扩增核酸的方法

专利名称：扩增核酸的方法
技术领域：
本发明涉及检测用于临床医学领域的靶核酸的方法，和合成用于基因工程领域的DNA的方法。本发明涉及扩增作为模板的核酸的方法和检测根据所述方法扩增的靶核酸的方法。
背景技术：
为了多种目的，DNA合成被用于基因工程领域的研究中。大多数DNA合成是采用酶促方法进行的，其中使用DNA聚合酶，但短链DNAs(如寡核苷酸)的合成除外。
例如，根据聚合酶链反应(PCR)方法，需要在高温和低温重复反应数次，以再生用于随后的扩增循环的单链靶分子。由于反应受到上文描述的温度的限制，需要用不连续相或周期进行反应系统。
因此，该方法要求使用能够随时间严格调节宽范围温度的昂贵的热循环仪。此外，反应需要时间以将温度调节到2或3个预定的温度。时间丧失的增加与循环数目成比例。
然后，开发了可以在等温条件下进行的核酸扩增方法，以便解决上述问题。
可以在等温条件下进行的方法的例子包括链置换扩增(SDA)(参见，例如，专利文件1)、滚环扩增(RCA)法(参见，例如，专利文件2)、环介导的等温扩增(LAMP)法(参见，例如，专利文件3)、等温和嵌合引物起始的核酸扩增(ICAN)法(参见，例如，专利文件4)和多种改进的SDA法(参见，例如，专利文件5-8)。
在所述核酸扩增的等温方法或寡核苷酸合成的反应中，在恒温下温育的反应混合物中平行进行从引物延伸和引物与单链延伸产物(或与原始的靶序列)的退火和随后的从引物延伸。
专利文件1中描述的SDA法是在DNA聚合酶和限制性核酸内切酶的辅助下通过双链的置换扩增样品中的靶核酸序列(及其互补链)的方法。该方法需要4种引物用于扩增，需要构建其中的两种，使其包含限制性核酸内切酶的识别位点。该方法需要使用修饰的脱氧核糖核苷三磷酸作为大量DNA合成的底物。修饰的脱氧核糖核苷三磷酸的例子是(α-S)脱氧核糖核苷三磷酸，其中磷酸基团中α-位置的氧原子被硫原子(S)取代。
专利文件2中描述的RCA法是一种核酸扩增方法，其中将环状DNA用作模板。得到的扩增产物具有一种序列，其中扩增区重复数次，并且作为新模板。结果，最终的扩增产物具有分枝的结构，称作“分枝”。至于RCA法，据报道，抑制副反应中序列梯样扩增产物的产生对于增加扩增效率是重要的(参见，例如，非专利文件1)。
专利文件3中描述的LAMP法需要4种引物用于扩增。得到的扩增产物是具有多种大小的序列梯样DNAs，其中要扩增的靶区域是重复的。在DNA中，靶区域以可变方向彼此连接。
专利文件4中描述的ICAN法是一种核酸扩增方法，其中使用嵌合寡核苷酸引物。
专利文件5中描述的改进的SDA法是一种DNA扩增方法，其中使用嵌合寡核苷酸引物。嵌合寡核苷酸引物包括RNA和DNA，并且具有一种结构作为必要元件，该元件中DNA至少位于3′末端。
专利文件6中描述的改进的SDA法需要使用限制酶，该酶产生3′突出端。
专利文件7中描述的改进的SDA法需要使用至少两对引物。
专利文件8中描述的改进的SDA法需要使用至少两对引物和至少一种修饰的脱氧核糖核苷三磷酸。
如上文所述，已经开发了等温核酸扩增方法，但这些方法也具有涉及扩增效率、检测灵敏度等的问题。然后，开发了改进的等温核酸扩增方法以解决所述问题(参见，例如，专利文件9-11)。
专利文件9中描述的方法是一种核酸扩增方法，其使用以下物质具有RNA聚合酶的启动子或其部分的引物，所述启动子或其部分连接于逆转录引物或用于核酸扩增的引物的5′末端，所述引物进一步具有连接于5′末端的包含至少5个核苷酸的任意寡核苷酸；以及退火于上游区域或引物中RNA聚合酶的启动子的一部分的第三引物。
专利文件10中描述的方法是一种核酸扩增方法，其中使用至少两个互补引物或至少两个引物对。
该方法是这样的方法，其中通过使用多个引物或多个引物对增加产生的扩增产物的量。必须使用更多的引物或引物对以增加生产能力。
专利文件11中描述的方法是根据专利文件12中描述的方法，采用以下组合嵌合寡核苷酸引物；和上游寡核苷酸引物，所述引物与模板核酸中引物杂交的位置3’的部分杂交。
根据该方法，形成序列梯的寡核苷酸引物仅仅由与模板链杂交的序列组成。
上文所述的常规等温核酸扩增方法仍然具有很多问题。因此，需要有效和高度灵敏的方法。
专利文件1JP-B 7-114718专利文件2WO 97/19193专利文件3WO 00/28082专利文件4WO 00/56877专利文件5US 5,824,517
专利文件6WO 99/09211专利文件7WO 95/25180专利文件8WO 99/49081专利文件9WO 95/03426专利文件10WO 95/25180专利文件11JP-A 2003-52380非专利文件1Hafner，G.J.et al.，BioTechniques，vol.30(2001)p.852-867发明内容本发明要解决的问题 本发明的主要目的是提供扩增靶核酸的方法，通过该方法，以高灵敏度特异性扩增样品中的靶核酸，本发明的目的也包括用于该方法的组合物和试剂盒。
解决问题的方法 本发明人进行了深入研究，以解决上述问题。结果，本发明人发现，如果核酸中存在基本相同的序列作为模板，并且针对所述序列之间的区域内的序列设计引物，则在ICAN反应中产生序列梯样产物。在序列梯样产物中，靶区域通过相同的序列沿一个方向聚合。本发明人进一步发现可以通过将扩增产物正转化为序列梯样产物，ICAN反应的灵敏度、扩增效率和反应速度可以增加。该转化是通过使用嵌合寡核苷酸引物和含有特定核苷酸序列的形成序列梯的寡核苷酸引物而完成的。这样，完成了本发明。
本发明的第一方面涉及扩增核酸的方法，该方法包括以下步骤(A)制备选自下组的反应混合物(a)作为模板的核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少两种嵌合寡核苷酸引物、至少一种形成序列梯的寡核苷酸引物和RNA酶H；或(b)作为模板的核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少两种嵌合寡核苷酸引物和RNA酶H；其中嵌合寡核苷酸引物之一作为形成序列梯的寡核苷酸引物，其中每一种嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸和选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的至少一种物质，并且所述核糖核苷酸位于引物的3′末端或3′末端侧，其中所述嵌合寡核苷酸引物至少包含第一嵌合寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，所述第一嵌合寡核苷酸与作为模板的核酸的核苷酸序列互补，所述第二嵌合寡核苷酸引物与作为模板的核酸的核苷酸序列同源，并且其中形成序列梯的寡核苷酸引物具有与作为模板的核酸的一个区域和/或所述区域下游的核苷酸序列互补的序列，所述区域与第一嵌合寡核苷酸引物互补，并且所述形成序列梯的寡核苷酸引物在其5′侧具有与以下序列互补的序列第二嵌合寡核苷酸引物5′侧的、与作为模板的核酸同源的核苷酸序列；作为模板的核酸的一种核苷酸序列，该核苷酸序列相应于与第二嵌合寡核苷酸引物同源的部分的5′末端上游的区域；或这两者；以及(B)在恒温条件下将反应混合物温育足够的时间以产生序列梯样扩增产物，在所述条件下发生引物与作为模板的核酸的特异性退火、通过DNA聚合酶合成延伸链的反应和链置换反应、以及通过RNA酶H切割延伸链的反应。
根据第一方面，作为模板的核酸可以是RNA，并且可以事先用脱氧核糖核苷三磷酸、具有逆转录活性的DNA聚合酶和至少一种形成序列梯的寡核苷酸引物处理核酸，以便将核酸转化为逆转录产物。
根据第一方面，步骤(A)中的反应混合物可以进一步含有具有逆转录活性的DNA聚合酶。
根据第一方面，作为模板的核酸可以是mRNA。
根据第一方面，可以使用单一的具有逆转录酶活性和链置换活性的DNA聚合酶。

本发明的第二方面涉及用于第一方面的方法的组合物，所述组合物含有至少一种嵌合寡核苷酸引物和/或至少一种形成序列梯的寡核苷酸引物。
本发明的第三方面涉及用于第一方面的试剂盒，所述试剂盒含有至少一种嵌合寡核苷酸引物和/或至少一种形成序列梯的寡核苷酸引物。
本发明的第四方面涉及检测靶核酸的方法，该方法包括以下步骤(a)根据第一方面的方法扩增靶核酸；和(b)检测上述步骤中扩增的靶核酸。
本发明的第五方面涉及用于第一方面的方法的寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物在其5′侧具有与以下序列互补的序列引物5′侧的、与作为模板的核酸同源的核苷酸序列；作为模板的核酸的一种核苷酸序列，该核苷酸序列相应于与第二嵌合寡核苷酸引物同源的部分的5′末端上游的区域；或这两者。
发明效果 本发明提供了优于常规等温核酸扩增方法的扩增方法，以及用于该方法的、含有引物的组合物和试剂盒。
附图简述

图1说明了实施例2-(1)-(A)中使用的第一嵌合寡核苷酸引物、第二寡核苷酸引物和形成序列梯的寡核苷酸引物之间的位置关系。(a)代表第一嵌合寡核苷酸引物，(b)-(d)代表形成序列梯的寡核苷酸引物，(e)代表第二嵌合寡核苷酸引物。(b)-(d)的每个第1部分都具有与(e)5’上游部分的互补链中的第1部分同源的序列。
图2描述了各种拷贝数的扩增曲线。图2的水平轴代表反应周期数。在图2中，a、b、c、d、e和f分别代表用105个拷贝、104个拷贝、103个拷贝、102个拷贝、101个拷贝和100个拷贝获得的扩增曲线。
实施本发明的最佳方式 正如此处所用的，脱氧核糖核苷酸(也称作dN)指糖部分由D-2-脱氧核糖组成的核苷酸。其例子包括以腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶为碱基部分的脱氧核糖核苷酸。此外，此脱氧核糖核苷酸也包括具有修饰的碱基如7-脱氮鸟苷的脱氧核糖核苷酸、具有可以用于固定的官能团的脱氧核糖核苷酸，和如脱氧肌苷核苷酸的脱氧核糖核苷酸类似物。
正如此处所用的，核糖核苷酸(也称作N)指糖部分由D-核糖组成的核苷酸。此核糖核苷酸包括，如以腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶为碱基部分的核糖核苷酸。核糖核苷酸也包括修饰的核糖核苷酸，如α-位磷酸基团的氧原子为硫原子(S)所取代的修饰核苷酸(也称作(α-S)核糖核苷酸或(α-S)N)或其衍生物。
正如此处所用的，嵌合寡核苷酸引物指具有定位于引物的3′-末端或3′-末端侧的核糖核苷酸的寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物可在本发明的方法中用于核酸链的延伸，可利用RNA酶H对其进行切割，并且其可用来实现链置换反应。本发明的嵌合寡核苷酸引物包括任意具有上述组构的嵌合寡核苷酸引物。
根据本发明使用的嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸和选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物中的至少一种物质。所述引物包括含有未修饰的核糖核苷酸和/或修饰的核糖核苷酸的寡核糖核苷酸引物。
用于本发明的方法中的嵌合寡核苷酸引物具有与作为模板的核酸的核苷酸序列的一部分基本互补的核苷酸序列。正如此处所用的，“基本互补的核苷酸序列”表示能够与作为模板的DNA在使用的反应条件下退火的核苷酸序列。
正如此处所用的，3′-末端侧指从核酸(如引物)的中心到3′-末端的部分。同样的，5′-末端侧指从核酸的中心到5′-末端的部分。
正如此处所用的，上游区指模板链的一个区域，它位于嵌合寡核苷酸引物的核苷酸序列的5’末端的5’，其中所述模板链与要使用的嵌合寡核苷酸引物同源。因此，它相当于与模板链互补的链的一个区域，该区域位于与嵌合寡核苷酸引物的核苷酸序列的互补的序列的3’末端的3’。
正如此处所用的，用于形成序列梯的核苷酸序列是指与以下序列互补的核苷酸序列用于本发明的方法中的嵌合寡核苷酸引物5′侧的核苷酸序列；作为模板的核酸的一种核苷酸序列，该核苷酸序列相应于与嵌合寡核苷酸引物同源的部分的5′末端上游(即，5’)的区域；或这两者。
正如此处所用的，形成序列梯的寡核苷酸引物是指含有上述位于引物5’侧的用于形成序列梯的核苷酸序列的引物。
核苷酸序列中的位置是按如下表示的用于本发明的方法中的嵌合寡核苷酸引物的5’末端或相应于与嵌合寡核苷酸引物退火的模板链中的该位置的位置被定义为″0″。朝向嵌合寡核苷酸引物的3’末端的位置由整数″+1″，″+2″，...表示。作为模板的核酸中″0″位上游的1位核苷酸被定义为″-1″。朝向上游的位置由整数″-2″，″-3″，...表示。
正如此处所用的，RNA酶H(核糖核酸酶H)可以是通过从已经退火于作为模板的核酸的嵌合寡核苷酸引物进行DNA延伸而产生的双链DNA，并且在引物中的核糖核苷酸部分对其进行特异性切割的酶。
正如此处所用的，DNA聚合酶是指利用DNA链作模板合成另一新DNA链的酶(DNA依赖性DNA聚合酶)，或用RNA链作模板合成与RNA链互补的DNA链的酶(RNA依赖性DNA聚合酶)。DNA聚合酶包括天然DNA聚合酶和具有上述活性的变体酶。例如，这样的酶包括具有链置换活性的DNA聚合酶、缺乏5′→3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶、及额外具有逆转录酶活性或RNA酶H活性的DNA聚合酶。
正如此处所用的，“链置换活性”指可实现链置换的活性，也即，可在作为模板的核酸的序列基础上进行DNA复制同时置换DNA链以释放已经退火到模板链上的互补链。此外，由于链置换作用而从作为模板的核酸中释放出的DNA链在此处可称为“置换后的链”。
正如此处所用的，“逆转录活性”是指能够用作为模板的RNA链合成与RNA链互补的DNA链的活性。
(1)扩增本发明的靶核酸的方法可以用至少一种嵌合寡核苷酸引物和至少一种形成序列梯的寡核苷酸引物和RNA酶H以及DNA聚合酶的组合实施本发明的方法。或者，可以在表现出RNA酶H活性的条件下使用具有RNA酶H活性的DNA聚合酶。
根据本发明的方法，在等温条件下对核酸进行连续扩增。“连续”指在反应温度没有任何变化或反应混合物的组成没有任何变化的情况下进行反应。正如此处所用的，“等温”指温度基本恒定的反应条件，在该条件下酶和核酸链就能在下述每步中发挥其作用。
在本发明的扩增靶核酸的方法的一种实施方案中，用于扩增核酸的示例性方法包括以下步骤(a)用脱氧核糖核苷三磷酸、具有逆转录活性的DNA聚合酶和至少一种形成序列梯的寡核苷酸引物处理作为模板的核酸，以获得逆转录产物；(b)通过混合逆转录产物、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少两种嵌合寡核苷酸引物和RNA酶H而制备反应混合物；和(c)在恒温条件下将反应混合物温育足够的时间以产生序列梯样扩增产物，在所述条件下发生通过DNA聚合酶合成延伸链的反应和链置换反应，以及通过RNA酶H切割延伸链的反应。
每一种嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸和选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的至少一种物质，并且所述核糖核苷酸位于引物的3′末端或3′末端侧。
嵌合寡核苷酸引物至少包含第一嵌合寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，所述第一嵌合寡核苷酸与作为模板的核酸的核苷酸序列互补，所述第二嵌合寡核苷酸引物与作为模板的核酸的核苷酸序列同源。
形成序列梯的寡核苷酸引物与作为模板的核酸的一个区域和所述区域下游的核苷酸序列互补，所述区域与第一嵌合寡核苷酸引物互补，并且所述形成序列梯的寡核苷酸引物在其5′侧具有与以下序列互补的序列第二嵌合寡核苷酸引物5′侧的、与作为模板的核酸同源的核苷酸序列；作为模板的核酸的一种核苷酸序列，该核苷酸序列相应于与第二嵌合寡核苷酸引物同源的部分的5′末端上游(即，5’)的区域；或这两者。
在本发明的另一种实施方案中，用于扩增核酸的示例性方法包括以下步骤(a)通过混合作为模板的核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有逆转录酶活性的DNA聚合酶、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少两种嵌合寡核苷酸引物、至少一种形成序列梯的寡核苷酸引物和RNA酶H而制备反应混合物；和(c)在恒温条件下将反应混合物温育足够的时间以产生序列梯样扩增产物，在所述条件下发生引物与作为模板的核酸的特异性退火、通过DNA聚合酶合成延伸链的反应和链置换反应、以及通过RNA酶H切割延伸链的反应。
