试结果的液体或固体培养基组合物。已经发现向培养基中加入来源于例如大肠埃希氏菌的微生物的细胞质膜的佐剂使ATCC质量控制生物体的敏感性测试结果稳定。尽管不受理论限制，但是将氧还原剂用作佐剂减小了培养基中的含氧量，并且使(尤其是)ATCC质量控制生物体的敏感性测试结果稳定。详细来说，如HPLC所测定，加入氧还原剂作为佐剂抑制早期峰的形成。
培养基组合物包含营养培养基、佐剂和精选的抗生素。所述佐剂视情况可以是氧还原剂，包括Oxyrase。其他佐剂是选自以下各物质的群组半胱氨酸、巯基乙酸盐、抗坏血酸、丙酮酸盐和触酶，其范围为培养基组合物的约0.0005％至约5.0％重量/体积[下文称为w/v]，优选地范围为约0.005％至约0.5％(w/v)，并且最优选地范围为约0.05％(w/v)。
已经发现包括佐剂作为氧还原剂，且尤其是作为氧还原剂(例如来源于例如大肠埃希氏菌的微生物的细胞质膜的那些佐剂)使得当对(尤其是)经7和9取代的四环素进行测试时对ATCC质量控制微生物所测定的敏感性测试结果标准化。当所述佐剂来源于例如大肠埃希氏菌的微生物的细胞质膜，且尤其是Oxyrase时，所述佐剂范围为培养基组合物的约0.5％至约10.0％体积/体积[下文称为v/v])，优选地为约1.0％至约4.0％(v/v)，并且最优选地为约2.0％(v/v)。
制备敏感性测试培养基的方法为下列步骤a.通过向1.0升蒸馏水中加入22克粉末状培养基来制备Mueller Hinton肉汤II培养基；b.高压灭菌(121℃，15psi，15分钟)并且冷却所述培养基；c.加入高至约10％最终体积的Oxyrase，并且在培养箱中于35-37℃下保持30分钟；
d.向96孔微滴定板的每孔中加入约50μL；e.将药物称重，并且将所述肉汤加入药物中以达到约(标准128μg/ml)；f.向所述滴定板的第一列加入50μL所述药物；g.通过在所述板间或所述板下进行两倍连续稀释来稀释；h.制备108CFU/ml的PromptTM接种液；i.在所述肉汤中以1∶100(10μL/9.9ml(1∶100))稀释接种液，形成106个菌落形成单元(CFU)的经调节的接种液；j.向所述微滴定板的孔中加入50μL经调节的接种液；k.将所述板在35-37℃下培养18-22小时；和l.肉眼读出MIC。
本发明中所利用的营养培养基是适用于敏感性测试的任何液体或固体制剂。
本文中所描述的营养培养基优选地尤其适用于敏感性测试，包括四环素家族抗生素的敏感性测试，且尤其是涉及经7和9取代的四环素并且特别是替加环素的敏感性测试。
固体培养基通常由经例如琼脂或明胶的试剂固化(也就是“凝胶”)的液体培养基组成。在本发明中适用于稳定ATCC质量控制生物体的临界点的通常可利用的培养基的实例包括(但不限于)Brain Heart Infusion、Brucella、CDC Anaerobe、Nutrient、Schaedler、Thioglycollate、HTM(Haemophilus Test Medium)或Trypticase Soy.(Difco Manual第11版.1998.Difco Laboratories.Division of Becton Dickinson Company Sparks，Maryland)。这些均为肉汤或琼脂形式，并且可以补充血液用于需要其他营养物质的复杂营养型生物体的生长。
通过使用购自Oxyrase，Inc.of Mansfield，Ohio的Oxyrase酶系统可无氧制得所述培养基。就这点来说，“用于琼脂的Oxyrase.”是用于在许多细菌琼脂培养基中制造无氧条件的过滤酶添加剂。类似地，“用于肉汤的Oxyrase.”是用于在细菌肉汤培养基中制造无氧环境的酶添加剂。这些培养基均以无菌(EC)和非无菌(EC/NS)形式购得。
上文所鉴定的Oxyrase酶系统由来源于例如大肠埃希氏菌的微生物的细胞质膜的酶系统组成。市售试剂由0.2微米或更小的膜粒子的缓冲悬浮液组成。酶系统在广pH值和温度范围内具有活性。还原培养基中的氧所需的含有膜的酶系统的精确量因许多参数而变化，包括pH值、温度、所存在的底物的种类和量、容器的表面与深度比和顶部空间体积。
