其上设置有定位分子的器件及其制备方法

专利名称：其上设置有定位分子的器件及其制备方法
技术领域：
本发明涉及产生具有选定的活性化学区域的基板的方法，通过利用基板的各元件来帮助活性化学基团在期望的基板区域中的定位。描述了各种方法，包括用于沉积、去除、 激活和/或灭活在基板选定区域中的化学基团的光学、化学和/或机械过程，以提供基板的选定活性区域。
背景技术：
许多分析操作都会受益于对单个分子、相对少量分子、或较低浓度分子的反应进行分析的能力。已描述了许多方法用于提供这些散在的反应混合物。例如，在核酸测序领域，许多研究者建议联合聚合酶的作用下的核酸的模板依赖性合成，由单个分子或低浓度方法来获取序列信息。这些测序技术的各种不同方法提供了一次监测仅仅一种或很少的合成反应的不同方法。例如，在一些情况下，将反应混合物分配成包含低浓度反应物的液滴。在其他应用中，将一些反应物固定在表面上，从而监测它们而不会受到溶液中其他反应组分的干扰。 在另一种方法中，采用光学限制技术，在光限制区域内，仅由相对少量的反应(例如单个分子)来探究信号信息。尽管可获得上述技术，仍然存在需要进一步提高用于分析的反应组分的选择性的情况。本发明满足了这些和许多需要。

发明内容
本发明一般提供了在基板的选定区域内提供功能性表面修饰(例如活性化学基团)的方法，提供了由此制备的基板以及这种基板的应用。第一方面，本发明提供了制备其上具有选定活性区域的基板。该方法包括提供其上具有许多纳米结构的基板，其中，每个纳米结构限制第一激活控制剂在基板表面的选定部分上提供活性化学基团的能力。然后使该基板与至少第一激活控制剂接触，以在基板表面的选定部分上选择性地提供活性化学基团。活性化学基团包括例如化学官能团，活性分子(例如酶)以及偶联基团或结合基团。在另一相关方面，本发明提供了制备其上具有选定活性区域的分析用基板的方法。该方法包括提供其上设置有光学分析结构的基板，所述光学分析结构提供通往基板选定区域的增强的光学通路。然后提供能够通过第一电磁辐射被激活或灭活的表面官能团， 所述电磁辐射导向基板，从而使光学分析结构介导电磁辐射，以选择性地激活或灭活在基板选定区域中的表面官能团以选择性地提供基板活性区域。本发明另一方面的特征在于提供一种方法，该方法提供活性化学表面基本上在波导的底部的零模式波导。该方法包括提供设置在基板中的零模式波导，提供在零模式波导表面上的化学官能团，以及使零模式波导表面上的第一部分而非第二部分与激活控制剂接触，所述激活剂选择性地激活或灭活在第一部分上的化学官能团，以提供基本上在零模式波导底部的活性化学表面。本发明还提供了采用这种方法制备的基板和装置，其包括零模式波导阵列，该阵列包括许多位于包层中的零模式波导芯体以及基本上只位于芯体中的化学活性表面，所述各芯体具有底面。本发明还提供了产生其上设置有选定活性区域的基板的方法，该方法包括提供其上具有光学增强结构的基板，所述光学增强结构能够导入电磁辐射，以在基板的选定区域近端提供增强的电磁场，足以在选定区域近端产生俘获力(trapping force) 0电磁辐射导向基板以在选定区域提供增强的电磁场，该电磁场足以对选定区域近端的活性分子产生俘获力。然后活性分子偶联于该选定区域。本发明还提供了制备其上设置有选定活性区域的基板的方法，该方法包括提供表面具有化学官能团和许多离散的纳米级反应区域的基板，和使一个或多个化学官能团或激活控制剂在选定区域的表面上图案化，以提供基本上仅在离散的纳米级反应区域中的化学功能性区域。本发明的另一方面提供了鉴别核酸分子序列的方法。该方法包括在基板上的离散观察区域内提供多种核酸聚合酶/模板/引物复合物，以及以模板依赖性方式检测核苷酸或核苷酸类似物的序列增加，以鉴别结合到多个观察区域中的核苷酸或核苷酸类似物的序列。在该方法中，基板被构造成能显著减少观察区域之外的区域中的聚合酶活性、聚合酶存在、模板存在及引物存在中的一种或多种情况。相关地，本发明提供了鉴别核酸分子序列的方法，该方法包括在基板表面离散的观察区域内提供多种核酸聚合酶/模板/引物复合物，以及以模板依赖性方式检测核苷酸或核苷酸类似物的序列增加，以鉴别结合到多个观察区域中的核苷酸或核苷酸类似物的序列。在该方法中，基板表面上至少第一和第二离散观察区域之间提供观察区域内屏障，以基本上避免一种或多种反应物或产物在观察区域内扩散。本发明还提供了使期望的分子优先定位在基板上设置的光限制区内的方法。该方法包括将期望的分子沉积在基板表面上，和选择性地去除不在光限制区内的基板表面上的期望分子。一方面，基板包括不透明(非透明性)层和透明层，光限制区包括设置穿过不透明层至透明层的零模式波导。从基板不在光限制区内的表面选择性地去除期望分子任选地包括使所述基板与偶联排他性组分(exclusionary component)的灭活组分相接触，所述排他性组分至少部分地被排斥而不能进入光限制区。灭活组分去除可从表面(例如零模式波导芯体的上表面和上壁)接近的分子；由于排他性组分而不能进入光限制区，或光限制区实体。在一类实施方式中，灭活组分包括酶，例如蛋白酶(例如非特异性和位点特异性蛋白酶)、核酶或糖酶。排他性组分任选地是大颗粒如珠、大分子、或刚性或半刚性的长形聚合物。在一类实施方式中，排他性组分包括双链核酸分子，例如偶联于蛋白酶灭活组分的双链DNA分子。能选择性地固定的期望分子可以是基本上任何分子，例如活性分子如酶(例如， 核酸聚合酶)或包含结合或偶联部分的分子(例如生物素分子)，又可利用这些分子来固定其他分子。