一种快速高效测定马蔺半胱氨酸和谷胱甘肽含量的方法
【技术领域】
[0001] -种快速高效测定马蔺半胱氨酸和谷胱甘肽含量的方法，属于分析测定技术领 域。
【背景技术】
[0002] 半胱氨酸（Cys)和谷胱甘肽（GSH)是一类重要的非蛋白巯基化合物，因化合物结 构上含有的巯基（-SH)使Cys和GSH在重金属解毒中发挥着重要的作用。马蔺(Zris Jac iea var. 为多年生宿根草本，具有适应性广、抗性强、生物量大、栽培管理粗放等特 性，目前已被广泛应用于园林绿化、盐碱地改良、水土保持、重金属污染土壤修复等方面。马 蔺对重金属具有较强的积累和耐受能力，其中重金属胁迫下非蛋白巯基Cys和GSH的大量 合成是其解毒的重要机制。目前，Cys和GSH的测定方法有紫外法，薄层色谱法，高效液相 色谱法（HPLC)，毛细管电泳法，气相色谱法以及气质、液质联用等。紫外法由于样品中伴随 着其他巯基化合物的存在，Cys、GSH和其他巯基化合物在相同波长下均有较强的吸收，因此 测定值一般偏高；而薄层色谱法在分离效果、速度、定量准确度等方面存在缺陷；高效液相 色谱法仍是目前应用最为广泛的一种检测方法，但利用HPLC检测植物Cys和GSH仍存在因 检测时间过长而导致流动相消耗量大、检测物质易变性等缺点。孙琴(土壤Cd、Zn复合污染 对小麦根系植物络合素和谷胱甘肽合成的影响，孙琴，王超，农业环境科学学报，2008年第 5期）报道，小麦根系Cys和GSH单个样品检测时间长达70min，进样量需要50ul。而利用 超高效液相色谱（UPLC)可快速高效的测定植物中Cys和GSH含量，目前利用UPLC检测植 物体内Cys和GSH国内外还未见报道。
【发明内容】
[0003] 技术问题 本发明为解决现有的Cys和GSH测定方法存在成本高、检测时间长等问题，提供了一种 利用超高效液相色谱仪对马蔺Cys和GSH含量进行快速高效定性、定量分析的方法。
[0004] 技术方案 一种快速高效测定马蔺半胱氨酸和谷胱甘肽含量的方法，利用超高效液相色谱快速高 效的对马蔺Cys和GSH同时进行定性和定量分析： (1) 标准溶液配置 分别精确称取所述半胱氨酸和谷胱甘肽各〇. lg，用lml 0. 1%的TFA溶解，作为标准贮 备液，-20°C保存备用；使用前，根据实验需要将此标准贮备液用0. 1%的TFA稀释至适宜含 量，以配制标准工作液和混合标准工作液； (2) Cys和GSH提取样品经过0. 45 μ m滤膜过滤，用于进行检测分析； (3) 超高效液相色谱分离检测条件： 所述超高效液相色谱分析是指通过流动相梯度洗脱，进行波长检测，洗脱和检测条件 为： 色谱柱：Vydac C18色谱柱或同类UPLC反相C18色谱柱。
[0005] 流动相：流动相A为0· 1%的TFA，流动相B为100 %ACN。
[0006] 洗脱程序：12% ~25% B (3min)、25% ~100% B (0· 5min);洗柱：100% B (1. 5min); 柱平衡：100%~〇% B (0· 5min)和柱后流动时间：1. 5 min。
[0007] 流速：0· 3 ~0· 8 ml · min \ 优选 0· 5ml · min 工。
[0008] 柱温：25 ~35°C，优选 30°C。
[0009] 进样量：1~2 μ 1，优选1 μ 1，以峰面积进行外标法定量。
[0010] 突光检测器条件为：λ ex (激发波长）380nm、λ em (发射波长）470 nm。
[0011] 紫外检测器的选择：选用二极管阵列检测器。
[0012] (4)定性 对Cys和GSH混合标准品进行色谱检测，得到标准品色谱图；对植物样品进行色谱检 测，得到植物样品中Cys和GSH的UPLC色谱图；通过增高法进行定性分折； (5)定量 制作标准曲线：准确配制1~1〇〇 ng ·μ1 1的五个不同浓度的Cys和GSH的混合标样， 按照上述液谱条件进样，进样量为ιμL;以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标，计算得 到2条标准曲线；定量：每种待测物质分别对应于外标做标准曲线，经过UPLC检测后将峰 面积代入相对应的标准曲线方程计算出待测物质的含量。
[0013] 有益效果 本发明提供了一种快速高效测定马蔺半胱氨酸和谷胱甘肽含量的方法。高效液相色 谱法是目前测定植物体内Cys和GSH应用最为广泛的一种检测方法，但利用HPLC检测植物 Cys和GSH仍存在进样量大、检测时间过长、流动相消耗量大、检测物质易变性等缺陷，而采 用UPLC对植物样品Cys和GSH进行检测，可使单个样品进样量由50 μL减至?μL，检测时间 由70min缩短至7min，极大地提高了检测效率，同时也降低了流动相的消耗成本。
【附图说明】
[0014] 图1为Cys标准曲线。
[0015] 图2为GSH标准曲线。
[0016] 图3为Cys和GSH标准品混合溶液超高效液相色谱（UPLC)图；其中数字表示物质 出峰时间，Cys出峰时间为0. 486min，GSH出峰时间为0. 675min。
[0017] 图4为实施例中马蔺样品Cys和GSH超高效液相色谱（UPLC)图；其中数字表示物 质出峰时间，Cys出峰时间为0. 487min，GSH出峰时间为0. 675min。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1 (1)样品处理及提取：株高15~20cm的马蔺幼苗经0、100、500 mg · L中13(勵3)2处理 7d后提取马蔺叶片和根系Cys和GSH并进行衍生化。具体如下：称取0. 3g马蔺鲜样组织， 液氮迅速冷冻后置于研钵中，加入1. 75 ml 0. 1% TFA (内含6. 3 mmol *L ΑΤΡΑ,ρΗ〈1)和 少量石英砂，冰浴上充分研磨离心（4 °C，12000g，20min)，上清液冷藏用于Cys和GSH分析 测定。
[0019] (2)标准溶液配置：分别精确称取所述Cys和GSH各0. lg，用1ml 0. 1%的TFA溶 解，作为标准贮备液，-2〇°C保存备用；使用前，用0. 1%TFA稀释成l、5、10、20、100ng · μL 1 标准系列，4 C保存。
[0020] (3)衍生化：分别取25μ1标准液和植物组织上清液，分别依次加入45μ1 200 mmol · L 1 HEPPS (内含 6. 3 mmol · L 4ΤΡΑ，pH = 8. 2)和 ?μL 25 mmol · L iBBr，充分混合 45°〇反应，3〇!1^11后加入3(^11臟〇1.1/]^4终止反应，摇匀转移至48丨161^棕色顶空 瓶内，4°C保存，直到UPLC分析测定。
[0021] (4)色谱条件：采用二元梯度洗脱系统室温下分离mBBr衍生物。荧光检测器条件 为