每一种嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸和选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的至少一种物质，并且所述核糖核苷酸位于引物的3′末端或3′末端侧。
嵌合寡核苷酸引物至少包含第一嵌合寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，所述第一嵌合寡核苷酸与作为模板的核酸的核苷酸序列互补，所述第二嵌合寡核苷酸引物与作为模板的核酸的核苷酸序列同源。
形成序列梯的寡核苷酸引物与作为模板的核酸的一个区域和所述区域下游的核苷酸序列互补，所述区域与第一嵌合寡核苷酸引物互补，并且所述形成序列梯的寡核苷酸引物在其5′侧具有与以下序列互补的序列第二嵌合寡核苷酸引物5′侧的、与作为模板的核酸同源的核苷酸序列；作为模板的核酸的一种核苷酸序列，该核苷酸序列相应于与第二嵌合寡核苷酸引物同源的部分的5′末端上游(即，5’)的区域；或这两者。
在本发明的另一种实施方案中，用于扩增核酸的示例性方法包括以下步骤(a)通过混合作为模板的核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少两种嵌合寡核苷酸引物、至少一种形成序列梯的寡核苷酸引物和RNA酶H而制备反应混合物；和(c)在恒温条件下将反应混合物温育足够的时间以产生序列梯样扩增产物，在所述条件下发生引物与作为模板的核酸的特异性退火、通过DNA聚合酶合成延伸链的反应和链置换反应、以及通过RNA酶H切割延伸链的反应。
每一种嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸和选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的至少一种物质，并且所述核糖核苷酸位于引物的3′末端或3′末端侧。
嵌合寡核苷酸引物至少包含第一嵌合寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，所述第一嵌合寡核苷酸与作为模板的核酸的核苷酸序列互补，所述第二嵌合寡核苷酸引物与作为模板的核酸的核苷酸序列同源。
形成序列梯的寡核苷酸引物与作为模板的核酸的一个区域和所述区域下游的核苷酸序列互补，所述区域与第一嵌合寡核苷酸引物互补，并且所述形成序列梯的寡核苷酸引物在其5′侧具有与以下序列互补的序列第二嵌合寡核苷酸引物5′侧的、与作为模板的核酸同源的核苷酸序列；作为模板的核酸的一种核苷酸序列，该核苷酸序列相应于与第二嵌合寡核苷酸引物同源的部分的5′末端上游(即，5’)的区域；或这两者。
在上述实施方案中，如果作为模板的核酸是单链核酸，第一嵌合寡核苷酸具有与该链互补的核苷酸序列；第二嵌合寡核苷酸引物具有互补于与该链互补的链的核苷酸序列，也就是说，与该链同源的核苷酸序列；并且，形成序列梯的嵌合寡核苷酸引物具有与该链互补的核苷酸序列，并且，所述形成序列梯的嵌合寡核苷酸引物在其5′侧具有与以下序列互补的序列第二嵌合寡核苷酸引物5′侧的、与该链同源的核苷酸序列；相应于第二嵌合寡核苷酸引物的5′末端上游的区域的核苷酸序列；或这两者。不需要指出，当作为模板的核酸是双链的情况下，可以采用相似的方式设计用于其中一条链的引物。
在上述任一实施方案中，可以用嵌合寡核苷酸引物代替形成序列梯的寡核苷酸引物。在该情况下，嵌合寡核苷酸引物可以补充形成序列梯的寡核苷酸引物的功能。因此，可以优选使用寡核苷酸引物和/或嵌合寡核苷酸引物，只要它可以导致序列梯形成。
尽管不意欲限制本发明，例如，可以将第一嵌合寡核苷酸引物用作形成序列梯的寡核苷酸引物。在此情况下，第一嵌合寡核苷酸引物在其5′侧具有与以下序列互补的序列第二嵌合寡核苷酸引物5′侧的、与作为模板的核酸同源的核苷酸序列；相应于第二嵌合寡核苷酸引物的5′末端上游的区域的核苷酸序列；或这两者。
用于PCR方法等的dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物)可优选用作核苷三磷酸，这些核苷三磷酸在本发明的方法中的延伸反应中作为底物。此外，dUTP可以用作底物。只要可作为要使用的DNA聚合酶的底物，dNTP可含有dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)类似物如7-脱氮-dGTP，或诸如dITP的核苷三磷酸。也可选用dNTP或dNTP类似物的衍生物。也可含有具有官能团的衍生物，如具有氨基的dUTP。嵌合寡核苷酸引物也用于本方法中。按照传统的合成方法，可利用DNA合成仪来制备引物。
可从含有核酸的任何样品中制备或分离可用作本发明中的模板的核酸(DNA或RNA)。或者，样品可直接用于本发明的核酸扩增反应中。含有核酸的样品的示例包括，但并不局限于取自生物体的样品如全血、血清、血块黄层、尿、粪便、脑脊液、精液、唾液、组织(如癌组织或淋巴结)及细胞培养物(如哺乳动物细胞培养物或细菌细胞培养物)、含有核酸如类病毒、病毒、细菌、真菌、酵母菌、植物和动物的样品、怀疑污染或感染有微生物如病毒或细菌的样品(如食品或生物制剂)、以及含有生物体的样品，如土壤和废水。样品可为含有核酸的制剂，此制剂是按照已知的方法对上述样品进行加工制得的。例如，细胞破坏产物或通过对产物进行分级分离得到的样品、样品中的核酸、或对其中的特异性核酸群体(如mRNA)进行了富集的样品可被用作本发明的制剂。此外，优选使用核酸，如利用已知方法、对样品中含有的核酸进行扩增而得到的DNA或RNA。
可以通过如利用去污剂溶解、超声、利用玻璃珠振荡或搅拌、或弗氏压碎器来处理上述的材料，从而制备含有核酸的制剂，但这并不限制本发明。在某些情况下，对制剂进行进一步加工以对核酸进行纯化是有利的(如在内源核酸酶存在的情况下)。在这样的情况下，核酸是通过已知的方法如苯酚提取、色谱法、离子交换法、凝胶电泳法或密度梯度离心法进行纯化的。
如果需要对具有源自RNA的序列的核酸进行扩增，可利用cDNA作模板来实施本发明中的方法，此cDNA是通过以RNA为模板的逆转录反应合成的。任何可使引物用于逆转录反应中的RNA都可用于本发明的方法中，这样的RNA包括样品中的总RNA、RNA分子群体如mRNA、tRNA和rRNA及特异性RNA分子。
任何具有以RNA为模板合成cDNA的活性的酶都可不受限制地用于逆转录反应中。其示例包括源自多种来源的逆转录酶，如源自禽类成髓细胞瘤病毒的逆转录酶(AMV RTase)、源自Molony鼠白血病病毒的逆转录酶(MMLV RTase)及Rous-伴随病毒2逆转录酶(RAV-2RTase)。此外，也可选用额外具有逆转录酶活性的DNA聚合酶。本发明的目的优选在高温下具有逆转录活性的酶，如源自栖热菌属细菌的DNA聚合酶(如Tth DNA聚合酶)及源自芽胞杆菌属嗜热细菌的DNA聚合酶等。例如，虽然没有限制本发明的意图，但优选源自芽胞杆菌属嗜热细菌的DNA聚合酶，如源自B.st的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)及Bca DNA聚合酶。例如，Bca DNA聚合酶的逆转录反应不要求锰离子。此外，在高温条件下，在抑制模板RNA的二级结构形成的同时可以合成cDNA。只要它们具有活性，具有逆转录酶活性的天然酶和变体酶都可使用。
尽管不意欲限制本发明，优选大约6个核苷酸到大约50个核苷酸，更优选大约10个核苷酸到大约40个核酸，更优选大约12个核苷酸到大约30个核苷酸的寡核苷酸可以用作本发明方法的嵌合寡核苷酸引物。嵌合寡核苷酸引物的核苷酸序列优选与模板核酸互补，这样它可以在要使用的反应条件下与作为模板的核酸退火。引物在3’末端或3’末端侧含有由用于下文所述步骤中的RNA酶H识别的序列。
例如，虽然没有限制本发明的意图，但具有以下通式所表示的结构的寡核苷酸可在本发明的DNA合成方法中用作引物通式5′-dNa-Nb-dNc-3′(在该通式中，“dN”代表脱氧核糖核苷酸和/或核苷酸类似物；“N”代表未修饰的核糖核苷酸和/或修饰的核糖核苷酸，其中只要功能不受损，可以获得每种核苷酸的核苷酸类似物或核苷酸衍生物(修饰的核苷酸)，“dNa”中的一些dNs可为Ns所替换。
在上述通式中，例如，“a”是等于或大于5的整数，优选等于或大于6，更优选等于或大于8；“b”是等于或大于1的整数，例如，1-15，优选1-10，更优选1-7，更优选1-5；“c”可以是0，或者c可以是等于或大于1的整数；优选0-5，更优选0-3，但不限制本发明。
根据本发明的方法，可以用形成序列梯的寡核苷酸引物获得序列梯样扩增产物。可优选将选自脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和核苷酸类似物的至少一种物质用于引物。
优选将以下引物用作本发明的方法中使用的形成序列梯的寡核苷酸引物，所述引物在其5′侧具有与以下序列互补的连接的核苷酸序列第二嵌合寡核苷酸引物5′侧的、与作为模板的核酸同源的核苷酸序列；相应于第二嵌合寡核苷酸引物的5′末端上游的区域的核苷酸序列；或这两者。
如果将RNA用作本发明的模板，可以将形成序列梯的寡核苷酸引物用作逆转录的引物。只要它能够在使用的反应条件下与模板RNA退火，就没有特别的限制。引物可以是具有与特定模板RNA互补的核苷酸序列的引物(特异性引物)、寡-dT(脱氧胸腺嘧啶)引物和具有随机序列的引物(随机引物)。根据特定的退火，形成序列梯的寡核苷酸引物中的、与模板核酸的核苷酸序列的一部分互补的序列部分的长度优选是6个核苷酸或更多、更优选9个核苷酸或更多。根据寡核苷酸合成，长度优选是100个核苷酸或更少，更优选30个核苷酸或更少。只要可以将其用于从RNA进行的逆转录反应，就没有特别的限制。
只要能够导致在使用的条件下以序列梯样方式延伸DNA链，则对形成序列梯的寡核苷酸引物就没有特别的限制。引物优选具有与以下序列互补的核苷酸序列嵌合寡核苷酸引物5′侧的、与作为模板的核酸同源的核苷酸序列；相应于第二嵌合寡核苷酸引物的5′末端上游的区域的核苷酸序列；或这两者。尽管不意欲限制本发明，与寡核苷酸引物上游的区域互补的序列的长度优选是大约3个到大约100核苷酸，更优选大约4个到大约50个核苷酸，更优选大约5个到大约20个核苷酸。
尽管不意欲限制本发明，与嵌合寡核苷酸引物上游的区域互补的序列是选自+20位到-100位，优选+15位到-80位，更优选+10位到-60位，更优选优选+5位到-40位的具有3个或更多核苷酸的序列。所述核苷酸的例子包括，但不限于，从-1位、-11位或-21位开始的序列。
只要可以实施功能，对于与形成序列梯的寡核苷酸引物退火的部分没有特别的限制。该部分可以是与嵌合寡核苷酸引物完全重叠、或有一个或多个核苷酸重叠、邻接于或与其距离1-40个核苷酸的部分。
尽管不意欲限制本发明，形成序列梯的寡核苷酸引物的GC含量优选是40％或更多。
此外，本发明的方法中使用的形成序列梯的寡核苷酸引物可含有核苷酸类似物和其他物质。也就是说，只要引物实现通过DNA聚合酶的作用而从3′末端开始聚合延伸反应的功能不丧失，本发明的形成序列梯的寡核苷酸引物中就可包含一种或多种核苷酸类似物。核苷酸类似物的多种类型可组合使用。可以使用的核苷酸类似物的示例包括，但并不局限于脱氧肌苷核苷酸、脱氧尿嘧啶核苷酸、具有修饰的碱基如7-脱氮鸟嘌呤的核苷酸类似物、具有核糖衍生物的核苷酸类似物等。此外，只要保留上述功能，本发明使用的嵌合嵌合寡核苷酸引物可含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或具有多种修饰，如添加已标记的化合物或添加用于固定的官能团的核苷酸类似物。
在引物中掺入核苷酸类似物可有效抑制引物高级结构的形成并稳定与模板退火的形式。
按照亚磷酰胺法，利用如Applied Biosystems Inc.(ABI)394型DNA合成仪，可合成用于本发明的方法的形成序列梯的寡核苷酸引物。另外，包括磷酸三酯法、H-磷酸酯法和硫代膦酸酯法在内的任何方法都可用于合成。
在本发明的另一实施方案中，可以利用作为模板的核酸中固有的核苷酸序列获得序列梯样扩增产物。在此情况下，可以利用作为模板的核酸中的核苷酸序列进行序列梯形成。尽管不意欲限制本发明，例如，如果嵌合寡核苷酸引物之一的5′侧或上游的核苷酸序列与其它嵌合寡核苷酸引物的5′侧或上游的核苷酸序列互补，可以通过设计用于所述位置的嵌合寡核苷酸引物而有效获得序列梯样扩增产物。通过进行序列梯形成，增加了检测灵敏度和检测速度。
在嵌合寡核苷酸引物5′侧或上游的作为模板的核酸中的互补核苷酸序列可以根据GC含量、邻接的序列、距离引物的位置、要扩增的长度、反应条件等任意选择。尽管不意欲限制本发明，例如，它们优选选自具有3个或更多核苷酸、优选6个或更多核苷酸的互补核苷酸序列。此外，尽管不意欲限制本发明，序列是例如从+20到-100，优选从+15到-80，更优选从+10到-60，更优选从+5到-40的区域，其中将嵌合寡核苷酸引物的5’末端定义为0位。
在嵌合寡核苷酸引物5′侧或上游的作为模板的核酸中的互补核苷酸序列可以根据GC含量、邻接的序列、距离引物的位置、要扩增的长度、反应条件等任意选择。尽管不意欲限制本发明，互补程度优选是70％或更高。
尽管不意欲限制本发明，用于本发明的方法中的形成序列梯的寡核苷酸引物被描述为，例如，用于下文实施例中的形成序列梯的寡核苷酸引物。
例如，在A12-205R(SEQ ID NO3)中，1到12位的核苷酸构成了与第二嵌合寡核苷酸引物134FN3(18)(SEQ ID NO7)的5′末端上游1到12个核苷酸的区域(-1到-12)互补的核苷酸序列，13到30位的核苷酸构成了互补于与第一嵌合寡核苷酸引物205RN3(18)(SEQ IDNO2)互补的区域的序列。也就是说，13到30位的核苷酸构成了与第一嵌合寡核苷酸引物同源的序列。
例如，在A12-215R(SEQ ID NO5)中，1到12位的核苷酸构成了与第二嵌合寡核苷酸引物134FN3(18)(SEQ ID NO7)的5′末端上游1到12个核苷酸的区域(-1到-12)互补的核苷酸序列，13到30位的核苷酸构成了与以下序列互补的区域，所述序列为第一嵌合寡核苷酸引物205RN3(18)(SEQ ID NO2)的5’侧上的8个核苷酸组成的序列和互补于与第一嵌合寡核苷酸引物互补的区域下游的10个核苷酸组成的序列的序列。也就是说，13到30位的核苷酸构成了与第一嵌合寡核苷酸引物的5’侧上从第10个上游核苷酸到8个核苷酸组成的序列的区域同源的序列。A12-215R的23到30位的核苷酸与205RN3(18)的1到8位的核苷酸重叠。
例如，在A12-215R(SEQ ID NO5)中，1到12位的核苷酸构成了与第二嵌合寡核苷酸引物134FN3(18)(SEQ ID NO7)的5′末端上游1到12个核苷酸的区域(-1到-12)互补的核苷酸序列，13到30位的核苷酸构成了互补于与第一嵌合寡核苷酸引物205RN3(18)(SEQ IDNO2)互补的区域下游的18个核苷酸组成的序列的序列。也就是说，13到30位的核苷酸构成了与第一嵌合寡核苷酸引物从第18个上游核苷酸到第1个上游核苷酸的序列同源的序列。A12-223R邻接于205RN3(18)。
例如，在A12(-10)-215R(SEQ ID NO8)中，1到12位的核苷酸构成了与第二嵌合寡核苷酸引物134FN3(18)(SEQ ID NO7)的5′末端上游11到22个核苷酸的区域(-11到-22)互补的核苷酸序列，13到30位的核苷酸构成了与以下序列互补的区域，所述序列为第一嵌合寡核苷酸引物205RN3(18)(SEQ ID NO2)的5’侧上的8个核苷酸组成的序列和互补于与第一嵌合寡核苷酸引物互补的区域下游的10个核苷酸组成的序列的序列。也就是说，13到30位的核苷酸构成了与第一嵌合寡核苷酸引物的5’侧上从第10个上游核苷酸到8个核苷酸组成的序列的区域同源的序列。A12(-10)-215R的23到30位的核苷酸与205RN3(18)的1到8位的核苷酸重叠。