进一步提供了将分子定位到设置在基板上的光限制区内的方法，该方法包括在基板表面上，包括光限制区内提供光活化的偶联基团。然后使活化辐射导向基板，其中，光限制区使活化辐射仅入射在光限制区内。然后，分子与光活化偶联基团偶联。本发明的另一方面提供了将感兴趣的分子选择性地固定在基板上的方法。该方法包括提供基板，它具有第一表面组分和第二表面组分，所述第一和第二表面组分具有不同的表面特征，以及基于第一表面组分的表面特征与第二表面组分的表面特征之间的差异， 使感兴趣的分子选择性地偶联于第一表面组分。在一类实施方式中，不同的表面特征包括表面电荷或表面上的静电相互作用。例如，第一表面组分具有或获得负表面电荷，而第二表面组分为正表面电荷(反之亦然)。另一个例子中，表面组分具有不同的表面化学吸附特征；例如，第二表面组分对特定基团(例如，膦酸盐/酯(phosphonate)或磷酸盐/酯(phosphate)基团)具有强化学亲和力，而第一表面组分对该基团没有强的亲和力。可采用该方法将感兴趣的分子选择性地固定在诸如ZMW或其他复合基板(hybrid substrate)上。因此，例如，基板可任选地包括在第一表面组分层上的第二表面组分层，设置的零模式波导穿过第二表面组分层到达第一表面组分层。在这种实施方式中(及其他)， 第一表面组分可包括S^2和/或第二表面组分可包括金属或金属氧化物(例如，铝或氧化铝)。在复合基板与溶液相接触的实施方式中，基板可包括第一表面组分和/或第二表面组分，第一表面组分的材料的零电荷点在溶液的PH以下(例如，SW2的PH > 2)，第二表面组分包括金属氧化物，其零电荷点在溶液的PH之上(例如氧化铝pH< 8 ；中性pH下带正电的其他金属氧化物，包括但不限于氧化铊、氧化铁、氧化钇、氧化锌、氧化镧和氧化镁)。在某些实施方式中，感兴趣的分子优选与第一表面组分缔合。例如，正电荷的聚合酶分子优先与负电荷硅酸盐缔合而不是正电荷金属表面。在其他实施方式中，基板与第一组合物相接触，基于第一和第二表面组分的表面特征之间的差异，第一组合物选择性地与第一表面组分缔合。第一组合物可起阻断作用，或者它可直接或间接与感兴趣的分子缔合。 因此，例如，在一类实施方式中，第一组合物包含第一偶联基团，使感兴趣的分子选择性地偶联于第一表面组分包括使感兴趣的分子与第一偶联基团(例如，化学官能团、结合基团如生物素等)偶联。在一类实施方式中，第一组合物包含硅烷，例如用于选择性地与硅酸盐第一表面组分缔合。示例性的硅烷包括但不限于生物素-PEG-硅烷。在另一类实施方式中，第一组合物包含磷脂。在另一类实施方式中，第一组合物包含多聚赖氨酸-PEG或多聚赖氨酸-PEG-生物素。该方法任选地包括使基板与第二组合物相接触，根据第一表面组分和第二表面组分的表面特征之间的差异，第二组合物选择性地与第二表面组分缔合。用第二组合物处理可任选地在使感兴趣的分子与第一表面组分偶联之前或之后进行，包括用任何第一组合物处理之前或之后。在一些实施方式中，第二组合物包含通常不同于任何第一偶联基团的第二偶联基团。示例性的第二组合物包括例如聚电解质和聚电解质-PEG-共聚物。该方法任选地包括在第二表面组分上沉积聚电解质的多层。其他示例性的第二组合物包括包含一种或多种膦酸或一种或多种磷酸盐/酯基团的化合物。例如，第二组合物可包含聚乙烯基膦酸；2-羧乙基膦酸；氨基三(亚甲基膦酸)；ι-羟基亚乙基-ι，ι-二膦酸；六亚甲基二胺四(亚甲基膦酸)；二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)；乙二胺四(亚甲基膦酸)；二(六亚甲基三胺五(亚甲基膦酸))；2-膦酰基丁烷-1，2，4-三羧酸；或单乙醇胺二膦酸酯。作为其他例子，第二组合物可包括磷酸烷基酯或膦酸烷基酯，例如辛基膦酸、癸基膦酸、十二烷基膦酸、十六烷基膦酸、十八烷基膦酸、 二十二烷基膦酸、羟基-十二烷基膦酸、羟基-十一烷基-膦酸、癸二基二(膦酸)、磷酸十二烷基酯或羟基-磷酸十二烷基酯。这两种表面组分可通过不同组合物进行差异性改性。因此，在一类实施方式中，该方法包括使基板与能够选择性地缔合第一表面组分的第一组合物接触，并使感兴趣的分子偶联于第一组合物，以使感兴趣的分子与第一表面组分选择性地偶联，和使基板与能够选择性地缔合第二表面组分的第二组合物相接触(在感兴趣的分子偶联或第一组合物沉积之前或之后)。在另一方面，本发明提供了将感兴趣的分子选择性地沉积在基板的选定区域上的方法，该方法包括提供具有第一组分和第二组分的基板，第一组分包括导电材料，第二组分包括绝缘体；和对第一组分施加电势以增加或减少感兴趣的分子与第一组分表面的缔合。