用作本发明佐剂的优选Oxyrase酶系统包含含有电子传递系统的氧净化膜片段，所述电子传递系统在存在氢供体下将氧还原成水。这些氧净化膜片段可以来源于细菌的细胞质膜和/或许多较高等非细菌生物体的线粒体细胞器的膜。尽管通常并不是优选，但是例如葡萄糖氧化酶、醇氧化酶、触酶等的其他已知生物催化氧还原剂也可用于补充或用于本发明。
适用于本发明的优选Oxyrase酶系统包括使用来源于具有膜的细菌的无菌膜片段，所述无菌膜片段含有在营养培养基中存在氢供体下将氧还原成水的电子传递系统。已知许多细菌具有含有电子传递系统的细胞质膜，如果培养基中存在合适氢供体，那么所述电子传递系统有效地将氧还原成水。细菌来源选自以下各细菌的群组大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。这些细菌膜可高度有效地将氧从培养基和其他含水和半固体环境中移除。
本发明尤其适用于测定ATCC质量控制生物体的敏感性测试结果，并且进一步用于表征和测试临床分离株或者治疗由传染微生物所引起的疾病。
本发明的方法涉及一种其中测试微生物对抗生素的敏感性的方法。在本发明的一个实施例中，所述微生物是临床分离株。在本发明的一个优选实施例中，所述微生物是ATCC质量控制生物体。所述测试程序或疗法适用于任何所需微生物，并且尤其适用于任何所需细菌。
本发明的方法(尤其是敏感性测试)也通过以套组形式提供所述方法中所用的试剂来便捷地实施。所述套组优选地含有适当的生长培养基(液体或固体)和作为所述套组对照物的佐剂与测试生物体或其组合、抗生素或其组合，以及(如果需要)适当纯度的水。集合中的对照生物体、佐剂、培养基和/或抗生素可以是不特制用于一特定微生物的物质，或者是特制用于一特定微生物的物质。如果需要，那么特异套组可特别含有特定生物体以(优选地)用作标准物。在所述套组中，如果非细菌组份并未如其可能的那样已混合在一起，那么所述组份通常相互之间紧密靠近(即使封闭在独立的容器或包装中)，并且与套组中所提供的任何细菌样品紧密靠近，所述细菌样品视情况可以是ATCC质量控制生物体。
所属领域技术人员应了解在不影响本发明的精神或范畴或者其任何实施例的情况下，可在广泛和等效范围内的条件、参数和类似情况下实施本发明。
下列非限制性实例说明本发明的某些方面。
材料与方法生物体所使用的细菌分离株是由NCCLS推荐用于敏感性测试的质量控制的那些细菌分离株。(National Committee for Clinical Laboratory Standards，2003.Methods for DilutionAntimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically；Approved StandardsM7-A6，第6版，第23卷，National Committee for Clinical Laboratory Standards Wayne，PA.，National Committee for Clinical Laboratory Standards 2003.Methods for DilutionAntimicrobial Disk Susceptibility Tests；Approved StandardsM2-A8，第8版，第20卷.National Committee for Clinical Laboratory Standards，Wayne，PA.)。标准的细菌分离株包括大肠埃希氏菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC 29213、粪肠球菌(E.faecalis)ATCC 29212、肺炎链球菌(S.pneumoniae)ATCC 49247和流感嗜血杆菌(H.influenzae)ATCC 49247。大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌(S.pyogenes)、粘膜炎莫拉菌(M.catarrhalis)和流感嗜血杆菌的临床分离株获自Wyeth General Culture Collection。先前已经描述表达特征性四环素抗性决定子的大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌菌株(Petersen，P.J.，N.V.Jacobus，W.J.Weiss，P.E.Sum，和R.T.Testa，Antimicrob.Agents Chemother.43738-744，1999)。
