一种鉴别奶品品质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品检验，具体地说，涉及一种利用核磁共振鉴别奶品品质的方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，市场上牛奶、羊奶中掺假廉价奶（如豆奶）的问题备受关注。另外，在国 际市场上羊奶比牛奶价格普遍贵2-5倍，这是由于羊奶的资源相对牛奶较少，而且奶羊与 奶牛对生存环境的要求不同，例如奶牛适宜圈养，以喂食人工饲料为主；而奶羊适宜散养， 以吃青草和干草为主，因此奶羊对植被有一定的破坏性，一些发达国家已禁止增加奶羊的 数量。此外，羊奶具有极高的医药价值、保健价值及美颜养肤价值，所生产的产品附加值也 较高，更加减少了市场上食用羊奶的数量，导致市场上羊奶货源少、价格高。羊奶中掺假廉 价豆奶或牛奶的问题尤为突出。为了保障消费者的权益和健康，消除消费恐慌，建立牛奶中 掺假豆奶，羊奶中掺假豆奶或牛奶的定量检测方法，意义重大。
[0003] 核磁共振技术在食品成分安全检测中发挥着重大作用，与传统鉴别牛奶中掺假廉 价奶的方法相比，该技术前处理方法简单、方便，可通过一维与二维相结合的核磁共振技术 实现对牛奶中各代谢物的全面分析，并准确定量。结合统计分析法，找出不同种类奶中各表 征因子，并建立可行性强，准确度高的廉价奶掺假定量模型，可为日后奶品的真实性鉴别提 供了强有力的技术支撑。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种鉴别奶品品质的方 法。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0006] -种鉴别奶品品质的方法，所述方法包括如下步骤：
[0007] 1)对标准奶样品进行预处理；
[0008] 2)利用一维核磁共振技术（1H NMR，13C NMR)和二维核磁共振技术（1H-13C HSQC， 1H-13C HMBC)，对标准奶样品中的代谢物进行定性和定量分析；
[0009] 3)根据表征因子含量数据，对标准奶样品进行主成分分析，利用Fisher判别法建 立标准奶样品的判别模型；
[0010] 所述表征因子包含：柠檬酸、肌酸、卵磷脂、D型乳糖和D型蔗糖；
[0011] 4)配制不同比例的掺假奶样品，按照步骤1)预处理方法进行预处理，之后利用1H NMR技术对各掺假奶样品中上述表征因子进行定量，利用偏最小二乘法建立多元回归定量 模型，并测定其定量限和回收率；
[0012] 5)对待测奶样品进行检测，按照步骤1)预处理方法进行预处理，之后利用1H NMR 技术对样品中上述表征因子进行定量，将各表征因子的含量数据带入步骤3)所得模型中 可判别样品的种类，再将各表征因子含量数据带入步骤4)所得模型中可判别是否掺假廉 价奶，且可定量出掺假廉价奶的比例。
[0013] 进一步地，所述标准奶为纯牛奶、纯羊奶和豆奶。
[0014] 进一步地，步骤1)中预处理的具体方法为：
[0015] 取5~10份奶样，加入10~20份无水乙醇蜗旋混勾；离心取上层溶液用氮气吹 干；加入2~4份重水进行水浴超声，涡旋混匀重新溶解样品，离心取上层溶液，供下一步检 测 。
[0016] 其中，所述重水含1~5mM的内标物TSP (2, 2, 3, 3-三甲基甲硅烷基丙酸）。
[0017] 其中，离心条件为10000~15000rpm离心10~30min。
[0018] 其中，水浴超声的条件为20~30°C水浴超声10~30min。
[0019] 进一步地，步骤2)包括：
[0020] I.不同种类奶中各表征因子的定性分析：
[0021] 利用一维核磁共振（1H NMR，13C NMR)和二维核磁共振（1H-13C HSQC，1H-13C HMBC) 技术对样品进行分析测定，并推断各代谢物的峰归属信息。
[0022] 核磁共振仪器型号需为400MHz或400MHz以上，检测温度为298K ;利用一维（1H NMR，13C NMR)和二维（1H-13C HSQC，1H-13C HMBC)核磁共振技术对样品进行检测分析，技术参 数设置如下：
[0023] 1H NMR参数如下：数据点数，64K ;谱宽，8223. 7Hz ;弛豫时间，2-4s ;扫描次数， 8-32 ;采集时间，4s ;13C NMR参数设置如下：数据点数，64K ;谱宽，24038. 5Hz ;弛豫时间， 2_4s ;扫描次数，1024-2048 ;采集时间，I. 36s ;
[0024] 1H-13C HSQC参数设置如下：数据点数，F2为2048, Fl为256 ;谱宽，F2为8223. 7Hz， Fl为24038. 5Hz ;弛豫时间，2-4s ;扫描次数，16-64 ;空扫次数，16-32 ;采集时间，0. 13s ;
[0025] 1H-13C HMBC参数设置如下：数据点数，F2为2048, Fl为256 ;谱宽，F2为8223. 7Hz， Fl为24038. 5Hz ;弛豫时间，2-4s ;扫描次数，32-128 ;空扫次数，16-32 ;采集时间，0. 13s ;
[0026] II.不同种类奶中各表征因子的定量分析：
[0027] 核磁共振图谱经相位调整和基线校正后，以1~5mM TSP为内标物，利用以下定量 公式，对不同种类奶中的表征因子进行定量分析（图1)。