图1显示了应用中的零模式波导(ZMW)的示意图。图2提供了本发明光导向表面活化过程的示意图。图3提供了在光限制区如ZMW的光学相关部分中提供活性表面的过程是示意图。图4提供了两个独立的活化阶段中，表面活性水平随距ZMW底面的距离变化的模拟图。图5提供了使用两步活化过程的交替光活化方案的示意图。图6提供了在限制结构内提供活性表面的扩散限制性过程的示意图。图7提供了在基板的非相关表面上提供印刷的掩蔽层的过程的示意图。图8提供了从基板表面的非相关部分除去活性基团的光致开裂过程的示意图。图9示意性地显示了从基板表面的非相关部分除去感兴趣的分子的基于尺寸排阻颗粒的过程。图10显示了使用电驱动系统来选择性固定感兴趣的分子。图11示意性地显示了使用夹带基质(entraining matrix)然后通过顶离(lift-off)发射技术从基板的非相关表面除去分子的过程。图12显示了具体使用尺寸排阻颗粒过程的本发明选择性固定过程的效果。图13示意性地显示了使用交替排他性过程来选择性定位分子的过程。图14示意性地显示了使用排他性过程来选择性定位分子的示例过程，其中，位点特异性灭活组分从基板去除感兴趣的分子。图15示意性地显示了使用排他性过程来选择性定位分子的示例过程，其中，位点特异性灭活组分从基板去除偶联部分。图16示意性地显示了利用复合基板如ZMW中不同材料的不同表面特征并用 PE-PEG共聚物钝化来选择性固定感兴趣的分子。图17示意性地显示了聚电解质多层的形成。图18示意性地显示了利用复合基板如ZMW中不同材料的不同表面特征并用聚电解质多层钝化来选择性固定感兴趣的分子。图19显示了核苷酸类似物与聚电解质多层处理和等离子体-PDMS处理(非偏置处理)表面结合的比较。图20显示了聚合酶与聚电解质多层处理的和未处理的铝表面结合的比较。图21显示了具体使用选择性硅烷化和聚电解质多层钝化过程的本发明选择性固定过程的效果。图22显示了具体使用选择性硅烷化和聚电解质多层钝化过程的本发明选择性固定过程的效果。图23显示了中性亲和素(neutravidin)涂覆的荧光珠与经膦酸酯-处理的ZMW 和未处理的ZMW结合的比较。图M显示了核苷酸类似物与经膦酸酯-处理的ZMW和未处理的ZMW结合的比较。示意图不是按比例绘制的。
具体实施例方式I.本发明的一般描述本发明一般涉及在基板上或设定容积内的预先选择的位置或区域中提供期望分子的方法和过程，涉及该方法或过程制备的制品，具体地，涉及光限制区内期望的低浓度或单个分子。在特别优选的方面，本发明涉及使单个分子定位在特定空间或容积内的方法，从而利用分子的空间个体性，例如化学、光学、电学等性质。本发明还提供了由上述过程制备的基板、装置、接受器等，例如光限制区。虽然本发明的方法可广泛地用于在多种给定的期望空间或容积类型的任一种内提供单个分子，在特别优选的方面，该方法可用于使期望分子(例如酶)选择性地沉积或固定在光限制区的光可到达部分，特别是零模式波导(ZMW) 内。通常，可采用光限制区从只有非常小的空间或体积提供电磁辐射或产生这种辐射。这种光限制区可包括结构限制区，例如孔、凹陷、管等，或者它们可包括结合其他组分的光过程，以向只有非常小的体积提供光照或从只有非常小的体积产生发射的辐射。这种光限制的例子包括使用如基于光系统的全内反射(TIR)的系统，从而将光以一定角度导向通过透明基板，在基板内产生全内反射。虽然产生TIR，但还有一些小部分的光将穿透基板外表面，并根据距基板表面的距离而快速衰减，导致在表面上非常小体积的光照。类似地， 可采用ZMW结构，该结构利用沿包层设置的窄芯体，例如10-100纳米，所述芯体的尺寸能够避免期望的电磁辐射传播通过芯体。结果，辐射从芯体开口处起只透入芯体中非常短的距离，因而仅仅光照在芯体内非常小的体积。考虑了许多其他的光限制技术，包括例如通过尖锐金属尖端的场增强，纳米管限制区、薄狭缝限制区、近场共振能传递限制区、近场孔限制区、衍射限制的光限制区和刺激发射损耗限制区，以及在待批的美国专利申请序列第 10/944，106号和第09/572，530号以及美国专利6，917，726中描述的所有其他限制区，这些申请的内容全文纳入本文作为参考。零模式波导(ZMW)的一般特征在于，存在被包层包围的芯体，其中，芯体的尺寸能够阻止显著量的超出截止频率的电磁辐射传播通过芯体。结果，当用频率低于截止频率的光进行光照时，光仅能透入芯体中很短的距离，只能对芯体体积的小部分进行有效光照。根据本发明，芯体包括被包层包围的空的空穴或优选填充流体的空穴。该芯体提供其中可发生化学、生物化学和/或生物学反应的区域或体积，特征在于具有极小的体积，并且在一些情况下足以包括仅仅单个分子或一组反应分子。ZMW、其制造、结构以及在分析操作中的应用的详细内容参见美国专利6，917，7 和Levene等人的kience 299(5607) 609-764(2003)，其全部内容纳入本文作为参考。在ZMW及其他光限制内的化学和生物化学分析的情况下，显然需要确保关注的反应在所述限制的光学询问部分内以最小程度进行，优选在单独的限制的询问部分内仅进行单个的反应。通常可采用许多方法在观察容积内提供单独的分子。2005年9月30日提交的美国专利申请第11/240，662号描述了许多这种方法，其内容被纳入本文作为参考，该申请描述了设计改性的表面，将单独的分子以所需密度固定到表面上，使大约一个、两个、三个或一些其他选定数量的分子能够落在指定的观察体积内。典型地，这类方法采用稀释技术，在表面上提供相对低密度的偶联基团，即通过稀释表面上的这些基团或者稀释与关注的分子相互作用的中间基团或最终偶联基团，或者这两种方式的组合。在一些情况下，还希望从观察体积外的其他区域，例如观察体积之内和之外在总的基板外壳ZMW上、包层上等减少或者甚至消除关注的反应。具体说，在询问范围之外的反应可能影响关注的反应或该对反应的监测，这种影响是通过反应物的损耗影响反应动力学，增加产物浓度，有利于信号本底噪声能级发生的，例如通过产生产物或消耗反应物，这样可能干扰被询问的反应，或者提供扩散进入或者离开波导的询问区的过度可检测的背景产物水平。