例如，在A12(-20)-215R(SEQ ID NO9)中，1到12位的核苷酸构成了与第二嵌合寡核苷酸引物134FN3(18)(SEQ ID NO7)的5′末端上游21到32个核苷酸的区域(-21到-32)互补的核苷酸序列，13到30位的核苷酸构成了与以下序列互补的区域，所述序列为第一嵌合寡核苷酸引物205RN3(18)(SEQ ID NO2)的5’侧上的8个核苷酸组成的序列和互补于与第一嵌合寡核苷酸引物互补的区域下游的10个核苷酸组成的序列的序列。也就是说，13到30位的核苷酸构成了与第一嵌合寡核苷酸引物的5’侧上从第10个上游核苷酸到8个核苷酸组成的序列的区域同源的序列。A12(-20)-215R的23到30位的核苷酸与205RN3(18)的1到8位的核苷酸重叠。
例如，在A12(6)-215R(SEQ ID NO10)中，1到12位的核苷酸构成了与第二嵌合寡核苷酸引物134FN3(18)(SEQ ID NO7)的5′侧上的6个核苷酸组成的序列(+5到0)和第二嵌合寡核苷酸引物5′末端上游1到6个核苷酸的区域(-1到-6)互补的核苷酸序列，13到30位的核苷酸构成了与以下序列互补的区域，所述序列为第一嵌合寡核苷酸引物205RN3(18)(SEQ ID NO2)的5’侧上的8个核苷酸组成的序列和互补于与第一嵌合寡核苷酸引物互补的区域下游的10个核苷酸组成的序列的序列。也就是说，13到30位的核苷酸构成了与第一嵌合寡核苷酸引物的5’侧上从第10个上游核苷酸到8个核苷酸组成的序列的区域同源的序列。A12(6)-215R的23到30位的核苷酸与205RN3(18)的1到8位的核苷酸重叠。
例如，在A12(12)-215R(SEQ ID NO11)中，1到12位的核苷酸构成了与第二嵌合寡核苷酸引物134FN3(18)(SEQ ID NO7)的5′侧上的12个核苷酸组成的序列(+11到0)互补的核苷酸序列，13到30位的核苷酸构成了与以下序列互补的区域，所述序列为第一嵌合寡核苷酸引物205RN3(18)(SEQ ID NO2)的5’侧上的8个核苷酸组成的序列和互补于与第一嵌合寡核苷酸引物互补的区域下游的10个核苷酸组成的序列的序列。也就是说，13到30位的核苷酸构成了与第一嵌合寡核苷酸引物的5’侧上从第10个上游核苷酸到8个核苷酸组成的序列的区域同源的序列。A12(12)-215R的23到30位的核苷酸与205RN3(18)的1到8位的核苷酸重叠。
例如，在A6(-10)-215R(SEQ ID NO14)中，1到6位的核苷酸构成了与第二嵌合寡核苷酸引物134FN3(18)(SEQ ID NO7)的5′末端上游11到16个核苷酸的区域(-11到-16)互补的核苷酸序列，7到24位的核苷酸构成了与以下序列互补的区域，所述序列为第一嵌合寡核苷酸引物205RN3(18)(SEQ ID NO2)的5’侧上的8个核苷酸组成的序列和互补于与第一嵌合寡核苷酸引物互补的区域下游的10个核苷酸组成的序列的序列。也就是说，7到24位的核苷酸构成了与第一嵌合寡核苷酸引物的5’侧上从第10个上游核苷酸到8个核苷酸组成的序列的区域同源的序列。A6(-10)-215R的17到24位的核苷酸与205RN3(18)的1到8位的核苷酸重叠。
例如，在A9(-10)-215R(SEQ ID NO15)中，1到9位的核苷酸构成了与第二嵌合寡核苷酸引物134FN3(18)(SEQ ID NO7)的5′末端上游11到19个核苷酸的区域(-11到-19)互补的核苷酸序列，10到27位的核苷酸构成了与以下序列互补的区域，所述序列为第一嵌合寡核苷酸引物205RN3(18)(SEQ ID NO2)的5’侧上的8个核苷酸组成的序列和互补于与第一嵌合寡核苷酸引物互补的区域下游的10个核苷酸组成的序列的序列。也就是说，10到27位的核苷酸构成了与第一嵌合寡核苷酸引物的5’侧上从第10个上游核苷酸到8个核苷酸组成的序列的区域同源的序列。A9(-10)-215R的10到27位的核苷酸与205RN3(18)的1到8位的核苷酸量叠。
例如，在(A12)241RN3(SEQ ID NO19)中，1到7位的核苷酸构成了与第二嵌合寡核苷酸引物160FN3(SEQ ID NO17)的5′末端上游1到7个核苷酸的区域(-1到-7)互补的核苷酸序列，8到21位的核苷酸构成了互补于与第一嵌合寡核苷酸引物241RN3(SEQ ID NO18)互补的区域的序列。也就是说，8到21位的核苷酸构成了与第一嵌合寡核苷酸引物同源的序列。
例如，在ALDH2-TH1(SEQ ID NO25)中，1到12位的核苷酸构成了与第二嵌合寡核苷酸引物ICAN-ALDH2-F(SEQ ID NO21)的5′末端上游1到12个核苷酸的区域(-1到-12)互补的核苷酸序列，13到29位的核苷酸构成了作为模板的核酸的一个区域，该区域与以下序列互补，所述序列为第一嵌合寡核苷酸引物ICAN-ALDH2-R(SEQ ID NO22)的5’侧上的15个核苷酸组成的序列和互补于与第一嵌合寡核苷酸引物互补的区域下游的2个核苷酸组成的序列的序列。也就是说，它们构成了与第一嵌合寡核苷酸引物的5’侧上从第2个上游核苷酸到15个核苷酸组成的序列的区域同源的序列。ICAN-ALDH2-R的2到16位的核苷酸与ALDH2-TH1的15到29位的核苷酸重叠。
例如，在ALDH2-TH2(SEQ ID NO26)中，1到12位的核苷酸构成了与第二嵌合寡核苷酸引物ICAN-ALDH2-F(SEQ ID NO21)的5′末端上游1到12个核苷酸的区域(-1到-12)互补的核苷酸序列，13到29位的核苷酸构成了与以下序列互补的区域，所述序列为第一嵌合寡核苷酸引物ICAN-ALDH2-R(SEQ ID NO22)的5’侧上的6个核苷酸组成的序列和互补于与第一嵌合寡核苷酸引物互补的区域下游的10个核苷酸组成的序列的序列。也就是说，13到29位的核苷酸构成了与第一嵌合寡核苷酸引物的5’侧上从第10个上游核苷酸到6个核苷酸组成的序列的区域同源的序列。ICAN-ALDH2-R的2到7位的核苷酸与ALDH2-TH2的23到28位的核苷酸重叠。
例如，在ALDH2-TH3(SEQ ID NO27)中，1到12位的核苷酸构成了与第二嵌合寡核苷酸引物ICAN-ALDH2-F(SEQ ID NO21)的5′末端上游1到12个核苷酸的区域(-1到-12)互补的核苷酸序列，13到28位的核苷酸构成了互补于以下核苷酸序列的序列，所述核苷酸序列为与第一嵌合寡核苷酸引物ICAN-ALDH2-R(SEQ ID NO22)互补的序列下游2到17个核苷酸的核苷酸序列。也就是说，13到28位的核苷酸构成了与第一嵌合寡核苷酸引物上游2到17个核苷酸的序列同源的序列。
例如，在R2(-13)A12-1(SEQ ID NO35)中，1到12位的核苷酸构成了与第二嵌合寡核苷酸引物F2(SEQ ID NO31)的5′末端上游1到12个核苷酸的区域(-1到-12)互补的核苷酸序列，13到29位的核苷酸构成了互补于以下核苷酸序列的序列，所述核苷酸序列为与第一嵌合寡核苷酸引物R2(SEQ ID NO32)互补的序列下游13到29个核苷酸的核苷酸序列。也就是说，13到29位的核苷酸构成了与第一嵌合寡核苷酸引物上游13到29个核苷酸的序列同源的序列。
例如，在R2(-13)A12-2(SEQ ID NO36)中，1到12位的核苷酸构成了与第二嵌合寡核苷酸引物F2(SEQ ID NO31)的5′末端上游13到24个核苷酸的区域(-13到-24)互补的核苷酸序列，13到29位的核苷酸构成了互补于以下核苷酸序列的序列，所述核苷酸序列为与第一嵌合寡核苷酸引物R2(SEQ ID NO32)互补的序列下游13到29个核苷酸的核苷酸序列。也就是说，13到29位的核苷酸构成了与第一嵌合寡核苷酸引物上游13到29个核苷酸的序列同源的序列。
例如，在A6-215R(SEQ ID NO47)中，1到6位的核苷酸构成了与第二嵌合寡核苷酸引物B134FN3(SEQ ID NO12)的5′末端上游1到6个核苷酸的区域(-1到-6)互补的核苷酸序列，7到24位的核苷酸构成了与以下序列互补的区域，所述序列为第一嵌合寡核苷酸引物205RN3(16)(SEQ ID NO13)的5’侧上的8个核苷酸组成的序列和互补于与第一嵌合寡核苷酸引物互补的区域下游的10个核苷酸组成的序列的序列。也就是说，7到24位的核苷酸构成了与第一嵌合寡核苷酸引物的5’侧上从第10个上游核苷酸到8个核苷酸组成的序列的区域同源的序列。205RN3(16)的1到8位的核苷酸与A6-215R的17到24位的核苷酸重叠。
例如，在A9-215R(SEQ ID NO48)中，1到9位的核苷酸构成了与第二嵌合寡核苷酸引物B134FN3(SEQ ID NO12)的5′末端上游1到9个核苷酸的区域(-1到-6)互补的核苷酸序列，10到27位的核苷酸构成了与以下序列互补的区域，所述序列为第一嵌合寡核苷酸引物205RN3(16)(SEQ ID NO13)的5’侧上的8个核苷酸组成的序列和互补于与第一嵌合寡核苷酸引物互补的区域下游的10个核苷酸组成的序列的序列。也就是说，7到24位的核苷酸构成了与第一嵌合寡核苷酸引物的5’侧上从第10个上游核苷酸到8个核苷酸组成的序列的区域同源的序列。205RN3(16)的1到8位的核苷酸与A6-215R的20到27位的核苷酸重叠。
在图1中说明了实施例2-(1)-(A)中使用的第一嵌合寡核苷酸引物、第二嵌合寡核苷酸引物和形成序列梯的寡核苷酸引物之间的位置关系。
包括嗜中温和耐热核酸酶在内的任何RNA酶H可优选应用于本发明之中。例如，根据WO 02/22831的实施例8描述的方法制备的源自Thermococcus litralis的RNA酶HII(此后称作Tli RNA酶HII)或根据WO 02/22831的实施例7描述的方法制备的源自闪烁古生球菌的RNA酶HII(此后称作Afu RNA酶HII)可以按照下文实施例中的描述用于本发明的方法中。优选使用的耐热核酸酶的实例包括，但并不局限于商购的RNA酶H、HybridaseTM耐热RNA酶H(EpicenterTechnologies)及源自芽胞杆菌属的嗜热细菌的、源自栖热菌属细菌的、源自火球菌属细菌的、源自栖热袍菌属细菌的、源自古生球菌属细菌的RNA酶H等。此外，天然RNA酶H及变体都是优选使用的。
任何具有链置换活性的DNA聚合酶均可用于本发明中。其示例包括源自芽胞杆菌属的嗜热细菌如热坚芽孢杆菌(下文称为B.ca)和嗜热脂肪芽胞杆菌(下文称为B.st)并缺乏其5′→3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶变体、以及大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段(克列诺片段)。本发明优选的选用嗜中温和耐热DNA聚合酶。
B.ca为嗜热细菌，其最佳生长温度约为70℃。已知源自此细菌的Bca DNA聚合酶具有DNA依赖型DNA聚合酶活性、RNA依赖型聚合酶活性(逆转录活性)、5′→3′外切核酸酶活性和3′→5′外切核酸酶活性。此酶可为从其最初来源纯化的酶或可为利用遗传工程技术制备得到的重组蛋白。可利用遗传工程技术或其他方法对此酶进行修饰，如取代、缺失、添加或插入。这些酶的示例包括BcaBEST DNA聚合酶(TakaraShuzo)，而此酶为缺乏5′→3′外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶。可以根据日本专利No.2978001中描述的方法，由其中公开的微生物制备该酶。
已知某些DNA聚合酶在特定条件下具有内切核酸酶活性，如RNA酶H活性。这样的DNA聚合酶可用于本发明的方法中。在一个方面中，可在表现RNA酶H活性的条件，如Mn2+存在的条件下使用DNA聚合酶。在这种情况下，可在不添加RNA酶H的情况下实施本发明的方法。因此，Bca DNA聚合酶可在含有Mn2+的缓冲液中表现RNA酶活性。上述提及的方面不限于使用Bca DNA聚合酶。已知具有RNA酶H活性的DNA聚合酶，如源自嗜热栖热菌的Tth DNA聚合酶可用于本发明中。
可以将形成序列梯的寡核苷酸引物用于本发明的方法中；第一嵌合寡核苷酸引物也可以作为形成序列梯的寡核苷酸引物起作用；或者，可以利用作为模板的核酸中的互补核苷酸序列获得序列梯样扩增产物。在任何一种情况下，可以通过在随机引物存在下进行反应而稳定反应，从而有效获得感兴趣的扩增产物。尽管对随机引物没有特别的限制，但例如优选使用6-9个核苷酸组成的随机引物。
(2)本发明的组合物本发明提供了用于上文所述本发明的扩增核酸的方法或本发明的检测核酸的方法中的组合物。例如，所述组合物可以含有上文(1)中描述的形成序列梯的寡核苷酸引物和/或嵌合寡核苷酸引物、RNA酶H和DNA聚合酶。所述组合物可以进一步含有缓冲成分、镁盐、dNTPs等，作为进行扩增反应的成分。此外，它还可以含有修饰的脱氧核苷酸或脱氧核苷三磷酸类似物。此外，可以使用缓冲成分和其它添加剂。
在一个特别优选的方面，组合物可以含有适量的上文所述用于本发明的核酸扩增方法的各种成分。可以仅仅通过向组合物中加入合适的模板、嵌合寡核苷酸引物和/和形成序列梯的寡核苷酸而进行扩增反应。如果事先已知进行扩增的对象，组合物优选含有适于扩增该对象的嵌合寡核苷酸引物。
(3)本发明的试剂盒本发明提供了可用于上文所述本发明的扩增核酸的方法中的试剂盒。在一个实施方案中，此试剂盒以包装形式存在，并且含有与DNA聚合酶、RNA酶H、嵌合寡核苷酸引物和/或形成序列梯的寡核苷酸引物在链置换反应中的使用有关的说明书。另外，含有具有链置换活性的DNA聚合酶、RNA酶H、以及用于链置换反应的缓冲液的试剂盒优选用于本发明的方法中。另外，按照说明书，可选择并使用可通过商业渠道购买的、具有链置换活性的DNA聚合酶和/或RNA酶H。此外，如果RNA被用作模板，此试剂盒可含有用于逆转录反应的试剂。DNA聚合酶可选自上文(1)中描述的根据本发明使用的DNA聚合酶。RNA酶H可选自上文(1)中描述的RNA酶H。
“说明书”是描述使用试剂盒的方法，如用于链置换反应的试剂溶液的制备方法、推荐的反应条件等的打印材料。说明书包括小册子或单页、或粘贴到试剂盒上的标签，及在含有试剂盒的包装的表面上的说明形式的使用说明手册。说明书也包括通过电子媒介如互联网公开或提供的信息。
本发明的试剂盒可进一步含有反应缓冲液，这些缓冲液包含N-二[羟乙基]甘氨酸、Tricine、HEPES、磷酸盐或tris-HCl作为缓冲成分。此外，其可含有具有链置换活性的DNA聚合酶及RNA酶H。此外，此试剂盒可含有修饰的脱氧核糖核苷酸或脱氧核糖核苷三磷酸类似物。
除上述的说明书和用于扩增反应的试剂之外，用于检测靶核酸的方法中的试剂盒可进一步含有适于扩增靶核酸的嵌合寡核苷酸引物和/或形成序列梯的寡核苷酸引物，以及用于检测扩增后的靶核酸的试剂(如探针)。
(4)本发明的检测靶核酸的方法可利用本发明的扩增核酸的方法来对样品中的靶核酸进行检测。在一种实施方案中，检测方法包括以下步骤(a)根据上文(1)中描述的本发明的扩增核酸的方法扩增靶核酸；和(b)对上步骤扩增的靶核酸进行检测。
在上述步骤(a)中，如果以RNA为模板，逆转录反应和核酸扩增反应可以在一步或两步中进行。虽然没有限制本发明的意图，但例如，AMV RTase、M-MLV RTase或RAV-2 RTase与Bca DNA聚合酶的组合可优选用作逆转录酶和链置换型DNA聚合酶的组合。或者，可以使用具有逆转录活性和链置换活性的DNA聚合酶。例如，可以优选使用BcaBEST DNA聚合酶。
利用本发明的检测靶核酸的方法可获得关于基因中特定核苷酸的信息，如点突变或单核苷酸多态性(SNP)。在该实施方案中，要使用的嵌合寡核苷酸引物的3’末端部分可以位于要区分的靶核苷酸序列附近的特定核苷酸。
此外，利用含有N-二[羟乙基]甘氨酸、Tricine、HEPES、磷酸盐或tris作缓冲成分的反应缓冲液及含亚精胺或丙二胺的退火溶液，本发明中的检测方法甚至可对痕量核酸样品中的靶核酸进行高灵敏度检测。在这种情况下，对要使用的RNA酶H和DNA聚合酶没有特别的限制。例如，优选源自热球菌属细菌的RNA酶HII与BcaBEST DNA聚合酶的组合。我们认为，优选的RNA酶H和DNA聚合酶的单位数目可根据酶类型的不同而变化。在这种情况下，利用检测灵敏度的升高或扩增产物量为指标，可对缓冲液的组成和添加的酶量进行调整。
根据本发明的检测方法，dUTP在靶核酸扩增过程中可作为底物而掺入。因此，如果dUTP作为底物，通过利用尿嘧啶N-糖苷酶(UNG)降解扩增产物可防止扩增产物的存留污染导致的假阳性。