[0028]
[0029] η代表奶样的浓度倍数;Met代表奶中的代谢物；Ref代表内标物（例如：TSP)。
[0030] 进一步地，步骤3)包括：
[0031] I ·主成分分析：
[0032] 利用one-way ANOVA法分析不同种类奶中代谢物含量差异的显著性（表1)，找出 不同种类奶的表征因子。根据各表征因子的含量原始数据，对不同种类牛奶进行主成分分 析，结果表明提取两个主成分后，纯牛奶、纯羊奶、豆奶可以完全区分开，前两个主成分的方 差累积贡献率达98%。
[0033] 表 1.0 ne-way ANOVA 分析结果
[0034]
[0035] 代表P〈0. 001 ; bP值是由SPSS 21. 0版软件计算所得；。CM代表牛奶；EM代表羊 奶；SM代表豆奶。
[0036] II · Fisher判别模型建立：
[0037] 基于各表征因子的含量原始数据，利用Fisher判别法建立纯牛奶、纯羊奶、豆奶 的判别模型，所得模型如下：
[0038] Y1= 26. 179x !+200. 635x2+245. 065x3+l. 786x4+0. 839x5-413. 914 (I)
[0039] y2= 18. 802x !+209. 010χ2+195· 290χ3+1· 602χ4+0· 726χ5-334· 685 (2)
[0040] y3= 16. 312x !+45· 188χ2+186· 795χ3+0· 064χ4+3· 335χ5_342· 107 (3)
[0041] yi代表牛奶；y 2代表羊奶；y3豆奶。
[0042] X1为柠檬酸含量；x 2为肌酸含量；X 3为卵磷脂含量；X 4为D型乳糖含量；X 5为D型 蔗糖含量，含量单位为mm〇l/L。
[0043] 使用方法：利用核磁共振技术检测待测奶样品中上述五种表征因子的含量，将含 量数值分别代入上述三个模型，计算 yi，y2, 73值，三者中的最大值代表待测奶样品的种类 (例如Y1, y2, 73中y 2值最大，则代表该待测奶样品中主要成分为羊奶）。
[0044] 进一步地，步骤4)包括：
[0045] I ·掺假奶样品配制及预处理：
[0046] 纯牛奶中掺假不同比例的豆奶，牛奶：豆奶（v/v)为1:1至19:1 ;
[0047] 纯羊奶中掺假不同比例的豆奶，羊奶：豆奶（v/v)为1:1至19:1 ;
[0048] 纯羊奶中掺假不同比例的牛奶，羊奶：牛奶（v/v)为1:1至9:1 ;
[0049] 分别取上述掺假奶样5~10ml，加入10~20ml无水乙醇蜗旋混勾；10000~ 15000rpm离心10~30min后，分离上层溶液用氮气吹干；加入2~4ml重水（含1~5mM TSP) 20~30°C水浴超声10~30min，涡旋混匀重新溶解样品，然后10000~15000rpm离心 10~30min后，取400~600 μ L上层溶液于5mm核磁样品管中，供下一步检测使用。
[0050] II .掺假奶样品种表征因子的定量分析与掺假定量模型建立：
[0051] 利用核磁共振技术（1H NMR)对掺假奶样品中的柠檬酸、肌酸、卵磷脂、乳糖、蔗糖 进行内标法定量。基于样品中各表征因子的含量原始数据，利用偏最小二乘法建立多元线 性回归模型，即奶品掺假廉价奶定量模型。模型如下所示：
[0052] Y1= 0· 071X「Ο. 360Χ3+0· 004Χ5+0· 055(线性范围：50% -5% ) (4)
[0053] Y2= 0· 026X !-Ο. 434Χ2+0· 004Χ5+0· 513(线性范围：50% -5% ) (5)
[0054] Y3= -2· 143Χ2+0· 568Χ3+0· 009Χ4+1· 690(线性范围：80% -10% ) (6)
[0055] Y1为牛奶中掺假豆奶的比例（v/v，％ );
[0056] Y2为羊奶中掺假豆奶的比例（v/v，％ );
[0057] Y3为羊奶中掺假牛奶的比例（v/v，％ );
[0058] X1S柠檬酸含量；X 2为肌酸含量；X 3为卵磷脂含量；X 4为D型乳糖含量；X 5为D型 蔗糖含量，含量单位为mm〇l/L。
[0059] 使用方法：利用核磁共振技术检测待测奶样品中上述五种表征因子的含量，将含 量数值分别代入模型（1)、（2)、（3)中，比较 71、72、73值，其中最大值所代表的种类为待测 奶样品所属类别。再将五种表征因子的含量数值根据所判的待测奶样品的类别，带入模型 (4)、（5)、(6)中某一对应奶样类别的模型中，计算所得Y值为掺假某种廉价奶的比例。例 如：若经模型（1)、（2)、（3)判定后，y 2值最大，则该待测奶样中羊奶占主要成分，再将表征 因子含量数据带入羊奶对应的掺假判别模型（5)和（6)中，即可判断该羊奶中是否掺假豆 奶或牛奶，Y 2值代表掺假豆奶的比例，Y3值则代表掺假牛奶的比例。若Y 2、Y3值为〇,则表 示该羊奶中没有掺假豆奶或牛奶。
[0060] 与传统技术相比，本发明的有益效果在于：
[0061] 本发明采用的样品前处理方法简单、方便，极大提高了检测效率；采用一维和二维 核磁共振技术进行检测，实现了样品中各表征因子结构及含量的全面分析，极大提高了样 品检测的准确率；采用Fisher判别法建立的判别模型，