因此，将反应组分选择性和优选沉积和/或固定在观察区内对本发明尤其有益。 这些通常适合用作上文所述的低浓度沉积方法的替代方式，优选用作除该方法之外的额外方式。在上述内容中，感兴趣的分子可优先位于特定区域中，或基本上定位在给定的区域中。应理解，使用该术语优先表示该分子以超过非优先定位的其他位置的浓度或表面密度定位在给定位置中。因此，第一区域中给定分子的优先固定表示该分子在该区域中的密度或浓度比其他区域更高。这些区域中的密度比其他区域中的浓度或密度高20%以上、30% 以上、50%以上、100%以上、或高达200%、一直到1000%或更高，在一些情况下，在100倍以上、1000倍以上或更高。类似的涵义通常适用于表示给定分子基本上仅位于给定区域中。例如在用于单个分子酶分析的ZMW的情况下，希望在波导光照区内提供单个酶分子，优选在波导的底部或底面上。如上所述，进一步希望确保除底面之外的其他表面上，例如芯体的壁和/或不是芯体部分的包层表面上等不存在额外的酶分子。本发明方法制备的基板尤其有价值的应用是在称为“单个分子测序应用”的过程中。通过例子的方式，监测模板核酸、引物序列和聚合酶的复合物，基于单个分子，观察新生链的模板依赖性合成过程中每个额外的核苷酸的结合。通过鉴别各个增加的碱基，可鉴别模板中的互补碱基，因而读取该模板的序列信息。在ZMW的情况下，在ZMW观察体积内提供单独聚合酶/模板/引物复合物。随着四种标记(例如荧光)的核苷酸或核苷酸类似物中的每一种掺入合成链，通过相关的光学检测系统将观察到这种核苷酸或核苷酸类似物上标记的延长存在。这种测序过程和检测系统在2005年8月11日提交的美国专利申请第 2003/0044781号和待批的美国专利申请第11/201,768号中描述，将其全部内容纳入本文作为参考。认为单个分子的测序应用将受益于本文所述的方法，所述方法包括将聚合酶、模板或引物或这些物质中的任一种或所有物质的复合物优先选择性地固定在基板的选定区域内，和/或基本上不在基板的其他部分上。通常，在给定位置，例如ZMW的光照体积内，选择性提供感兴趣的分子可采用加法或减法过程来实现。加法过程通常表示，将单个分子定位或沉积在期望的位置上而不是其他位置。相反，减法过程表示，感兴趣的分子无所不在且非选择性地沉积在(例如)整个基板表面上，然后从不期望的位置选择性地去除感兴趣的分子。虽然这些描述提供了描述各种过程的便利，但应理解，一个过程的结果与另一过程的结果没有区别。还应理解，许多过程可包括加法、减法或这两种方法所述的步骤。虽然一般在酶或其他大分子基团的定位方面进行描述，但为本发明的目的，感兴趣的分子可以是希望提供空间个体性或提高定位的各种不同的官能性分子中的任一种。这些基团包括活性分子，例如催化分子如酶，而且包括具有更多钝态官能的分子，例如非催化基团，例如结合或偶联基团、疏水或亲水基团、结构增强基团如促进粘合的基团、可活化或可灭活的基团等。结合或偶联基团可包括小分子偶联基团或者它们可包括大分子偶联基团，例如抗体、抗体片段、特异性结合对如亲和素/生物素、结合肽、凝集素、互补核酸、或各种其他结合基团中的任一种。催化活性分子通常包括希望具有空间个体性的催化活性分子，例如用于单个分子分析中等。至少一方面，本发明涉及提高离散反应区和/或观察区域的隔离。这不仅提供了这些区域间的光学隔离，而且提供了这些区域的化学隔离和/或环境隔离。广义上， 这可通过在反应区域和/或观察区域之间提供阻挡或区域来实现，可以基本上防止反应物和/或产物从特定反应区外扩散进入并且潜在地干扰特定反应区内进行的反应，或者该区域的观察。提供必要隔离时，关注以下一点或两点(1)在相邻反应区/观察区域之间提供足够的分离/隔离；和(2)从相邻区域间的间隔内消除任何潜在的干扰组分， 例如清除该间隔内的任何反应物、产物和/或酶，并在观察区之间产生一种“非武装区域 (demilitarizedzone)，，。提供增强的隔离通常涉及在观察区之间提供一定形式的阻挡。通常，这种阻挡可简单地包括在流体系统中的足够的距离，使反应物和产物不能从一个反应区扩散进入特定的观察区域，不论反应是在观察区域附近或是位于其他一些位置。提供的距离可跨平面基板或者可以通过在基板上提供结构化或轮廓化的表面来增加有效扩散距离。例如，在尤其优选的方面，可以在纳米孔内提供离散反应区/观察区域，以有效增加所述区域间的距离， 并且处理或产生这种基板，以降低或消除选定区域之间的间隔或区域中，例如纳米孔底面处或面向纳米孔底面之外的表面中存在或正在产生的任何反应物和/或产物。II.加法过程如上所述，在至少一个方面，采用加法过程来提供本发明期望的固定化分子。该加法过程通常依赖于在期望位置选择性地提供结合或偶联基团，然后使感兴趣的分子沉积。 同样，沉积也可以是加法或减法过程的结果。至少在第一方面，本发明加法过程通常包括使偶联基团沉积在基板表面上，偶联基团只在表面的期望的区域内(例如光限制如ZMW的观察区域内)选择性地结合感兴趣的分子。官能基团(包括可活化的官能团)与表面的偶联通常可通过本领域已知的各种方法中的任一种来实现。例如，在基于二氧化硅的基板的情况下，例如玻璃、石英、熔融二氧化硅、硅等，可利用充分表征的硅烷化学将其他基团偶联于表面。这些其他基团包括官能团、 可活化的基团和/或这两种基团任一个的连接分子、或意图用于表面最终应用中的实际感兴趣的分子。