已知的核酸检测方法可用于步骤(b)中。例如，通过电泳法对特定大小的反应产物进行检测、用Smart Cycler(Takara Bio)、Rotorgene(Corbett Research)等进行实时检测、或通过与探针进行杂交来进行检测。此外，组合利用磁珠的检测方法是优选的。可以通过将在靶核酸扩增步骤中产生的焦磷酸转化为不溶的物质，如镁盐，使反应混合物混浊，然后可以测量混浊度。
在利用电泳进行的检测中，经常利用荧光物质如溴化乙啶。利用探针进行的杂交可与利用电泳进行的检测进行组合。可利用放射性同位素或非放射性物质如生物素或荧光物质对探针进行标记。如果进行实时检测，优选可以使用染色试剂如SYBR Green(Takara Bio)。此外，利用步骤(a)中标记的核苷酸可促进对掺入的标记核苷酸的扩增产物进行的检测，或可增强利用标记物进行检测的信号。荧光偏振法、荧光能量转移等也可用于检测。通过构建合适的检测系统就可对靶核酸进行自动检测或定量。此外，优选利用杂交层析法通过肉眼进行检测。
在本发明的检测方法中可使用两种或多种荧光物质标记的核糖核苷酸(RNA)探针或包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸探针，荧光物质间隔导致淬灭状态的距离。此探针不发射荧光。当探针退火到对与探针互补的靶核酸进行扩增得到的DNA上时，RNA酶H消化了此探针。随后探针上荧光物质间的距离增加，从而使得发射荧光。因此，荧光发射表明有靶核酸存在。如果RNA酶H用于本发明的核酸扩增方法中，那么仅通过向反应混合物中添加探针就可对靶核酸进行检测。例如，荧光物质ROX(Applied Biosystems)或FAM(AppliedBiosystems)和淬灭物质Eclipse(Epoch Biosciences)的组合可优选用于探针标记。
只要在正常杂交条件下可与通过本发明的核酸扩增方法扩增得到的靶核酸进行杂交，那对本发明使用的探针就没有特别的限制。根据扩增产物的特异性检测，优选使用可在例如本领域中技术人员已知的严格条件下进行杂交的探针。严格的杂交条件在，如T.Maniatis etal.(eds.)，Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.，1989，Cold Spring Harbor Laboratory中有描述。特别地，严格的杂交条件的示例如下在含有0.5％SDS的6xSSC(1xSSC；0.15MNaCl，0.015M柠檬酸钠，pH7.0)、5xDenhardt′s(0.1％牛血清白蛋白(BSA)，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％Ficol1400)和100μg/ml鲑鱼精子DNA中，在比使用的探针的Tm值低约25℃的温度下温育4小时到过夜。含有上述标记的探针可用作探针来促进对靶核酸的检测。
根据本发明的检测核酸的方法，产生了序列梯样扩增产物，该产物中扩增的区域彼此连接。在序列梯样扩增产物中，通过相同方向的任意核苷酸序列聚合多个扩增的区域。在通过电泳对扩增产物进行分析时，扩增产物观察为序列梯样带。可以根据要扩增的区域、区域的大小、邻接区域、要使用的嵌合寡核苷酸引物和/或形成序列梯的寡核苷酸引物的核苷酸序列、反应条件等调整序列梯样扩增产物的产生。
根据本发明的检测方法，可以用形成序列梯的寡核苷酸引物和/或嵌合寡核苷酸引物产生多聚体，该多聚体中扩增的区域彼此连接。在序列梯样扩增产物中，多个扩增的区通过形成序列梯的寡核苷酸引物和与第二嵌合寡核苷酸引物的5’侧或上游的区域互补的序列，以相同的方向彼此连接。此外，根据本发明的方法，如果嵌合寡核苷酸引物之一的5’侧或上游的模板核酸的核苷酸序列与另一个嵌合寡核苷酸引物5’侧或上游的模板核酸的核苷酸序列互补，可以通过设计用于所述部分的嵌合寡核苷酸引物而以高灵敏度检测靶核酸。

序列梯样扩增产物含有多个扩增的区域。因此，它可以与例如多个拷贝的合适的探针杂交。与靶核酸的核苷酸序列和/或序列梯样扩增产物中靶核酸序列之间存在的间插序列杂交的那些可以优选用作探针。由于随后发射强信号，如果要检测含有扩增的区域的核酸，则本发明是有用的。通过组合使用限制酶消化等，可以从序列梯样扩增产物获得作为单体的扩增的区域或其部分。
本发明的等温核酸扩增方法不要求利用如热循环仪的设备。由于试剂，如用于PCR的dNTPs等可用于本发明的方法中，那相对于传统方法来讲，运转成本就降低了。因此，本发明的方法可优选用于，如常规进行检测的遗传检验领域中。本发明的方法可在较PCR更短的时间内提供更大量的扩增产物。因此，本发明的方法可用作方便、快捷、灵敏的基因检测方法。
实施例 以下实施例进一步详细说明本发明，但不应解释为限制其范围。
参考实施例1实施例中的耐热RNA酶H的单位数如下计算。
将1mg聚(rA)或聚(dT)(均来自Amersham Biotech)溶解于1ml含有1mM EDTA的40mM tris-HCl(pH7.7)中以制备聚(rA)溶液和聚(dT)溶液。
然后将聚(rA)溶液(至终浓度30μg/ml)和聚(dT)溶液(至终浓度20μg/ml)加入20mM HEPES-KOH(pH 7.8)、100mM乙酸钾、1％二甲亚砜和0.01％BSA。将混合物在37℃温育10分钟，然后冷却到室温。向其中加入1/100体积的400mM乙酸镁，以制备聚(rA)-聚(dT)溶液。
将8μl合适的酶溶液的稀释液加入800μl聚(rA)-聚(dT)溶液。混合物在40℃反应20分钟。随时间测定吸光度(A260)以确定改变。具体地，基于吸光度的差异确定通过酶反应从聚(rA)-聚(dT)杂合体释放的核苷酸浓度。一个单位的RNA酶H确定为使A260增加相当于20分钟内释放1nmol核苷酸的酶量，根据以下公式计算单位＝每分钟的吸光度改变×57.1×稀释率 实施例1(1)制备模板RNA通过体外转录，合成用作RT-ICAN的模板的RNA转录物。
用作体外转录模板的质粒DNA是通过人工合成基因制备委托服务机构(Takara Bio)合成的。使用了SARS(严重急性呼吸综合征)冠状病毒基因组序列(GenBank Acc.No.AY278741)的18133位-18362位的序列(SEQ ID NO1)。分别在该序列的5’末端和3’末端加入用于插入质粒的HindIII和BamHI的识别序列。将该片段插入pBluescriptII SK(+)中的HindIII位点和BamHI位点之间。用BamHI切割得到的质粒，以获得线性DNA，将其用作采用T7 RNA聚合酶进行体外转录的模板。
将MEGAscript T7试剂盒(Ambion)用于体外转录。根据试剂盒所附说明书进行体外转录、DNA酶I处理和RNA纯化，基于OD260测量所合成RNA的浓度。将采用RNA稀释缓冲液(10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、10mM NaCl、30μg/ml大肠杆菌16S+23S rRNA(Boehringer Ingerheim))使浓度调节为100-105个拷贝/μl的RNA溶液用作RT-ICAN的模板。
(2)2步RT-ICAN的检验(A)检验1检验了以下序列的逆转录引物5’末端的连接效果，所述序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域退火。
采用形成序列梯的寡核苷酸引物作为逆转录引物，研究了RT-ICAN的灵敏度和检测速度的改变，所述形成序列梯的寡核苷酸引物在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列，该序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-12)退火。
基于OD260值计算实施例1-(1)中制备的模板RNA的浓度，并且调节到100、101、102、103、104或105个拷贝/μl。制备了含有以下终浓度的成分的10μl反应混合物32mM HEPES-KOH缓冲液(pH 7.8)、100mM乙酸钾、1％二甲亚砜、0.11％BSA、4mM乙酸镁、每种dNTP各500μM、1pmol引物205RN3(18)(SEQ ID NO2)、引物A12-205R(SEQ IDNO3)、引物215R(SEQ ID NO4)、引物A12-215R(SEQ ID NO5)或作为逆转录引物的引物A12-223R(SEQ ID NO6)、12.5U RTaseM-MLV(Takara Bio)和1μl具有各种拷贝数的模板RNAs之一。
将反应混合物置于Thermal Cycler Personal(Takara Bio)，在45℃温育10分钟，然后冷却到4℃。逆转录反应后，将含有以下终浓度的成分的15μl反应混合物加入10μl反应混合物中32mMHEPES-KOH缓冲液(pH 7.8)、100mM乙酸钾、1％二甲亚砜、0.11％BSA、4mM乙酸镁、每种dNTP各500μM、作为第二嵌合寡核苷酸引物的引物134FN3(18)(SEQ ID NO7)和作为第一嵌合寡核苷酸引物的引物205RN3(18)各25pmol、11U BcaBEST(Takara Bio)、根据WO 02/22831的实施例8描述的方法制备的0.05U Tli RNA酶HII和SYBR Green(Takara Bio)。用Rotor基因(Corbett Research)在55℃进行ICAN反应，从而以实时方式检测扩增产物。也通过在3％琼脂糖凝胶上电泳而检测反应产物。
这样，采用引物205RN3(18)进行的具有逆转录的RT-ICAN的灵敏度是104个拷贝。当使用相同位置的在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列的逆转录引物A12-205R，所述12个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-12)退火时，灵敏度是102个拷贝，即，提高了两个数量级。此外，105个拷贝的检测速度增加了大约2分钟。
相似地，采用引物215R DNA进行的具有逆转录的RT-ICAN的灵敏度是103个拷贝。当逆转录使用了相同位置的在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物A12-215R，所述12个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-12)退火时，灵敏度是100个拷贝，即，提高了3个数量级。此外，105个拷贝的检测速度增加了大约2分钟。
此外，当逆转录使用了在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物A12-223R，所述12个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-12)退火时，灵敏度是101个拷贝。
如上文所述，当逆转录使用了在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物，所述12个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-12)退火时，观察到了灵敏度和检测速度的增加，而不论引物与模板RNA的哪一部分退火。
(B)检验2用形成序列梯的寡核苷酸引物作为逆转录引物进行了相似检验，但将与第二嵌合寡核苷酸引物和/或其部分上游的区域退火的、连接于5’末端的12个核苷酸组成的序列的位置进行了改变(-1到-12、-11到-22、-21到-32、+5到-6、+11到0)。
首先，基于OD260值计算实施例1-(1)中制备的模板RNA的浓度，并且调节到100、101、102、103、104或105个拷贝/μl。
制备了含有以下终浓度的成分的10μl反应混合物32mMHEPES-KOH缓冲液(pH 7.8)、100mM乙酸钾、1％二甲亚砜、0.11％BSA、4mM乙酸镁、每种dNTP各500μM、1pmol形成序列梯的寡核苷酸引物，即引物215R、作为逆转录引物的引物A12-215R、引物A12(-10)-215R(SEQ ID NO8)、引物A12(-20)-215R(SEQ ID NO9)、引物A12(6)-215R(SEQ ID NO10)或引物A12(12)-215R(SEQ IDNO11)、50U RTase M-MLV(Takara Bio)和1μl具有各种拷贝数的模板RNAs之一。
将反应混合物置于Thermal Cycler Personal(Takara Bio)，在45℃温育10分钟，然后冷却到4℃。逆转录反应后，将含有以下终浓度的成分的15μl反应混合物加入10μl反应混合物中32mMHEPES-KOH缓冲液(pH 7.8)、100mM乙酸钾、1％二甲亚砜、0.11％BSA、4mM乙酸镁、每种dNTP各500μM、作为第二嵌合寡核苷酸引物的引物B134FN3(16)(SEQ ID NO12)和作为第一嵌合寡核苷酸引物的引物205RN3(16)(SEQ ID NO13)各25pmol、11U BcaBEST(Takara Bio)、0.05U Tli RNA酶HII和SYBR Green(Takara Bio)。用Rotor基因(Corbett Research)在55℃进行ICAN反应，从而以实时方式检测扩增产物。也通过在3％琼脂糖凝胶上电泳而检测反应产物。
结果，采用引物215R进行的具有逆转录的RT-ICAN的灵敏度是102个拷贝。当使用相同位置的在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物A12-215R，所述12个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-12)退火时，灵敏度是101个拷贝，即，提高了一个数量级。此外，105个拷贝的检测速度增加了大约3分钟。
当使用在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物A12(-10)-215R，所述12个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-11到-22)退火时，灵敏度是102个拷贝，与引物215R相同。105个拷贝的检测速度增加了大约2分钟。对102到105个拷贝的检测比用引物215进行的检测更定量(相关系数0.997)。
当使用在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物A12(-20)-215R，所述12个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-21到-32)退火时，灵敏度是101个拷贝，即，提高了一个数量级。此外，105个拷贝的检测速度增加了大约2.5分钟。
当使用在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物A12(6)-215R，所述12个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物的上游区域和部分退火时，或使用在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物A12(12)-215R，所述12个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物的一部分退火时，与在上文所述引物的情况相似，此处也观察到了检测灵敏度和检测速度的提高。

如上文所述，用每一种形成序列梯的寡核苷酸引物，同时改变与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域退火的、连接于5’末端的12个核苷酸组成的序列的位置，观察到了灵敏度和检测速度的提高。
(C)检验3使用在5’末端连接了一种6、9或12个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物，所述6、9或12个核苷酸组成的序列与作为逆转录引物的第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-11到-16、-11到-19或-11到-22)退火，从而检验RT-ICAN的灵敏度和检测速度。
首先，基于OD260值计算实施例1-(1)中制备的模板RNA的浓度，并且调节到100、101、102、103、104或105个拷贝/μl。