抗生素与化学物质替加环素的标准粉末获自Wyeth Research，Pearl River，NY。米诺环素、四环素、L-半胱氨酸、L-抗坏血酸、丙酮酸钠、触酶和巯基乙酸钠购自Sigma/Aldrich ChemicalCompany(St.Louis，Mo.)。Oxyrase购自Oxyrase Inc，Mansfield，OH。
敏感性测试如NCCLS所推荐，通过肉汤微稀释方法测定替加环素和对照抗生素的活体外活性。(National Committee for Clinical Laboratory Standards，2003.Methods for DilutionAntimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically；Approved StandardsM7-A6，第6版，第23卷，National Committee for Clinical Laboratory Standards Wayne，PA.)用于标准程序。具有5％经溶解的马血的MBH用于测试肺炎链球菌，且嗜血杆菌(Haemophilus)测试培养基用于测试流感嗜血杆菌。根据制造商说明书通过向50ml培养基中加入1ml Oxyrase来使用Oxyrase(Oxyrase Inc，Mansfield，OH)。通过在多个烧瓶中制备MHB，接着将培养基储存于各种条件下来进行培养基老化研究。通常在每一测试天以一式两份的方式进行MIC。无氧条件下的储存在无氧室中进行(MACS MG1000，Don Whitley Scientific LTD)。通过pH计(Corning430)测定培养基的pH值。表1展示具有和不具有Oxyrase的通过琼脂和肉汤稀释法的替加环素抵抗临床分离株的活体外活性的比较。
表1
具有和不具有Oxyrase的通过琼脂和肉汤稀释的替加环素抵抗临床分离株的活体外活性的比较

表2展示Oxyrase对替加环素、其他甘氨酰四环素和米诺环素的活体外活性(MIC，μg/ml)的影响。
表2Oxyrase对替加环素和其他甘氨酰四环素与米诺环素的活体外活性(MIC，μg/ml)的影响

老化与新鲜培养基的杀菌时间实验。
根据NCCLS指导通过肉汤巨稀释方法进行杀菌时间检验(NCCLS.1999.Methodsfor Determining Bactericidal Activity of Antimicrobial Agents；Approved GuidelinesM26-A，第19卷.National Committee for Clinical Laboratory Standards，Wayne，PA.)。这些检验中采用大约为106CFU/ml的起始接种液，和最终浓度等于MIC四倍的抗生素。含有50mlMHB II和适当抗菌剂的烧瓶培养有50ml处于对数生长期的测试生物体。测试烧瓶(250ml)在35℃水浴中振荡(150RPM)培养。移除等分试样以测定0、2、4、6和24小时处的活菌计数。在无菌的0.85％氯化钠溶液中制备连续稀释液。用螺旋接种仪(plater)(Don Whitley Scientific LTD)将经稀释的样品(0.05ml)涂于适当琼脂板胰酶解酪蛋白大豆琼脂(TSA)上。所述板在周围空气中于35℃下培养18-22小时，并且在ProtoCOL读板器接种仪上测定菌落数目(Don Whitley Scientific LTD)。通过对log10CFU/ml与24小时中的时间作图来构造杀菌曲线，并且确定细菌浓度的变化。图1以图形方式展示数据。表3展示培养基年龄(新鲜对老化)与Oxyrase对替加环素活性的影响的最小抑制浓度结果。