在其他基板类型例如聚合物材料、金属等的情况下，可采用其他过程，例如使用杂化聚合物表面，该表面具有与其偶联或从其延伸的官能团，使用如具有与其偶联的官能团的共聚物、金属缔合性基团(即螯合剂)、巯基化合物等。至少在本发明的第一方面，仅在期望的区域内提供感兴趣的分子的偶联通常是通过以下方式进行，即提供与整个基板的表面偶联的可活化的偶联基团，该基团只在期望的区域内选择性活化，或者使用可选择性灭活的偶联基团并在除期望区域之外的所有区域内选择性地灭活该基团。只在期望的区域选择性地提供活性偶联基团的方式，使感兴趣的分子能够基本上仅在期望区域内选择性地沉积和偶联。为了便于描述，对于给定应用希望选择性地提供感兴趣分子的表面或基板部分在这里称为“期望的区域”，而这些区域之外的区域则称为非期望区域。这种期望和非期望的区域可包括平面或者可包括三维结构，如孔、凹陷、表面不规贝IJ、支柱、柱、沟渠、凹槽、通道、毛细管、多孔材料等。许多不同的可活化偶联基团可与本发明该方面联用。通常，这些基团包括用可选择性去除的基团封端或保护的偶联基团。这些基团包括热可变基团，例如不耐热的保护基团，化学可变基团，例如酸或碱不稳定的保护基团，以及光可变基团，例如光分解或可去除的保护基团。对在例如非期望区域中的偶联基团灭活包括使用可直接选择性灭活的基团，例如通过使用能俘获官能团或导致官能团去除的热、化学或光诱导的化学，即通过光诱导的交联、光致裂解等。或者，在某些优选的方面，这种灭活方法采用选择性活化在非期望区域中的偶联基团，然后用中性或惰性的封闭基团(blocking group)例如基本上不能与感兴趣的分子偶联的基团，或者中间连接分子来保护或封端所得活性偶联基团，然后在偶联条件下使所述基团偶联于期望的区域。这种随后加入的封闭基团是不可逆的或是可逆的。然而， 这种封端的可逆性如果存在，通常将涉及不同于潜在的可活化偶联基团的机制，以避免在非期望区域中的封端基团再活化，同时活化期望的区域中潜在的可活化基团。例如，采用光活化方案来选择性地激活在期望的区域中的基团时，应用于非期望区域的封端基团通常不会光活化，或因为应用中表面接触的任何条件而活化。将非期望区域中的偶联基团封端之后，期望的区域或感兴趣的区域内的偶联基团可选择性地活化而与感兴趣的分子偶联。为了便于讨论，无论光活化涉及封闭基团的光致裂解还是通过改变化学结构而不去除较大的封闭基团本身，例如导致改性的基团或其他基团的加入，来实现光活化，在这里都将通常称为活化，例如光活化。在至少一个尤其优选的方面，使用光致活化的偶联基团以将感兴趣的分子选择性地沉积在期望区域中，例如采用能够用光不稳定的保护基团封端的化学活性偶联基团。这种光致活化的偶联机制尤其适用于采用光限制的系统，使得用于观察最终关注的反应和用于活化偶联基团的光只能照射在期望的区域，例如最接近芯体开口处的ZMW区域，光通过该开口光照该芯体。具体说，因为导向ZMW的激活光将只能照射有限的区域，例如光照区， 所以感兴趣的分子将基本上只在光照体积内选择性地偶联。需要重申的是，相同的光限制效应过去仅用于监测光照体积的小限制区(在设置ZMW的可应用的分析操作中通常基本上限定出的观察区)内的反应，类似地只允许在ZMW的相同限制体积或部分内的活化(及后续偶联)。应理解，通过调制活化辐射，可以将活化期间的光照体积进一步控制在比应用期间的光照体积要小的体积。具体说，通过应用较低能量的光照，采用比光照/问询光更长波长的活化光，可以对光照的分子进行光照、活化，并使其只偶联于在最终的应用中最终位于光照体积内的表面子集。在本发明的许多具体方面，通常优选采用能使电磁辐射选择性地导向期望区域的基板，在该基板的最终应用方面，例如在这些基板上查询化学、生物化学和/或生物学反应，以及提供选择性活化表面用于感兴趣的分子在所述分析期间选择性地固定在利用区域。总之，采用最终应用中使用的基板的基础功能，并利用该功能来改善所述应用中基板的制造和加工。在定向辐射的内容中，使用相同的辐射导向性质，对用于使辐射聚焦在期望区域以查询该区域内的反应的基板进行产率，使该期望的区域选择性地功能化。根据后续沉积在基板上和偶联于基板的感兴趣的分子的性质，本发明可使用许多不同的偶联基团。例如，偶联基团可包括功能性化学部分，例如胺、羧基、羟基、巯基、金属、 螯合剂等。可选地或额外地，可包括特定的结合元件，例如生物素、亲和素、抗生物素蛋白链菌素、中性亲和素、凝集素、SNAP-标签TM或底物(考凡利生物科学AG公司(Covalys Biosciences AG) ；SNAP-标签TM是一种基于哺乳动物06-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶的多肽，SNAP-标签底物是苄基嘌呤和嘧啶的衍生物)、缔合或结合的肽或蛋白质、抗体或抗体片段、核酸或核酸类似物等。此外或可选地，偶联基团可用于与感兴趣的分子偶联或结合的其他基团偶联，在一些情况下这些其他基团包括化学官能团和特定的结合元件。通过例子的方式，使光致活化的偶联基团，例如光致活化的生物素沉积在基板表面上并在给定区域中选择性地激活。然后，中间结合剂，例如抗生物素蛋白链菌素可与第一偶联基团偶联。 然后，感兴趣的分子(在具体的例子是生物素化的)偶联于抗生物素蛋白链菌素。本发明该方面中采用的光不稳定的保护基团可包括多种已知的可光致裂解的保护基团，包括例如硝基藜芦基、1-芘基甲基、6-硝基藜芦氧基羰基、二甲基二甲氧基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基、甲基、甲基-6-硝基胡椒氧基羰基、2-氧亚甲基蒽醌、二甲氧基苄氧基羰基、5-溴-7-硝基二氢吲哚基、ο-羟基-α -甲基肉桂酰基以及它们的混合物，如美国专利5，412，087和5，143，854所述，将其内容全部纳入本文作为参考。光致活化的偶联基团与感兴趣的表面的偶联可通过许多本领域已知的方法来实现。例如，光保护或可活化的基团可包括羧基，它通过表面上的羟基发生偶联或者通过连接基团(例如PEG分子)与表面相连。或者，光致活化的基团上的胺基可偶联于结合环氧基的表面。或者，预先与连接分子(例如PEG基团)偶联的可活化的基团可通过已知方法进行硅烷化并直接附连于表面。下面显示了上述偶联方案中使用的化合物的例子，例如使用MeNPOC保护的生物