制备了含有以下终浓度的成分的10μl反应混合物32mMHEPES-KOH缓冲液(pH 7.8)、100mM乙酸钾、1％二甲亚砜、0.11％BSA、4mM乙酸镁、每种dNTP各500μM、1pmol形成序列梯的寡核苷酸引物，即引物215R、作为逆转录引物的引物A6(-10)-215R(SEQ IDNO14)、引物A9(-10)-215R(SEQ ID NO15)或引物A12(-10)-215R、50U RTase M-MLV(Takara Bio)和1μl具有各种拷贝数的模板RNAs之一。
将反应混合物置于Thermal Cycler Personal(Takara Bio)，在45℃温育10分钟，然后冷却到4℃。逆转录反应后，将含有以下终浓度的成分的15μl反应混合物加入10μl反应混合物中32mMHEPES-KOH缓冲液(pH 7.8)、100mM乙酸钾、1％二甲亚砜、0.11％BSA、4mM乙酸镁、每种dNTP各500μM、作为第二嵌合寡核苷酸引物的引物B134FN3(16)和作为第一嵌合寡核苷酸引物的引物205RN3(16)各25pmol、11U BcaBEST(Takara Bio)、0.05U Tli RNA酶HII和SYBR Green。用Rotor基因(Corbett Research)在55℃进行ICAN反应，从而以实时方式检测扩增产物。也通过在3％琼脂糖凝胶上电泳而检测反应产物。
结果，采用引物215R进行的具有逆转录的RT-ICAN的灵敏度是103个拷贝。当使用相同位置的在5’末端连接了一种6个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物A6(-10)-215R，所述6个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-11到-16)退火时，灵敏度是102个拷贝，即，提高了一个数量级。此外，105个拷贝的检测速度增加了大约1分钟。
当使用相同位置的在5’末端连接了一种9个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物A9(-10)-215R，所述9个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-11到-19)退火时，灵敏度是101个拷贝，即，提高了两个数量级。此外，105个拷贝的检测速度增加了大约2.5分钟。
当使用相同位置的在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物A12(-10)-215R，所述12个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-11到-22)退火时，灵敏度是101个拷贝，即，提高了两个数量级。此外，105个拷贝的检测速度增加了大约3分钟。
如上文所述，在连接了各种数目的核苷酸的形成序列梯的寡核苷酸引物中，使用5’末端连接了一种6个或更多个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物，所述6个或更多个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域退火时，观察到了灵敏度和检测速度的提高。证实了与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域退火的更多个核苷酸组成的序列导致了更高的效率。
(D)检验4采用形成序列梯的寡核苷酸引物A12-215R，检验了RT-ICAN的检测速度和定量性，A12-215R在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列，该序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-12)退火。
首先，基于OD260值计算实施例1-(1)中制备的模板RNA的浓度，并且调节到100、101、102、103、104或105个拷贝/μl。
制备了含有以下终浓度的成分的10μl反应混合物32mMHEPES-KOH缓冲液(pH 7.8)、100mM乙酸钾、1％二甲亚砜、0.11％BSA、4mM乙酸镁、每种dNTP各500μM、1pmol引物A12-215R、50U RTaseM-MLV(Takara Bio)和1μl具有各种拷贝数的模板RNAs之一。
将反应混合物置于Thermal Cycler Personal(Takara Bio)，在45℃温育10分钟，然后冷却到4℃。逆转录反应后，将含有以下终浓度的成分的15μl反应混合物加入10μl反应混合物中32mMHEPES-KOH缓冲液(pH 7.8)、100mM乙酸钾、1％二甲亚砜、0.11％BSA、4mM乙酸镁、每种dNTP各500μM、作为第二嵌合寡核苷酸引物的引物B134FN3(16)和作为第一嵌合寡核苷酸引物的引物205RN3(16)各25pmol、11U BcaBEST(Takara Bio)、0.05U Tli RNA酶HII和SYBR Green。用Rotor基因(Corbett Research)在55℃进行ICAN反应，从而在每个循环(1分钟)以实时方式检测扩增产物。
图2示出了扩增曲线。如图2所示，定量检测了101-105个拷贝(相关系数0.992)。在10个循环中观察到了最低到10个拷贝的反应的产生。
此外，根据探针杂交方法，通过在色谱条带上的显色，也观察到了扩增产物。
根据探针杂交方法，通过在色谱条带上的显色而对扩增产物进行的观察，是采用TaKaRa Bed-Side ICAN blaTMP检测试剂盒(Takara Bio)中所含的检测系列，根据所附说明书中描述的检测方法进行的。在检测中，将含有FITC-标记的探针SARS-BNI-B(SEQ ID NO16)的探针溶液作为探针，而没有使用试剂盒中所含的blaMP探针溶液和IC探针溶液。
结果，对来自100-105个拷贝的反应的扩增产物观察到了红紫色线的显色，表明有特异性扩增。
(3)1步RT-ICAN的检验(A)检验1
检验了采用第一嵌合寡核苷酸引物作为形成序列梯的寡核苷酸引物的效果，所述第一嵌合寡核苷酸引物在5’末端连接了一种序列，该序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域退火。
采用在5’末端连接了一种7个核苷酸组成的序列的第一寡核苷酸引物，检验了RT-ICAN的灵敏度和检测速度，所述7个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-7)退火。作为在第一寡核苷酸引物的5’末端连接所述7个核苷酸组成的序列的结果，从第一嵌合寡核苷酸引物的5’末端开始的12个核苷酸组成的序列构成了与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-12)退火的序列。在相同的试管中平行进行了逆转录反应和ICAN反应。
首先，基于OD260值计算实施例1-(1)中制备的模板RNA的浓度，并且调节到100、101、102、103、104或105个拷贝/μl。将1μl具有各种拷贝数的模板RNA之一加入含有以下终浓度的成分的24μl反应混合物32mM HEPES-KOH缓冲液(pH 7.8)、100mM乙酸钾、1％二甲亚砜、0.11％BSA、4mM乙酸镁、每种dNTP各500μM、作为第二嵌合寡核苷酸引物的引物160FN3(SEQ ID NO17)和作为第一嵌合寡核苷酸引物的引物241RN3(SEQ ID NO18)，或作为第一嵌合寡核苷酸引物的引物(A12)241RN3(SEQ ID NO19)各25pmol、50U RTase M-MLV(Takara Bio)、11U BcaBEST(Takara Bio)、0.05U Tli RNA酶HII和SYBR Green(Takara Bio)。将反应混合物在45℃温育5分钟，并且用Rotor基因(Corbett Research)在55℃温育45分钟，从而以实时方式检测扩增产物。也通过在3％琼脂糖凝胶上电泳而检测反应产物。
结果，采用引物241RN3作为第一嵌合寡核苷酸引物的RT-ICAN的灵敏度是105个拷贝。当使用在5’末端连接了一种7个核苷酸组成的序列的引物(A12)241RN3，所述7个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-7)退火时，灵敏度是103个拷贝，即，提高了两个数量级。此外，105个拷贝的检测速度增加了大约1分钟。
如上文所述，使用在5’末端连接了与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域退火的序列的第一嵌合寡核苷酸引物作为形成序列梯的寡核苷酸引物时，观察到了灵敏度和检测速度的提高。
(B)检验2检验了在5’末端连接了与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域退火的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物对1步RT-ICAN的效果。
向一步RT-ICAN反应系统中加入在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物，所述12个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-12)退火，其中在相同的试管中平行进行了逆转录反应和ICAN反应，并且检验了灵敏度和检测速度。
首先，基于OD260值计算实施例1-(1)中制备的模板RNA的浓度，并且调节到100、101、102、103、104或105个拷贝/μl。将1μl具有各种拷贝数的模板RNA之一加入含有以下终浓度的成分的24μl反应混合物32mM HEPES-KOH缓冲液(pH 7.8)、100mM乙酸钾、1％二甲亚砜、0.11％BSA、4mM乙酸镁、每种dNTP各500μM、作为第二嵌合寡核苷酸引物的引物134FN3(16)(SEQ ID NO20)和作为第一嵌合寡核苷酸引物的引物205RN3(16)各25pmol、50U RTase M-MLV(TakaraBio)、11U BcaBEST(Takara Bio)、0.05U Tli RNA酶HII和SYBRGreen(Takara Bio)，或加入进一步含有2.5pmol作为形成序列梯的寡核苷酸引物的引物A12-223R的24μl反应混合物。将反应混合物在45℃温育5分钟，并且用Rotor基因(Corbett Research)在55℃温育45分钟，从而以实时方式检测扩增产物。也通过在3％琼脂糖凝胶上电泳而检测反应产物。
结果，不加入A12-223R作为形成序列梯的寡核苷酸引物时，1步RT-ICAN的灵敏度是103个拷贝。当加入A12-223R时，灵敏度是102个拷贝，即，提高了一个数量级。此外，103个拷贝的检测速度增加了大约4分钟。
如上文所述，由于在1步RT-ICAN反应中加入了形成序列梯的寡核苷酸引物，观察到了灵敏度和检测速度的提高。
实施例2检验对根据循环探针法，采用实时检测系统对人类醛脱氢酶2基因(ALDH2)中的多态性的进行的检测的影响 检验了对采用ICAN反应和循环探针法，通过实时检测而对多态性进行的检测的影响。将编码人类醛脱氢酶2的基因(GenBank Acc.No.AH002599)选作要检测的对象。已经报道了在该基因的外显子12中存在单核苷酸多态性，其中487位的谷氨酸(GAA)被赖氨酸(AAA)替代，并且与对醉酒的倾向的个体差异密切相关，并参与发生癌的危险性。
采用DNA合成仪(Applied Biosystems)合成相当于第二嵌合寡核苷酸引物的引物ICAN-ALDH2-F(SEQ ID NO21)和相当于第一嵌合寡核苷酸引物的引物ICAN-ALDH2-R(SEQ ID NO22)，以便在ICAN反应系统中检测醛脱氢酶2基因中的多态性。合成了用于检测正常型ALDH2 wG(SEQ ID NO23)的探针和用于检测突变型ALDH2 mA(SEQ IDNO24)的探针。用于检测正常型ALDH2 wG的探针是DNA-RNA-DNA型寡核苷酸探针，该探针具有作为连接在5’末端的荧光标记的ROX标记(Applied Biosystems)和作为连接在3’末端的淬灭标记的Eclipse(Epoch Biosciences)。用于检测突变型ALDH2 mA的探针是DNA-RNA-DNA型寡核苷酸探针，该探针具有作为连接在5’末端的荧光标记的FAM标记(Applied Biosystems)和作为连接在3’末端的淬灭标记的Eclipse。
此外，合成了以下形成序列梯的寡核苷酸引物，它们均在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列，所述12个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-12)退火，所述引物是围绕引物ICAN-ALDH2-R设计的ALDH2-TH1(SEQ ID NO25；相对于嵌合寡核苷酸引物ICAN-ALDH2-R是-1到+15)；ALDH2-TH2(SEQ ID NO26；相对于嵌合寡核苷酸引物ICAN-ALDH2-R是-9 to+6)；和ALDH2-TH3(SEQ ID NO27；相对于嵌合寡核苷酸引物ICAN-ALDH2-R是-17到-2)。
用QIAamp DNA Mini试剂盒(Qiagen)，在获得知情同意后从血样制备作为模板的基因组DNA，在血样中用EDTA作为抗凝剂。
ICAN反应的反应条件如下。简言之，制备含有以下终浓度的成分的最终体积为25μl的反应混合物32mM HEPES-KOH缓冲液(pH7.8)、100mM乙酸钾、5mM乙酸镁、1％二甲亚砜、0.04％丙二胺、0.11％牛血清白蛋白、每种dNTP各600μM、4U BcaBEST DNA聚合酶、100U Tli RNA酶HII、引物ICAN-ALDH2-F和引物ICAN-ALDH2-R各50pmol、5.5pmol探针ALDH2 wG、6pmol探针ALDH2 mA、100ng作为模板的基因组DNA和添加或不添加1pmol形成序列梯的寡核苷酸引物ALDH2-TH1、ALDH2-TH2或ALDH2-TH3的无菌水。将反应混合物置于Smart Cycler(Takara Bio)中，在70℃处理5分钟，并且在56℃温育60分钟。以1分钟的间隔，在56℃的温育期间测量荧光强度。
此外，用作为模板的基因组DNA和一对引物ALDH2-F(SEQ ID NO28)和ALDH2-R(SEQ ID NO29)进行PCR。用Microcon-30(Millipore)纯化得到的扩增产物，用Eco 57I消化，并且在3％NuSieve 3∶1琼脂糖凝胶上进行电泳，以便进行RFLP基因型分析。
用TaKaRa ExTaq(Takara Bio)进行PCR。具体地，制备含有以下终浓度的成分的最终体积为50μl的反应混合物1xExTaq缓冲液、每种dNTP各200μM、1.25U ExTaq，引物ALDH2-F和引物ALDH2-R各10pmol、制备为模板核酸的5μl人类基因组DNA和无菌水。将反应混合物置于热循环仪SP(Takara Bio)中，在94℃加热30秒，然后94℃30秒，55℃30秒和72℃30秒，共进行30轮。
Eco 57I是识别CTGAAG的限制酶。它从正常型的醛脱氢酶2切割扩增产物，但不从突变型切割扩增产物。

当使用一种基因组DNA样品(所述基因组DNA样品在用Eco57I进行PCR RFLP时观察到了3种片段(切割和未切割的扩增产物)(即，被认为是杂合的))时，在向反应系统中加入ALDH2-TH1、ALDH2-TH2或ALDH2-TH3时观察到了Ct值减小，如下文表1和表2所示，表明反应性增加。Ct值是样品的扩增曲线与阈值线(100)交叉的点。当不加入ALDH2-TH1或ALDH2-TH2时(不是在ALDH2-TH3的情况下)，观察到了来自FAM的荧光强度增加，表明检测效率增加。
[表1]表1Ct值的改变
[表2]表2荧光强度