如表3所示，补充有Oxyrase的老化培养基中所测定的替加环素的MIC与新鲜培养基中所测定的MIC几乎相同。此外，也补充有Oxyrase的新鲜培养基中所测定的替加环素的MIC与未补充的新鲜培养基中所测定的MIC无显著差异。
表3培养基时间与Oxyrase对替加环素活性的影响

培养基时间对替加环素的MIC的影响。
为了确定培养基时间对替加环素的活体外活性的影响，制备MHB并将其在室温或2℃下储存28天。在0、7、14、21和28天制备替加环素、米诺环素和四环素的微肉汤稀释MIC塔板。如表4所示，在每一测试天平行测定6个样品的MIC。如表4进一步所示，在四周的测试时期内，替加环素的MIC中存在可再现的3至4次稀释增加。与储存于室温下的培养基相比，储存于4℃下的培养基老化稍许缓慢。
如表4所示，其显示第0天至第28天的间隔时间内，培养基时间、制备和储存对替加环素抵抗参照生物体ATCC 25922、ATCC29213和ATCC29212的活体外活性(MIC，μg/ml)的影响。
表4培养基时间、制备和储存对替加环素抵抗ATCC参照生物体大肠埃希氏菌ATCC25922(N＝6)的活体外活性(MIC，μg/ml)的影响

a室温表6培养基来源、时间和储存条件对替加环素活性的影响

如表5所示，新鲜培养基中所测定的替加环素MIC比老化培养基中所测定的替加环素MIC低1至3倍。为了进一步确定此影响，用大肠埃希氏菌ATCC25922在0.12和0.1μg/ml替加环素的新鲜与老化培养基中进行杀菌时间实验，此代表老化培养基中所测定的所述生物体的1×和4×MIC。如图1所示，当在新鲜培养基中测试时，0.12和0.1μg/ml替加环素均抑制大肠埃希氏菌ATCC25922的生长。然而，当在老化培养基中进行测试时，暴露于0.12μg/ml替加环素6h后菌株出现再生长。进一步参看表5，为了确定老化培养基的影响是否受QC生物体限制，在新鲜制备的肉汤中测定MIC，并且将所测定的MIC与使用一板包括肉汤临床分离株与表达各种四环素抗性决定子的菌株的生物体在室温(RT)下储存2周的肉汤中所测定的那些MIC进行比较。
因为培养基的pH在时间上不存在改变，所以这不能解释新鲜培养基中所测定的替加环素的MIC与老化培养基中所测定的那些MIC相比的差异。因此，尽管不受理论限制，但是其假定新鲜与老化培养基间的差异起因可归因于氧化降解的加速和早期峰的形成，可由在储存期间内所发生的肉汤培养基中所溶解的氧量增加所引起。因为显示肉汤培养基中所溶解的氧浓度受替加环素MIC影响，所以进行研究以评估老化对已经在无氧室内储存的培养基的影响。如表6所示，经商业制备的培养基和在RT下于室内空气中老化2周的培养基导致替加环素MIC比新鲜制备培养基高1-4倍。相反，无氧条件下储存的培养基导致替加环素的MIC与新鲜培养基中所获的结果几乎相同。
为了测试所述假设，在水、新鲜MHB和老化MHB中制备替加环素溶液。将所述溶液在RT下储存隔夜，接着使其经受HPLC分析以观测替加环素的降解。如图2所示，HPLC分析展示在约11.5至12.0分钟的保留时间内溶离的早期峰。如图3所示，新鲜培养基的早期峰量约为水的早期峰量的12倍，而在老化培养基中所述比率约为35。此证实在老化培养基中替加环素的早期峰的形成加速。
高压液相色谱法(HPLC)
在实验1中，检测三个实验测试样品的替加环素的早期峰形成。在实验2中，评估六个实验测试样品以测定在24小时内发生的替加环素早期峰。结果如下列出实验1媒剂实验2媒剂1.新鲜的Mueller Hinton II 1.具有2％Oxyrase的新鲜Mueller Hinton II2.老化的Mueller Hinton II 2.不具有Oxyrase的新鲜Mueller Hinton II3.仅为水 3.具有2％Oxyrase的老化Mueller Hinton II4.不具有Oxyrase的老化Mueller Hinton II5.含有2％Oxyrase的水6.仅为水制备在上述媒剂的每一者中浓度为1mg/mL的替加环素，在0时和第1天时于RT下进行检验。