素
权利要求
1.一种将酶选择性固定到基板上的方法，所述方法包括提供基板，所述基板包括第一表面组分和第二表面组分，所述第一和第二表面组分具有不同的表面特征，其中，所述基板包括位于所述第一表面组分层上的第二表面组分层，所述基板包括设置成穿过所述第二表面组分层到达所述第一表面组分层的零模式波导；使所述基板与第一组合物接触，并使所述酶与所述第一组合物偶联，从而选择性地将所述酶偶联到所述零模式波导中的第一表面组分，其中所述第一组合物选择性地与所述第一表面组分缔合；和使所述基板与第二组合物接触，所述第二组合物选择性地与所述第二表面组分缔合， 其中所述第二组合物包括含有一种或多种膦酸基团或一种或多种磷酸盐/酯基团的化合物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一表面组分包括SiO2,所述第二表面组分包括金属或金属氧化物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不同的表面特征包括表面电荷，所述第一表面组分具有负表面电荷，所述第二表面组分具有正表面电荷。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一组合物包括第一偶联基团，将所述酶选择性地偶联于所述第一组合物包括使所述酶与所述第一偶联基团偶联。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一偶联基团包括生物素。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一组合物包括硅烷。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一组合物包括生物素-PEG-硅烷。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一组合物包括磷脂。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一组合物包括聚(L-赖氨酸)-聚(乙二醇)或聚(L-赖氨酸)_聚(乙二醇)_生物素。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二组合物是聚乙烯基膦酸。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二组合物选自下组
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二组合物选自下组2-羧乙基膦酸； 氨基三(亚甲基膦酸)；1-羟基亚乙基-ι，ι-二膦酸；六亚甲基二胺四(亚甲基膦酸)；二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)；乙二胺四(亚甲基膦酸)；二(六亚甲基三胺五(亚甲基膦酸))；2-膦酰基丁烷-1，2，4-三羧酸；和单乙醇胺二膦酸酯。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二组合物包括磷酸烷基酯或膦酸烷基酯。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二组合物选自下组辛基膦酸、癸基膦酸、十二烷基膦酸、十六烷基膦酸、十八烷基膦酸、二十二烷基膦酸、羟基-十二烷基膦酸、羟基-十一烷基-膦酸、癸二基二(膦酸)、十二烷基磷酸酯或羟基-十二烷基磷酸酯。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二组合物包括第二偶联基团。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶是聚合酶。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述基板与所述第二组合物接触，然后与所述第一组合物接触。