当使用一种基因组DNA样品(所述基因组DNA样品在用Eco57I进行PCR RFLP时观察到了2种片段(切割的扩增产物)(即，被认为对于正常型是纯合的))时，仅仅观察到了来自探针ALDH2的ROX荧光信号。当使用一种基因组DNA样品(所述基因组DNA样品在用Eco57I进行PCR RFLP时观察到了一种片段(未切割的扩增产物)(即，被认为对于突变型是纯合的))时，仅仅观察到了来自探针ALDH2 mA的6-FAM荧光信号。在这些情况下，观察到了Ct值的减小，表明反应性的增加。Ct值是样品的扩增曲线与阈值线(100)交叉的点。
建议在检测时ALDH2中的多态性时加入反应系统的连接于形成序列梯的寡核苷酸引物5’末端的核苷酸序列的作用
关于对通过实施例2-(1)描述的采用ICAN反应和循环探针法，通过实时检测进行的多态性检测的作用，检验了连接于要在检测编码人类醛脱氢酶2的基因时加入反应系统的形成序列梯的寡核苷酸引物的5’末端的核苷酸序列的作用，所述编码人类醛脱氢酶2的基因被选作要检测的对象。
如同实施例2-(1)，引物ICAN-ALDH2-F、引物ICAN-ALDH2-R、用于检测正常型ALDH2 wG的探针和用于检测突变型LDH2 mA的探针被用于采用ICAN反应系统检测醛脱氢酶2基因中的多态性。用于检测正常型ALDH2 wG的探针是DNA-RNA-DNA型寡核苷酸探针，该探针具有作为连接在5’末端的荧光标记的ROX标记和作为连接在3’末端的淬灭标记的Eclipse。用于检测突变型ALDH2 mA的探针是DNA-RNA-DNA型寡核苷酸探针，该探针具有作为连接在5’末端的荧光标记的FAM标记和作为连接在3’末端的淬灭标记的Eclipse。
此外，合成了形成序列梯的寡核苷酸引物ALDH2-TH29(相对于嵌合引物ICAN-ALDH2-R是-9到+6)和引物ALDH2-TH4(SEQ ID NO30)，所述ALDH2-TH29在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列，所述12个核苷酸组成的序列与引物ICAN-ALDH2-F上游的区域(-1到-12)退火，所述引物ICAN-ALDH2-F是围绕引物ICAN-ALDH2-R设计的，引物ALDH2-TH4中去除了在5’末端连接的所述12个核苷酸组成的序列。
用QIAamp DNA Mini试剂盒(Qiagen)，在获得知情同意后从血样制备作为模板的基因组DNA，在血样中用EDTA作为抗凝剂，采用了通过RFLP基因型分析证实是杂合的基因组DNA。
ICAN反应的反应条件如下。简言之，制备含有以下终浓度的成分的最终体积为25μl的反应混合物32mM HEPES-KOH缓冲液(pH7.8)、100mM乙酸钾、5mM乙酸镁、1％二甲亚砜、0.04％丙二胺、0.11％牛血清白蛋白、每种dNTP各600μM、4U BcaBEST DNA聚合酶、100U Tli RNA酶HII、引物ICAN-ALDH2-F和引物ICAN-ALDH2-R各50pmol、5.5pmol探针ALDH2 wG、6pmol探针ALDH2 mA、100ng作为模板的基因组DNA和添加或不添加1pmol形成序列梯的寡核苷酸引物ALDH2-TH2或ALDH2-TH4的无菌水。将反应混合物置于SmartCycler(Takara Bio)中，在70℃处理5分钟，并且在56℃温育60分钟。以1分钟的间隔，在56℃的温育期间测量荧光强度。
如下文表3和表4所示，在向反应系统中加入ALDH2-TH2时观察到了Ct值减小，表明反应性增加。Ct值是样品的扩增曲线与阈值线(100)交叉的点。此外，观察到了来自ROX和FAM的荧光强度增加，表明检测效率增加。另一方面，当将ALDH2-TH4加入反应系统时，没有观察到Ct值或荧光强度的改变。也就是说，当将缺乏与引物ICAN-ALDH2-F上游的区域(-1到-12)退火的12个核苷酸组成的序列的ALDH2-TH4加入反应系统时候，没有观察到在ALDH2-TH2的情况下观察到的反应性和检测效率的增加。
[表3]表Ct值的改变
[表4]表4荧光强度
(3)检验在检测军团菌时向反应系统中加入连接于成序列梯的寡核苷酸引物的5’末端的核苷酸序列的作用 加入形成序列梯的寡核苷酸引物，其在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列，所述12个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-12或-13到-24)退火，并且检验了ICAN反应的检测速度的改变。
检验了对采用ICAN反应和循环探针法进行的实时检测的作用。编码军团菌Mip的基因(肺炎军团菌，巨噬细胞感染性加强物(Mip)；GenBank Acc.No.AF095215)被选作检测对象。
用DNA合成仪(Applied Biosystems)合成了作为第二嵌合寡核苷酸引物的嵌合寡核苷酸引物F2(SEQ ID NO31)和第一嵌合寡核苷酸引物R2(SEQ ID NO32)，以便采用ICAN反应系统检测军团菌Mip基因。合成了用于检测Mip基因Mip4g12(SEQ ID NO33)的探针。用于检测Mip基因Mip4g12的探针是DNA-RNA-DNA型寡核苷酸探针，该探针具有作为连接在5’末端的荧光标记的FAM标记和作为连接在3’末端的淬灭标记的Eclipse。
此外，合成了以下形成序列梯的寡核苷酸引物，它们均在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列，所述12个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-12或-13到-24)退火，所述第二嵌合寡核苷酸引物是围绕第一嵌合寡核苷酸引物设计的R2(-13)(SEQ ID NO34；相对于第一嵌合寡核苷酸引物是-13到-29)；R2(-13)A12-1(SEQ ID NO35；相对于第一嵌合寡核苷酸引物是-13到-29，所述第一嵌合寡核苷酸引物在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列，所述12个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-12)退火)；和R2(-13)A12-2(SEQ ID NO36；相对于第一嵌合寡核苷酸引物是-13到-29，所述第一嵌合寡核苷酸引物在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列，所述12个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-13到-24)退火)。
连接于EnviroAmpTM(Perkin Elmer)的肺炎军团菌对照DNA被用作作为模板的基因组DNA。
ICAN反应的反应条件如下。简言之，制备含有以下终浓度的成分的最终体积为25μl的反应混合物32mM HEPES-KOH缓冲液(pH7.8)、100mM乙酸钾、5mM乙酸镁、1％二甲亚砜、0.04％丙二胺、0.11％牛血清白蛋白、每种dNTP各500μM、2U BcaBEST DNA聚合酶、100U Tli RNA酶HII、嵌合寡核苷酸引物F2和嵌合寡核苷酸引物R2各25pmol、5pmol探针Mip4g12、200个拷贝的作为模板的对照DNA和添加或不添加1pmol R2(-13)A12-1或R2(-13)A12-2的无菌水。将反应混合物置于Smart Cycler(Takara Bio)中，在70℃处理5分钟，并且在53℃温育90分钟。以1分钟的间隔，在56℃的温育期间测量荧光强度。
结果示于表5。在向反应系统中加形成序列梯的寡核苷酸引物R2(-13)A12-1或R2(-13)A12-2时观察到了Ct值减小，表明反应性增加。Ct值是样品的扩增曲线与阈值线(100)交叉的点。
[表5]表5Ct值的改变
实施例3(1)各个ICAN引物上游的作为模板的核酸中的区域中的互补序列对ICAN反应的影响(1) 将6个核苷酸组成的互补序列插入各个ICAN引物5’末端上游的作为模板的核酸中的区域，并且观察对ICAN反应的影响。选择人类c-Ki-ras 2基因(GenBank Acc.No.L00045)作为检测对象。
按照如下方法制备在各个ICAN引物5’末端上游的区域不具有确定的互补序列的模板和具有6个核苷酸组成的互补序列的模板。
用人类基因组(购自Clontech)作为模板，并且采用引物c-Ki-ras/12F(SEQ ID NO37)和引物rasT1R(SEQ ID NO38)，或引物rasT14F(SEQ ID NO39)和引物rasT4R(SEQ ID NO40)进行PCR，所述引物都在各个引物的5’末端连接了互补序列。对得到的片段平端化，并且插入质粒pUC118(Takara Bio)中的HincII位点。从得到的质粒中选择以下质粒，其中引物c-Ki-ras/12F或引物rasT14F的方向与M13引物M4(Takara Bio)的方向相同，M13引物M4与pUC118退火。结果，获得了在各个ICAN引物5’末端的上游没有确定的互补序列的质粒T7和具有6个核苷酸组成的互补序列CGCGCG的质粒T16。
基于OD260值计算制备的质粒DNA的浓度，并且调节到100、101、102或103个拷贝/μl。将1μl具有各种拷贝数的模板DNA之一加入含有以下终浓度的成分的24μl反应混合物32mM HEPES-KOH缓冲液(pH 7.8)、100mM乙酸钾、1％二甲亚砜、0.11％BSA、4mM乙酸镁、每种dNTP各500μM、嵌合寡核苷酸引物c-Ki-ras/12FN3(SEQ IDNO41)和嵌合寡核苷酸引物c-Ki-ras/12RN3(SEQ ID NO42)各30pmol、2.8U BcaBEST(Takara Bio)和2.2U根据WO 02/22831的实施例7描述的方法制备的Afu RNA酶HII。采用Thermal CyclerPersonal(Takara Bio)将反应混合物在55℃温育60分钟。也通过在3％琼脂糖凝胶上电泳而检测反应产物。
结果，当在各个ICAN引物5’末端的上游没有确定的互补序列的质粒T7被用作模板时，仅仅观察到了相当于靶区域大小的带作为扩增产物，稳定的灵敏度是103个拷贝。另一方面，当具有互补于邻接于各个ICAN引物的5’末端的上游区域的序列CGCGCG的质粒T16被用作模板时，观察到了相当于靶区域大小的带和以规则的序列梯样模式存在的高分子量产物，稳定的灵敏度是10个拷贝，表明灵敏度提高。从凝胶切除序列梯样产物，亚克隆到pUC118中的HincII位点，并且进行核苷酸序列确定。然后，发现在序列梯样产物中，靶区域通过各个ICAN引物5’末端上游的区域中的互补序列CGCGCG以相同的方向彼此连接。
如上文所述，由于各个ICAN引物5’末端上游的区域中的互补序列，促进了聚合靶区域的反应，导致灵敏度增加。
各个ICAN引物上游的作为模板的核酸中的区域中的互补序列对ICAN反应的影响(2) 检验了各个ICAN引物5’末端上游的作为模板的核酸中的区域中3个核苷酸组成的互补序列对ICAN反应的影响。选择淋球菌cppB(淋病奈瑟氏菌隐蔽性质粒蛋白(cppB)；GenBank Acc.No.M10316)基因作为检测对象。
按如下方法制备模板。
用淋球菌基因组(购自Summit Pharmaceuticals InternationalCorporation)作为模板，并且采用引物PJDBF(SEQ ID NO43)和引物PJDBR(SEQ ID NO44)进行PCR。对得到的片段平端化，并且插入质粒pUC118(Takara Bio)中的HincII位点。从得到的质粒中选择以下质粒，其中引物PJDBF的方向与M13引物M4(Takara Bio)的方向相同，M13引物M4与pUC118退火。结果，获得了质粒Cp13。
设计引物PJDB0FN3(SEQ ID NO45)和引物PJDB0RN3(SEQ IDNO46)，以便用质粒Cp13作为模板扩增插入的区域。在此情况下，引物PJDB0FN3的靶区域的链不包含序列GTC，该序列与邻接于引物PJDB0RN3的5’末端的上游的3个核苷酸组成的序列GAC互补。该序列存在于引物PJDB0FN3的5’末端的上游的34位核苷酸。检验了所述3个核苷酸组成的序列对ICAN的影响。
基于OD260值计算按上文所述制备的质粒DNA的浓度，并且调节到100、101、102、103、104、105、106、107或108个拷贝/μl。将1μl具有各种拷贝数的模板DNA之一加入含有以下终浓度的成分的24μl反应混合物32mM HEPES-KOH缓冲液(pH 7.8)、100mM乙酸钾、1％二甲亚砜、0.11％BSA、4mM乙酸镁、每种dNTP各500μM、嵌合寡核苷酸引物PJDB0FN3和嵌合寡核苷酸引物PJDB0RN3各30pmol、2.8UBcaBEST(Takara Bio)和2.2U Afu RNA酶HII。采用Thermal CyclerPersonal(Takara Bio)将反应混合物在55℃温育60分钟。也通过在3％琼脂糖凝胶上电泳而检测反应产物。
结果，以高灵敏度(102个拷贝)观察到了相当于靶区域大小的带和以规则的序列梯样模式存在的高分子量产物。从凝胶切除序列梯样产物，亚克隆到pUC118中的HincII位点，并且进行核苷酸序列确定。然后，发现在序列梯样产物中，靶区域通过各个ICAN引物5’末端上游的区域中的3个核苷酸组成的互补序列GAC和GTC以规则模式以相同的方向彼此连接。序列梯样扩增产物包含ICAN引物间的靶区域和规则模式存在的靶区域之间的嵌合寡核苷酸引物PJDB0FN3的5’末端上游的34个核苷酸组成的区域。
如上文所述，证实了由于各个ICAN引物5’末端上游的区域中3个核苷酸组成的互补序列，促进了聚合靶区域的反应，使得能够进行高灵敏度的扩增。此外，证明了如果采用与探针的杂交来检测扩增产物，可以从各个ICAN引物之间的区域和ICAN引物或ICAN引物和ICAN引物5’末端上游的区域中的互补序列之间的区域中选择探针位置。
实施例4使用在5’末端连接了一种6、9或12个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物，所述6、9或12个核苷酸组成的序列与作为逆转录引物的第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-6、-1到-9或-1到-12)退火，从而检验RT-ICAN的灵敏度和检测速度。
首先，基于OD260值计算实施例1-(1)中制备的模板RNA的浓度，并且调节到100、101、102、103、104或105个拷贝/μl。
制备了含有以下终浓度的成分的10μl反应混合物32mMHEPES-KOH缓冲液(pH 7.8)、100mM乙酸钾、1％二甲亚砜、0.11％BSA、4mM乙酸镁、每种dNTP各500μM、1pmol形成序列梯的寡核苷酸引物215R、作为逆转录引物的引物A6-215R(SEQ ID NO47)、引物A9-215R(SEQ ID NO48)或引物A12-215R、50U RTase M-MLV(TakaraBio)和1μl具有各种拷贝数的模板RNAs之一。
将反应混合物置于Thermal Cycler Personal(Takara Bio)，在45℃温育10分钟，然后冷却到4℃。逆转录反应后，将含有以下终浓度的成分的15μl反应混合物加入10μl反应混合物中32mMHEPES-KOH缓冲液(pH 7.8)、100mM乙酸钾、1％二甲亚砜、0.11％BSA、4mM乙酸镁、每种dNTP各500μM、作为第二嵌合寡核苷酸引物的引物B134FN3(16)和作为第一嵌合寡核苷酸引物的引物205RN3(16)各25pmol、11U BcaBEST(Takara Bio)、0.05U Tli RNA酶HII和SYBR Green。用Rotor基因(Corbett Research)在55℃进行ICAN反应，从而以实时方式检测扩增产物。也通过在3％琼脂糖凝胶上电泳而检测反应产物。
当使用在5’末端连接了一种6个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物A6-215R，所述6个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-6)退火时，灵敏度是102个拷贝。所述6个核苷酸组成的序列的连接使检测速度增加了9分钟。
当使用在5’末端连接了一种9个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物A6-215R，所述9个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-9)退火时，灵敏度是102个拷贝。所述9个核苷酸组成的序列的连接使检测速度增加了1.6分钟。