HPLC参数如下列出HPLC管柱Luna C18(2)，5μm，4.6×150mm探测250nm下的UV流率1.5mL/min注射体积＝30μL流动相A950mL水中6.8g KH2PO4，用KOH将pH调至6.2，与50mL乙腈混合流动相B500mL水中6.8g KH2PO4，用KOH将pH调至6.2，与500mL乙腈混合梯度时间(min) A％ B％0 95 5基线2060 40线性5 0100线性1 0100固持0.1 95 5基线据信早期峰具有下列结构式A，其特征性质子核磁共振谱如图4所示。
结构式A也可能互变异构形式存在，并且所述互变异构体如下所述 表5培养基时间对替加环素抵抗临床分离株的活体外活性的影响最低抑制浓度(μg/ml)

为了确定肉汤培养基中所溶解的氧浓度是否可以由向培养基中加入还原剂来控制，在存在0.05％(w/v)L-半胱氨酸、0.05％L-抗坏血酸、0.05％丙酮酸钠、0.05％触酶和0.05％巯基乙酸钠的情况下测定MIC，所有这些物质先前均报导为细菌病原体生长培养基中的还原剂。表7显示还原剂对替加环素、米诺环素和四环素的活体外活性的影响。
表8与9总结Oxyrase对NCCLS质量控制菌株的影响-从9个调查者的许多独立实验组合的数据。
表7各种还原剂对替加环素、米诺环素和四环素的活体外活性的影响


表8使用Mueller Hinton肉汤或具有Oxyrase的Mueller Hinton肉汤的替加环素抵抗ATCC质量控制菌株a-j的MIC(μg/ml)分布

a.大肠埃希氏菌ATCC25922Mueller Hinton肉汤b.大肠埃希氏菌ATCC25922Mueller Hinton肉汤+Oxyrasec.金黄色葡萄球菌ATCC29213Mueller Hinton肉汤d.金黄色葡萄球菌ATCC29213Mueller Hinton肉汤+Oxyrasee.粪肠球菌ATCC29212Mueller Hinton肉汤f.粪肠球菌ATCC29212Mueller Hinton肉汤+Oxyraseg.肺炎链球菌ATCC49619Mueller Hinton肉汤h肺炎链球菌ATCC49619Mueller Hinton肉汤+Oxyrasei流感嗜血杆菌ATCC49247Mueller Hinton肉汤j流感嗜血杆菌ATCC49247Mueller Hinton肉汤+Oxyrase表9使用Mueller Hinton肉汤或具有Oxyrase的Mueller Hinton肉汤的替加环素抵抗ATCC质量控制菌株的MIC(μg/ml)分布

A大肠埃希氏菌ATCC 25922Mueller Hinton肉汤B大肠埃希氏菌ATCC 25922Mueller Hinton肉汤+OxyraseC金黄色葡萄球菌ATCC 29213Mueller Hinton肉汤D金黄色葡萄球菌ATCC 29213Mueller Hinton肉汤+OxyraseE粪肠球菌ATCC 29212Mueller Hinton肉汤F粪肠球菌ATCC 29212Mueller Hinton肉汤+Oxyrase
权利要求
1.一种用于测定ATCC质量控制生物体的敏感性测试的培养基组合物，其中所述培养基组合物包含营养培养基、抗生素和量足以稳定并增强敏感性测试的佐剂。
2.根据权利要求1所述的培养基组合物，其中所述佐剂选自以下各物质的群组半胱氨酸、巯基乙酸盐、抗坏血酸、丙酮酸盐和触酶。
3.根据权利要求1所述的培养基组合物，其中所述佐剂来源于微生物的细胞质膜。
4.根据权利要求2所述的培养基组合物，其中所述佐剂的存在范围为所述培养基组合物的约0.0005％至约5.0％重量/体积。
5.根据权利要求4所述的培养基组合物，其中所述佐剂的存在范围为约0.005％至约0.5％ w/v。
6.根据权利要求4所述的培养基组合物，其中所述佐剂以约0.05％ w/v存在。