18.一种将酶选择性固定在基板上的方法，所述方法包括提供具有第一表面组分和第二表面组分的基板，所述第一表面组分包括SiO2,所述第二表面组分包括金属或金属氧化物；使所述基板与第一组合物接触，其中所述第一组合物选择性地与所述第一表面组分缔合，且所述第一组合物包括硅烷；使所述酶与所述第一组合物偶联；和使所述基板与第二组合物接触，所述第二组合物选择性地与所述第二表面组分缔合， 其中所述第二组合物包括含有一种或多种膦酸基团或磷酸盐/酯基团的化合物。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述基板包括位于所述第一表面组分层上的第二表面组分层，所述基板包括设置成穿过所述第二表面组分层到达所述第一表面组分层的零模式波导。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述第一组合物包括第一偶联基团，将所述酶选择性地偶联于所述第一组合物包括使所述酶与所述第一偶联基团偶联。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述第一偶联基团包括生物素。
22.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述第一组合物包括生物素-PEG-硅烷。
23.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述第二组合物是聚乙烯基膦酸。
24.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述第二组合物选自下组
25.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述第二组合物选自下组2-羧乙基膦酸；氨基三(亚甲基膦酸)；ι-羟基亚乙基-ι，ι-二膦酸；六亚甲基二胺四(亚甲基膦酸)； 二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)；乙二胺四(亚甲基膦酸)；二(六亚甲基三胺五(亚甲基膦酸))；2-膦酰基丁烷-1，2，4-三羧酸；和单乙醇胺二膦酸酯。
26.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述第二组合物包括磷酸烷基酯或膦酸烷基酯。
27.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述第二组合物选自下组辛基膦酸、癸基膦酸、十二烷基膦酸、十六烷基膦酸、十八烷基膦酸、二十二烷基膦酸、羟基-十二烷基膦酸、羟基-十一烷基-膦酸、癸二基二(膦酸)、十二烷基磷酸酯和羟基-十二烷基磷酸酯。
28.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述第二组合物包括第二偶联基团。
29.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述酶是聚合酶。
30.如权利要求18所述的方法，其特征在于，使所述基板与所述第二组合物接触，然后与所述第一组合物接触。
31.一种零模式波导阵列，其包括多个设置在包层中的零模式波导芯体，每个芯体具有底面；其中，阵列中多个零模式波导芯体包含结合在底部表面的酶，该酶被选择性结合到该芯体的底部表面上；和其中，所述包层包含含有一种或多种膦酸基团或一种或多种磷酸盐/酯基团的化合物。
32.如权利要求31所述的零模式波导阵列，其特征在于，所述包层设置在二氧化硅基基板上。
33.如权利要求31所述的零模式波导阵列，其特征在于，所述包层包含金属或金属氧化物。
34.如权利要求31所述的零模式波导阵列，其特征在于，阵列中的所述多个零模式波导芯体仅具有单种活性酶分子固定于底部表面上。
35.如权利要求34所述的零模式波导阵列，其特征在于，所述酶包括聚合酶。
36.如权利要求31所述的零模式波导阵列，其特征在于，所述酶通过一种或多种硅烷结合到所述底部表面。
37.如权利要求31所述的零模式波导阵列，其特征在于，所述酶通过结合或偶联基团结合到所述底部表面。
38.如权利要求37所述的零模式波导阵列，其特征在于，所述结合或偶联基团包括抗体、抗体片段、亲和素、生物素、结合肽、凝集素、或互补核酸。
39.如权利要求31所述的零模式波导阵列，其特征在于，所述酶通过生物素结合到所述底部表面。
40.如权利要求39所述的零模式波导阵列，其特征在于，所述酶通过生物素-PEG-硅烷结合到所述底部表面。
41.如权利要求31所述的零模式波导阵列，其特征在于，所述酶通过磷脂双层结合到所述底部表面。
42.如权利要求31所述的零模式波导阵列，其特征在于，所述含有一种或多种膦酸基团或一种或多种磷酸盐/酯基团的化合物是聚乙烯基膦酸。
43.如权利要求31所述的零模式波导阵列，其特征在于，所述含有一种或多种膦酸基团或一种或多种磷酸盐/酯基团的化合物选自
44.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述含有一种或多种膦酸基团或一种或多种磷酸盐/酯基团的化合物选自下组2-羧乙基膦酸；氨基三(亚甲基膦酸)；1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸；六亚甲基二胺四(亚甲基膦酸)；二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)；乙二胺四(亚甲基膦酸)；二(六亚甲基三胺五(亚甲基膦酸))；2-膦酰基丁烷-1，2，4-三羧酸；和单乙醇胺二膦酸酯。
45.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述含有一种或多种膦酸基团或一种或多种磷酸盐/酯基团的化合物包括磷酸烷基酯或膦酸烷基酯。