当使用在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物A6-215R，所述12个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-12)退火时，灵敏度是102个拷贝。所述12个核苷酸组成的序列的连接使检测速度增加了3.7分钟。
如上文所述，证实了连接于形成序列梯的寡核苷酸引物的5’末端的、与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域退火的更多个核苷酸组成的序列导致了更高的效率。
实施例5使用在5’末端连接了一种12或18个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物，所述12或18个核苷酸组成的序列与作为逆转录引物的第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-12或-1到-18)退火，从而检验RT-ICAN的灵敏度。
首先，基于OD260值计算实施例1-(1)中制备的模板RNA的浓度，并且调节到100、101、102、103、104或105个拷贝/μl。
制备了含有以下终浓度的成分的10μl反应混合物32mMHEPES-KOH缓冲液(pH 7.8)、100mM乙酸钾、1％二甲亚砜、0.11％BSA、4mM乙酸镁、每种dNTP各500μM、1pmol形成序列梯的寡核苷酸引物205RN3(18)、作为逆转录引物的引物A12-205R或引物A18-205R(SEQ ID NO49)、50U RTase M-MLV(Takara Bio)和1μl具有各种拷贝数的模板RNAs之一。
将反应混合物置于Thermal Cycler Personal(Takara Bio)，在45℃温育10分钟，然后冷却到4℃。逆转录反应后，将含有以下终浓度的成分的15μl反应混合物加入10μl反应混合物中32mMHEPES-KOH缓冲液(pH 7.8)、100mM乙酸钾、1％二甲亚砜、0.11％BSA、4mM乙酸镁、每种dNTP各500μM、作为第二嵌合寡核苷酸引物的引物B134FN3(18)和作为第一嵌合寡核苷酸引物的引物205RN3(18)各25pmol、11U BcaBEST(Takara Bio)和0.05U Tli RNA酶HII。用Rotor基因(Corbett Research)在55℃进行ICAN反应，从而以实时方式检测扩增产物。也通过在3％琼脂糖凝胶上电泳而检测反应产物。
结果，使用引物205RN3的具有逆转录的RT-ICAN的灵敏度是102个拷贝。当使用相同位置的在5’末端连接了一种12个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物A12-205R，所述12个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-12)退火时，或使用相同位置的在5’末端连接了一种18个核苷酸组成的序列的形成序列梯的寡核苷酸引物A18-205R，所述18个核苷酸组成的序列与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域(-1到-18)退火时，灵敏度是101个拷贝，即，提高了一个数量级。此外，证实了通过采用A12-205R或A18-205R进行扩增，获得了以规则的序列梯样模式存在的扩增产物，这是通过引物上游的区域中退火序列进行的连接导致的。
如上文所述，即使改变了与第二嵌合寡核苷酸引物上游的区域退火的核苷酸的数目，仍然发生了通过所述区域导致的序列梯样扩增，使得灵敏度增加。
工业实用性
本发明提供了优于常规等温核酸扩增方法的扩增方法，以及含有用于该方法的引物的组合物和试剂盒。
序列表文字 SEQ ID NO.1逆转录为DNA的SARS冠状病毒基因组RNA的一部分。“核苷酸1-5是HindIII限制位点，核苷酸238-242是BamHI限制位点”。
SEQ ID NO.2称作205RN3(18)的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA，并且用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
SEQ ID NO.3称作A12-205R的设计的寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA。
SEQ ID NO.4称作215R的设计的寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA。
SEQ ID NO.5称作A12-215R的设计的寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA，并且用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
SEQ ID NO.6称作A12-223R的设计的寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA，并且用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
SEQ ID NO.7称作134FN3(18)的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
SEQ ID NO.8称作A12(-10)-215R的设计的寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA，并且用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
SEQ ID NO.9称作A12(-20)-215R的设计的寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA，并且用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
SEQ ID NO.10称作A12(6)-215R的设计的寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA，并且用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
SEQ ID NO.11称作A12(12)-215R的设计的寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA，并且用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
SEQ ID NO.12称作B134FN3(16)的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。“核苷酸14-16是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。“5’末端是用生物素标记的”。
SEQ ID NO.13称作205RN3(16)的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。“核苷酸14-16是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
SEQ ID NO.14称作A6(-10)-215R的设计的寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA，并且用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
SEQ ID NO.15称作A9(-10)-215R的设计的寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA，并且用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
SEQ ID NO.16称作SARS-BNI-B的设计的寡核苷酸引物，用于检测扩增的SARS冠状病毒基因组的一部分。“5’末端是用FITC标记的”。
SEQ ID NO.17称作160FN3的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
SEQ ID NO.18称作241RN3的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。“核苷酸12-14是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
SEQ ID NO.19称作(A12)241RN3的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。“核苷酸18-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
SEQ ID NO.20称作134FN3(16)的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。“核苷酸14-16是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
SEQ ID NO.21称作ICAN-ALDH2-F的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增人类醛脱氢酶2基因的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
SEQ ID NO.22称作ICAN-ALDH2-R的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增人类醛脱氢酶2基因的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
SEQ ID NO.23称作ALDH2 wG探针的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于检测扩增的天然人类醛脱氢酶2基因的一部分。“核苷酸11是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。“5’末端是用ROX标记的，3’末端是用Eclipse标记的”。
SEQ ID NO.24称作ALDH2 mA探针的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于检测扩增的突变人类醛脱氢酶2基因的一部分。“核苷酸11是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。“5’末端是用FAM标记的，3’末端是用Eclipse标记的”。
SEQ ID NO.25称作ALDH2-TH1的设计的寡核苷酸引物，用于扩增人类醛脱氢酶2基因的一部分。
SEQ ID NO.26称作ALDH2-TH2的设计的寡核苷酸引物，用于扩增人类醛脱氢酶2基因的一部分。
SEQ ID NO.27称作ALDH2-TH3的设计的寡核苷酸引物，用于扩增人类醛脱氢酶2基因的一部分。
SEQ ID NO.28称作ALDH2-F的设计的寡核苷酸PCR引物，用于扩增人类醛脱氢酶2基因的一部分。
SEQ ID NO.29称作ALDH2-R的设计的寡核苷酸PCR引物，用于扩增人类醛脱氢酶2基因的一部分。
SEQ ID NO.30称作ALDH2-TH4的设计的寡核苷酸引物，用于扩增人类醛脱氢酶2基因的一部分。
SEQ ID NO.31称作F2的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增肺炎军团菌mip基因的一部分。“核苷酸15-17是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
SEQ ID NO.32称作R2的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增肺炎军团菌mip基因的一部分。“核苷酸15-17是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
SEQ ID NO.33称作Mip4g12探针的嵌合寡核苷酸引物，用于检测扩增的肺炎军团菌mip基因的一部分。“核苷酸4是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。“5’末端是用FAM标记的，3’末端是用Eclipse标记的”。
SEQ ID NO.34称作R2(-13)的设计的寡核苷酸引物，用于扩增肺炎军团菌mip基因的一部分。
SEQ ID NO.35称作R2(-13)A12-1的设计的寡核苷酸引物，用于扩增肺炎军团菌mip基因的一部分。
SEQ ID NO.36称作R2(-13)A12-2的设计的寡核苷酸引物，用于扩增肺炎军团菌mip基因的一部分。
SEQ ID NO.37称作c-Ki-ras/12F的设计的寡核苷酸引物，用于扩增人类c-Ki-ras2基因的一部分。
SEQ ID NO.38称作rasT1R的设计的寡核苷酸PCR引物，用于扩增人类c-Ki-ras2基因的一部分。
SEQ ID NO.39称作rasT14F的设计的寡核苷酸PCR引物，用于扩增人类c-Ki-ras2基因的一部分。
SEQ ID NO.40称作rasT4R的设计的寡核苷酸PCR引物，用于扩增人类c-Ki-ras2基因的一部分。
SEQ ID NO.41称作c-Ki-ras/12FN3的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增人类c-Ki-ras2基因的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
SEQ ID NO.42称作c-Ki-ras/12RN3的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增人类c-Ki-ras2基因的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
SEQ ID NO.43称作PJDBF的设计的寡核苷酸PCR引物，用于扩增淋病奈瑟氏菌cppB基因的一部分。
SEQ ID NO.44称作PJDBR的设计的寡核苷酸PCR引物，用于扩增淋病奈瑟氏菌cppB基因的一部分。
SEQ ID NO.45称作PJDB0FN3的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增淋病奈瑟氏菌cppB基因的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
SEQ ID NO.46称作PJDB0RN3的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增淋病奈瑟氏菌cppB基因的一部分。“核苷酸15-17是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
SEQ ID NO.47称作A6-215R的设计的寡核苷酸PCR引物，用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
SEQ ID NO.48称作A9-215R的设计的寡核苷酸PCR引物，用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
SEQ ID NO.49称作A18-205R的设计的寡核苷酸PCR引物，用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
序列表<110>TAKARA BIO INC.