7.根据权利要求3所述的培养基组合物，其中所述佐剂的存在量为所述培养基组合物的约0.5％至约10.0％体积/体积。
8.根据权利要求3所述的培养基组合物，其中所述佐剂的存在量为约1.0％至约4.0％(v/v)。
9.根据权利要求3所述的培养基组合物，其中所述佐剂以约2.0％(v/v)存在。
10.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的培养基组合物，其中所述抗生素是四环素。
11.根据权利要求10所述的培养基组合物，其中所述抗生素是经7，9-取代的四环素。
12.根据权利要求9所述的培养基组合物，其中所述四环素抗生素选自以下各物质的群组四环素、氯四环素、氧四环素、二甲基氯四环素、去甲金霉素、甲烯土霉素(methacycline)、赖氨四环素(lymecycline)、氯莫环素(clomocycline)、脱氧土霉素(doxycycline)、米诺环素(minocycline)、N，N-二甲基甘氨酰基酰氨基9-氨基米诺环素(DMG-mino)、N，N-二甲基甘氨酰基酰氨基9氨基-6-脱甲基-6-脱氧四环素(DMG-DMDOT)和替加环素(tigecycline)。
13.根据权利要求9所述的培养基组合物，其中所述四环素抗生素是替加环素。
14.根据权利要求3至13中任一权利要求所述的培养基组合物，其中所述微生物选自以下各微生物的群组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。
15.根据权利要求14所述的培养基组合物，其中所述微生物是大肠埃希氏菌。
16.一种稳定ATCC质量控制生物体的最低抑制浓度(MIC)测试值的方法，其包含下列步骤a.向培养基中加入量足以稳定并增强敏感性测试的佐剂和抗生素以形成用于测试的培养基；b.向所述用于测试的培养基中加入测试生物体；c.培养所述测试培养基；d.读取所述MIC值。
17.一种稳定ATCC质量控制生物体的最低抑制浓度(MIC)测试值的方法，其包含以下步骤a.通过向1.0升蒸馏水中加入22克粉末状培养基来制备Mueller Hinton肉汤II培养基；b.高压灭菌(121℃，15psi，15分钟)并且冷却所述培养基；c.加入高至约10％最终体积的佐剂，并且在培养箱中于35-37℃下保持30分钟；d.向96孔微滴定板的每孔中加入约50μL；e.将抗生素称重，并且将所述肉汤加入药物以达到约(标准128μg/ml)；f.向所述滴定板的第一列加入50μL所述抗生素；g.通过在所述板间或所述板下进行两倍连续稀释来稀释；h.制备108CFU/ml的接种液；i.在所述肉汤中以1∶100(10μL/9.9ml(1∶100))稀释接种液，形成106个菌落形成单元(CFU)的经调节的接种液；j.向所述微滴定板的所述孔中加入50μL所述经调节的接种液；k.将所述板在35-37℃下培养18-22小时；和l.肉眼读取所述MIC。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述佐剂来源于微生物的细胞质膜。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述佐剂的存在量为所述培养基组合物的约0.5％至约10.0％体积/体积。
20.根据权利要求18所述的方法，其中培养基中所述佐剂的存在量为约1.0％至约4.0％(v/v)。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述佐剂以约2.0％(v/v)存在。
22.根据权利要求16至21中任一权利要求所述的方法，其中所述抗生素是四环素。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述抗生素是经7，9-取代的四环素。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述四环素抗生素选自以下各物质的群组四环素、氯四环素、氧四环素、二甲基氯四环素、去甲金霉素、甲烯土霉素、赖氨四环素、氯莫环素、脱氧土霉素、米诺环素、N，N-二甲基甘氨酰基酰氨基9-氨基米诺环素(DMG-mino)、N，N-二甲基甘氨酰基酰氨基9氨基-6-脱甲基-6-脱氧四环素(DMG-DMDOT)和替加环素。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述四环素抗生素是替加环素。