46.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述含有一种或多种膦酸基团或一种或多种磷酸盐/酯基团的化合物选自下组辛基膦酸、癸基膦酸、十二烷基膦酸、十六烷基膦酸、十八烷基膦酸、二十二烷基膦酸、羟基-十二烷基膦酸、羟基-十一烷基-膦酸、癸二基二(膦酸)、十二烷基磷酸酯和羟基-十二烷基磷酸酯。
47.一种提供其上设置有选定的活性区域的基板的方法，所述方法包括提供其上具有光增强结构的基板，所述光增强结构能够引导电磁辐射，以在所述基板表面的选定区域附近提供足以在所述选定区域附近产生俘获力的增强的电磁场；将电磁辐射导向所述基板，以在所述选定区域处提供足以对所述选定区域附近的活性分子产生俘获力的增强的电磁场；和使所述活性分子偶联于所述选定区域。
48.一种鉴别核酸分子序列的方法，所述方法包括在基板表面上离散的观察区域内提供多个核酸聚合酶/模板/引物复合物，并以模板依赖性方式检测核苷酸或核苷酸类似物的依次添加，以鉴别所述多个观察区域中核苷酸或核苷酸类似物的加入顺序；在所述基板表面上至少第一和第二离散的观察区域之间提供内部观察区屏障，以基本上阻止一种或多种反应物或产物的内部观察区扩散。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述屏障包括第一流体，和在所述第一和第二观察区域之间的足够距离，以基本上阻止一种或多种产物或反应物从所述第一观察区域到达所述第二观察区域。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述基板表面是平面的。
51.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述基板表面是结构化的。
52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述屏障还包括设置在所述基板表面中的至少第一和第二纳米级孔，其中，所述第一和第二观察区域分别位于所述第一和第二纳米级孔内。
53.一种使期望的分子优先定位到设置在基板上的光限制区内的方法，所述方法包括将所述期望的分子沉积到所述基板表面上；和从不在所述光限制区内的基板表面选择性地去除期望分子。
54.如权利要求53所述方法，其特征在于，所述基板包括不透明层和透明层，所述光限制区包括设置成穿过所述不透明层至所述透明层的零模式波导。
55.如权利要求53所述的方法，其特征在于，从不在所述光限制区内的所述基板表面选择性地去除期望分子包括使所述基板与偶联与于排他性组分的灭活组分相接触，所述排他性组分至少部分地被排斥而不能进入所述光限制区。
56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述灭活组分包括酶。
57.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述酶选自蛋白酶、核酶和糖酶。
58.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述酶是位点特异性蛋白酶。
59.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述排他性组分是大颗粒或大分子。
60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述排他性组分包括小珠。
61.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述排他性组分包括刚性或半刚性的长形聚合物。
62.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述排他性组分包括双链核酸分子。
63.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述灭活组分是蛋白酶，所述排他性组分是双链DNA分子。
64.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述期望的分子是酶。
65.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述期望的分子包括结合部分。
66.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述期望的分子是生物素分子。
全文摘要
本发明公开了一种其上设置有定位分子的器件及其制备方法。制备具有选定的活性化学区域的基板的方法，该方法包括采用有助于活性化学基团定位在基板期望区域中的基板元件。该方法可包括用于对选定区域中的化学基团进行沉积、去除、激活和/或灭活的光学、化学和/或机械过程，以提供选择的基板活性区域。
文档编号C12N11/00GK102212515SQ20111007166
公开日2011年10月12日 申请日期2007年3月29日 优先权日2006年3月30日
发明者D·R·兰克, D·罗伊特曼, G·奥托, J·科拉奇, J·莱尔, J·韦格纳, P·佩鲁索, R·L·西塞龙, S·特纳, 许跃 申请人:加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司