<120>扩增核酸的方法<130>664878<150>JP 2003-412326<151>2003-12-10<160>49<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>242<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>逆转录为DNA的SARS冠状病毒基因组RNA的一部分。“核苷酸1-5是HindIII限制位点，核苷酸238-242是BamHI限制位点”。
<400>1aagctttctc tatgatgggt ttcaaaatga attaccaagt caatggttac cctaatatgt 60ttatcacccg cgaagaagct attcgtcacg ttcgtgcgtg gattggcttt gatgtagagg 120gctgtcatgc aactagagat gctgtgggta ctaacctacc tctccagcta ggattttcta 180caggtgttaa cttagtagct gtaccgactg gttatgttga cactgaaaat aacacaggat 240cc 242<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作205RN3(18)的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA，并且用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
<400>2agttgcatga cagcccuc18
<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作A12-205R的设计的寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA。
<400>3aaacatatta ggagttgcat gacagccctc 30<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作215R的设计的寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA。
<400>4cagcatctct agttgcat18<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作A12-215R的设计的寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA，并且用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
<400>5aaacatatta ggcagcatct ctagttgcat 30<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作A12-223R的设计的寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA，并且用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
<400>6aaacatatta ggagtaccca cagcatctct 30<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作134FN3(18)的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
<400>7atcacccgcg aagaagcu18<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作A12(-10)-215R的设计的寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA，并且用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
<400>8gggtaaccat tgcagcatct ctagttgcat 30<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作A12(-20)-215R的设计的寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA，并且用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
<400>9tgacttggta atcagcatct ctagttgcat 30<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>称作A12(6)-215R的设计的寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA，并且用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
<400>10ggtgataaac atcagcatct ctagttgcat 30<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作A12(12)-215R的设计的寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA，并且用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
<400>11ttcgcgggtg atcagcatct ctagttgcat 30<210>12<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作B134FN3(16)的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。“核苷酸14-16是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。“5’末端是用生物素标记的”。
<400>12atcacccgcg aagaag 16<210>13<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作205RN3(16)的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。“核苷酸14-16是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
<400>13agttgcatga cagccc 16
<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作A6(-10)-215R的设计的寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA，并且用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
<400>14gggtaacagc atctctagtt gcat 24<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作A9(-10)-215R的设计的寡核苷酸引物，用于从mRNA合成cDNA，并且用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
<400>15gggtaaccac agcatctcta gttgcat 27<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作SARS-BNI-B的设计的寡核苷酸引物，用于检测扩增的SARS冠状病毒基因组的一部分。“5’末端是用FITC标记的”。
<400>16aagccaatcc acgcacgaac 20<210>17<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作160FN3的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
<400>17cgttcgtgcg tggatugg18<210>18<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作241RN3的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。“核苷酸12-14是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
<400>18tagctggaga ggua14<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作(A12)241RN3的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。“核苷酸18-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
<400>19tgacgaatag ctggagaggu a21<210>20<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作134FN3(16)的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。“核苷酸14-16是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
<400>20atcacccgcg aagaag 16<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>称作ICAN-ALDH2-F的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增人类醛脱氢酶2基因的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
<400>21agttgggcga gtacgggcug 20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作ICAN-ALDH2-R的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增人类醛脱氢酶2基因的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
<400>22cagaccctca agccccaaca 20<210>23<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作ALDH2 wG探针的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于检测扩增的天然人类醛脱氢酶2基因的一部分。“核苷酸11是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。“5’末端是用ROX标记的，3’末端是用Eclipse标记的”。
<400>23ggcatacact gaag14<210>24<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作ALDH2 mA探针的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于检测扩增的突变人类醛脱氢酶2基因的一部分。“核苷酸11是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。“5’末端是用FAM标记的，3’末端是用Eclipse标记的”。
<400>24ggcatacact aaag14
<210>25<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作ALDH2-TH1的设计的寡核苷酸引物，用于扩增人类醛脱氢酶2基因的一部分。
<400>25cccggccact ccgcagaccc tcaagcccc29<210>26<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作ALDH2-TH2的设计的寡核苷酸引物，用于扩增人类醛脱氢酶2基因的一部分。
<400>26cccggccact ccagccacca gcagaccc 28<210>27<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作ALDH2-TH3的设计的寡核苷酸引物，用于扩增人类醛脱氢酶2基因的一部分。
<400>27cccggccact ccaggctccg agccacca 28<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作ALDH2-F的设计的寡核苷酸PCR引物，用于扩增人类醛脱氢酶2基因的一部分。
<400>28cagggtcaac tgctatgatg t21
<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作ALDH2-R的设计的寡核苷酸PCR引物，用于扩增人类醛脱氢酶2基因的一部分。
<400>29agcccccaac agaccccaat c21<210>30<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作ALDH2-TH4的设计的寡核苷酸引物，用于扩增人类醛脱氢酶2基因的一部分。
<400>30agccaccagc agaccc 16<210>31<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作F2的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增肺炎军团菌mip基因的一部分。“核苷酸15-17是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
<400>31atggggcttg caatguc 17<210>32<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作R2的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增肺炎军团菌mip基因的一部分。“核苷酸15-17是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
<400>32agtagctaat gatgugg 17<210>33<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作Mip4g12探针的嵌合寡核苷酸引物，用于检测扩增的肺炎军团菌mip基因的一部分。“核苷酸4是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。“5’末端是用FAM标记的，3’末端是用Eclipse标记的”。
<400>33aatggctgca ac 12<210>34<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作R2(-13)的设计的寡核苷酸引物，用于扩增肺炎军团菌mip基因的一部分。
<400>34ccaatgctat aagacaa 17<210>35<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作R2(-13)A12-1的设计的寡核苷酸引物，用于扩增肺炎军团菌mip基因的一部分。
<400>35aacagctgca gtccaatgct ataagacaa29<210>36<211>29<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>称作R2(-13)A12-2的设计的寡核苷酸引物，用于扩增肺炎军团菌mip基因的一部分。
<400>36caccaatttc atccaatgct ataagacaa29<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作c-Ki-ras/12F的设计的寡核苷酸引物，用于扩增人类c-Ki-ras2基因的一部分。
<400>37gactgaatat aaacttgtgg 20<210>38<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作rasT1R的设计的寡核苷酸PCR引物，用于扩增人类c-Ki-ras2基因的一部分。
<400>38aaactattgt tggatcatat tcg 23<210>39<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作rasT14F的设计的寡核苷酸PCR引物，用于扩增人类c-Ki-ras2基因的一部分。
<400>39gcgcggactg aatataaa t tgtgg25<210>40
<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作rasT4R的设计的寡核苷酸PCR引物，用于扩增人类c-Ki-ras2基因的一部分。
<400>40aaacgcgcgc tattgttgga tcatattcg29<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作c-Ki-ras/12FN3的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增人类c-Ki-ras2基因的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
<400>41gactgaatat aaacttgugg 20<210>42<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作c-Ki-ras/12RN3的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增人类c-Ki-ras2基因的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
<400>42ctattgttgg atcatatucg 20<210>43<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作PJDBF的设计的寡核苷酸PCR引物，用于扩增淋病奈瑟氏菌cppB基因的一部分。
<400>43ctttgcttca atgcctcgtt 20
<210>44<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作PJDBR的设计的寡核苷酸PCR引物，用于扩增淋病奈瑟氏菌cppB基因的一部分。
<400>44catcacgcac cgaagcc 17<210>45<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作PJDB0FN3的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增淋病奈瑟氏菌cppB基因的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
<400>45ctttgcttca atgcctcguu 20<210>46<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>称作PJDB0RN3的设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增淋病奈瑟氏菌cppB基因的一部分。“核苷酸15-17是核糖核苷酸，其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。
<400>46catcacgcac cgaagcc 17<210>47<211>24<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>称作A6-215R的设计的寡核苷酸PCR引物，用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
<400>47aaacatcagc atctctagtt gcat 24<210>48<211>27<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>称作A9-215R的设计的寡核苷酸PCR引物，用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
<400>48aaacatattc agcatctcta gttgcat 27<210>49<211>36<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>称作A18-205R的设计的寡核苷酸PCR引物，用于扩增SARS冠状病毒基因组的一部分。
<400>49aaacatatta gggtaaccag ttgcatgaca gccctc3权利要求
1.扩增核酸的方法，该方法包括以下步骤(A)制备选自下组的反应混合物(a)作为模板的核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少两种嵌合寡核苷酸引物、至少一种形成序列梯的寡核苷酸引物和RNA酶H；或(b)作为模板的核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少两种嵌合寡核苷酸引物和RNA酶H；其中嵌合寡核苷酸引物之一作为形成序列梯的寡核苷酸引物，其中每一种嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸和选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的至少一种物质，并且所述核糖核苷酸位于引物的3′末端或3′末端侧，其中所述嵌合寡核苷酸引物至少包含第一嵌合寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，所述第一嵌合寡核苷酸与作为模板的核酸的核苷酸序列互补，所述第二嵌合寡核苷酸引物与作为模板的核酸的核苷酸序列同源，并且其中形成序列梯的寡核苷酸引物具有与作为模板的核酸的一个区域和/或所述区域下游的核苷酸序列互补的序列，所述区域与第一嵌合寡核苷酸引物互补，并且所述形成序列梯的寡核苷酸引物在其5′侧具有与以下序列互补的序列第二嵌合寡核苷酸引物5′侧的、与作为模板的核酸同源的核苷酸序列；作为模板的核酸的一种核苷酸序列，该核苷酸序列相应于与第二嵌合寡核苷酸引物同源的部分的5′末端上游的区域；或这两者；以及(B)在恒温条件下将反应混合物温育足够的时间以产生序列梯样扩增产物，在所述条件下发生引物与作为模板的核酸的特异性退火、通过DNA聚合酶合成延伸链的反应和链置换反应、以及通过RNA酶H切割延伸链的反应。
2.权利要求1的方法，其中作为模板的核酸是RNA，并且事先用脱氧核糖核苷三磷酸、具有逆转录活性的DNA聚合酶和至少一种形成序列梯的寡核苷酸引物处理核酸，以便将核酸转化为逆转录产物。
3.权利要求1的方法，其中步骤(A)中的反应混合物进一步含有具有逆转录活性的DNA聚合酶。
4.权利要求2或3的方法，其中作为模板的核酸是mRNA。
5.权利要求2或3的方法，其中具有逆转录酶活性和链置换活性的单一的DNA聚合酶作为具有逆转录酶活性的DNA聚合酶和具有链置换活性的DNA聚合酶。
6.用于权利要求1的扩增核酸的方法的组合物，所述组合物含有至少一种嵌合寡核苷酸引物和/或至少一种形成序列梯的寡核苷酸引物。
7.用于权利要求1的扩增核酸的方法的试剂盒，所述试剂盒含有至少一种嵌合寡核苷酸引物和/或至少一种形成序列梯的寡核苷酸引物。
8.检测靶核酸的方法，该方法包括以下步骤(a)根据权利要求1的扩增核酸的方法扩增靶核酸；和(b)检测上述步骤中扩增的靶核酸。
9.用于权利要求1的扩增核酸的方法的寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物在其5′侧具有与以下序列互补的序列引物5′侧的、与作为模板的核酸同源的核苷酸序列；作为模板的核酸的一种核苷酸序列，该核苷酸序列相应于与第二嵌合寡核苷酸引物同源的部分的5′末端上游的区域；或这两者。
全文摘要
当模板核酸具有彼此基本相同的序列时，在这些序列之间的区域中设计了引物，从而产生具有序列梯结构的产物，其中通过ICAN反应中的相同序列，靶区域在单一序列中聚合。通过采用嵌合寡核苷酸引物和含有特定碱基序列的形成序列梯的寡核苷酸引物，可以主动形成具有序列梯结构的扩增产物，从而可以提高ICAN反应的灵敏度、扩增效率和反应速度。
文档编号C12Q1/68GK1890368SQ20048003631
公开日2007年1月3日 申请日期2004年12月6日 优先权日2003年12月10日
发明者上森隆司, 武田理, 山本纯子, 向井博之, 浅田起代藏, 加藤郁之进 申请人:宝生物工程株式会社