26.根据权利要求18至25中任一权利要求所述的方法，其中所述微生物选自以下各微生物的群组大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、氧化葡萄糖酸杆菌和绿脓杆菌。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述微生物是大肠埃希氏菌。
28.一种用于测定ATCC质量控制生物体的敏感性测试的培养基组合物，其中所述培养基组合物包含营养培养基、佐剂和抗生素，其中所述佐剂的存在量足以抑制通过高压液相色谱法以约11.5-12.0分钟的保留时间所测定的早期峰的形成。
29.根据权利要求28所述的培养基组合物，其中所述佐剂来源于微生物的细胞质膜。
30.根据权利要求29所述的培养基组合物，其中培养基中所述佐剂的存在量为约0.5％至约10.0％。
31.根据权利要求29所述的培养基组合物，其中培养基中所述佐剂的存在量为约1.0％至约4.0％。
32.根据权利要求29所述的培养基组合物，其中所述佐剂以约2.0％存在。
33.根据权利要求28至32中任一权利要求所述的培养基组合物，其中所述抗生素是四环素。
34.根据权利要求33所述的培养基组合物，其中所述抗生素是经7，9-取代的四环素。
35.根据权利要求33所述的培养基组合物，其中所述四环素抗生素选自以下各物质的群组四环素、氯四环素、氧四环素、二甲基氯四环素、去甲金霉素、甲烯土霉素、赖氨四环素、氯莫环素、脱氧土霉素、米诺环素、N，N-二甲基甘氨酰基酰氨基9-氨基米诺环素(DMG-mino)、N，N-二甲基甘氨酰基酰氨基9氨基-6-脱甲基-6-脱氧四环素(DMG-DMDOT)和替加环素。
36.根据权利要求33所述的培养基组合物，其中所述四环素抗生素是替加环素。
37.根据权利要求33所述的培养基组合物，其中所述微生物选自以下各微生物的群组大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、氧化葡萄糖酸杆菌和绿脓杆菌。
38.根据权利要求33所述的培养基组合物，其中所述微生物是大肠埃希氏菌。
39.一种用于测定ATCC质量控制生物体的敏感性测试的培养基组合物，其中所述培养基组合物包含营养培养基、佐剂和四环素抗生素，其中所述佐剂的存在量足以抑制通过高压液相色谱法所测定的早期峰的形成。
40.一种用于测定ATCC质量控制生物体的敏感性测试的培养基组合物，其中所述培养基组合物包含营养培养基、佐剂和经7，9-取代的四环素抗生素，其中所述佐剂的存在量足以抑制通过高压液相色谱法所测定的早期峰的形成。
41.一种用于测定ATCC质量控制生物体的敏感性测试的培养基组合物，其中所述培养基组合物包含营养培养基、佐剂和替加环素抗生素，其中所述佐剂的存在量足以抑制通过高压液相色谱法以约11.5-12.0分钟的保留时间所测定的早期峰的形成。
42.一种用于测定ATCC质量控制生物体的敏感性测试的培养基组合物，其中所述培养基组合物包含新鲜的营养培养基和抗生素以稳定并增强敏感性测试。
43.根据权利要求42所述的培养基组合物，其中所述新鲜的营养培养基不超过12小时。
44.根据权利要求42所述的培养基组合物，其中所述抗生素是替加环素。
全文摘要
本发明涉及一种用于测定ATCC质量控制生物体的敏感性测试的培养基组合物，其中所述培养基组合物包含营养培养基、抗生素和量足以稳定并增强敏感性测试的佐剂。
文档编号C12Q1/04GK1890378SQ200480036523
公开日2007年1月3日 申请日期2004年12月9日 优先权日2003年12月11日
发明者帕特里夏·安·布拉德福德, 彼得·詹姆斯·彼得森 申请人:惠氏控股公司