一种诊断日本血吸虫循环抗原的方法
【专利摘要】本发明涉及生物医学和纳米材料学两方面内容，具体涉及金纳米棒传感器的制备以及对日本血吸虫(Schistosomiasis Japonica)(中国大陆株)循环抗原检测方法的构建。其发明采用固相载体?ITO玻片与金纳米棒结合，再将日本血吸虫26?28Kd单链抗体与其结合构建检测传感器，并对日本血吸虫循环抗原进行诊断，通过UV扫描传感器观察其消光峰的变化来确定日本血吸虫感染与否。
【专利说明】
一种诊断日本血吸虫循环抗原的方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物医学和纳米材料学两方面内容，具体涉及金纳米棒传感器的制备以及对日本血吸虫(Schistosomiasis Japonica)(中国大陆株)循环抗原检测方法的构建。其发明采用固相载体-1TO玻片与金纳米棒结合，再将日本血吸虫26-28Kd单链抗体与其结合构建检测传感器，并对日本血吸虫循环抗原进行诊断，通过UV扫描传感器观察其消光峰的变化来确定日本血吸虫感染与否。
【背景技术】
[0002]血吸虫病(Schistosomiasis) —直是我国政府面临的公共卫生难题。随着对疫情的有力控制，流行区感染率逐渐下降，感染程度明显降低。同时，也对血吸虫病轻度感染病人诊断方法的灵敏度提出了更高的要求。血吸虫循环抗原(CAg, circulating antigen)可作为血吸虫病现症感染的重要标志，亦可作为活虫寄生的标志物以及病人治疗效果的考核指标，由于SjCAg在血液或体液中以极微量的形式存在,只有在相对灵敏检测系统中才能够检测出。
[0003]固相金纳米棒传感器是基于自由电子在金纳米棒的棒长轴与纵轴的集体震荡能够形成表面等离子效应，这一效应的光学特性表现为纳米棒长径比的变化，可导致局部表面等离子共振(LSPR, Localized surface plasmon resonance)消光峰的显著变化。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种诊断日本血吸虫循环抗原的方法。具体包括以下过程:
[0005]1.金纳米棒的制备:使用种子生长法，制备金纳米棒。
[0006]2.1TO玻片的预处理:先将ITO玻片用双蒸水清洗干净，然后放入煮沸的食人鱼洗液中(配方体积比为:浓硫酸:双氧水=3: 1)，待完全冷却后，取出，洗净，吹干。
[0007]3.1TO玻片羟基化:将预处理好的ITO玻片放入已冷却的食人鱼洗液中(配方体积比为:浓硫酸:双氧水=3: 1)，然后水浴加热至65-75°C，40-50分钟，待完全冷却后，取出，洗净，吹干。
[0008]4.将已经羟基化的ITO玻片分别浸入到PSS和PAH溶液中，25-30°C，30-40分钟，取出，洗净，吹干。
[0009]5.将4中已经修饰ITO玻片浸入到制备好的金纳米棒溶液中，25_30°C浸泡15_19小时，取出，洗净，吹干。
[0010]6.将5中已结合金纳米棒的ITO玻片放入ScFv (日本血吸虫26-28KD单链抗体)溶液中，放置4°C，7小时，取出，洗净，吹干。
[0011]7.将6中已构建好的固相传感器分别浸入到血吸虫感染的阳性兔血清和阴性兔血清中，40C，放置30分钟-4小时，取出，洗净，吹干。
[0012]8.将与血清反应的固相传感器置于紫外分光光度计检测其消光峰值。
[0013]血吸虫循环抗原在血液内的含量极低，传统的检测方法难于对其检测，本发明基于金纳米棒的固相传感器，其能将痕量的循环抗原与单链抗体的反应通过光学信号传出，通过观察其消光峰值的变化，如与阴性血清反应时，其消光峰值没有变化；而与阳性血清反应时，消光峰值有14nm和40nm的红移，证明此传感器能够灵敏的检测区分血吸虫阴、阳性血清。
[0014]图1是本发明金纳米棒的紫外扫描图；
[0015]图2是金纳米棒电镜扫描图；
[0016]图3是金纳米棒与玻片A结合的紫外扫描图；
[0017]图4是传感器A与ScFv组装的UV扫描图；
[0018]图5是玻片A与阳性血清结合30分钟的紫外扫描图；
[0019]图6是玻片A与阳性血清结合2小时的紫外扫描图；
[0020]图7是金纳米棒与玻片B结合的紫外扫描图；
[0021 ] 图8是传感器B与ScFv组装的UV扫描图；
[0022]图9是玻片B与阴性血清结合30分钟的紫外扫描图；
[0023]图10是玻片B与阴性血清结合2小时的紫外扫描图；
[0024]图11.金纳米棒与玻片组装传感器C的UV扫描图；
[0025]图12传感器C与ScFv组装的UV扫描图；
[0026]图13.传感器B与阴性血清结合30分钟的UV扫描图；
[0027]图14.传感器C与阴性血清结合4小时的UV扫描图。
【具体实施方式】
[0028]实施例1
[0029]1.金纳米棒的制备:使用种子生长法，制备长径比为3.2的金纳米棒。如图1、图2所示
[0030]2.1TO玻片的预处理:先将ITO玻片用双蒸水清洗干净，然后放入煮沸的食人鱼洗液中(配方体积比为:浓硫酸:双氧水=3: 1)，待完全冷却后，取出，洗净，吹干。
[0031]3.1TO玻片羟基化:将预处理好的ITO玻片放入已冷却的食人鱼洗液中(配方体积比为:浓硫酸:双氧水=3: I)，然后水浴加热至65°C，待完全冷却后，取出，洗净，吹干。
[0032]4.将已经羟基化的ITO玻片分别浸入到PSS和PAH溶液中，25°C，30分钟，取出，洗净，吹干。
[0033]5.将4中已经修饰ITO玻片浸入到制备好的金纳米棒溶液中，25°C浸泡15小时，取出，洗净，吹干。经紫外分光光度计检测，其消光峰值分别为689nm，如图3所示。
[0034]6.将5中已结合金纳米棒的ITO玻片放入ScFv(日本血吸虫26-28KD单链抗体)溶液中，放置4°C，7小时，取出，洗净，吹干，用紫外分光光度计检测，其消光峰值分别为713nm。如图4所示。
[0035]7.将6中已构建好的固相传感器分别浸入到血吸虫感染的阳性兔血清中，4°C，分别放置30分钟和2小时，取出，洗净，吹干。
[0036]8.将与血清反应的固相传感器置于紫外分光光度计检测，其消光峰值分别为727nm，753nm如图5，如图6所示。
[0037]实施例2
[0038]1.金纳米棒的制备:使用种子生长法，制备长径比为3.2的金纳米棒。如图1、图2所示
[0039]2.1TO玻片的预处理:先将ITO玻片用双蒸水清洗干净，然后放入煮沸的食人鱼洗液中(配方体积比为:浓硫酸:双氧水=3: I)待完全冷却后，取出，洗净，吹干。
[0040]3.1TO玻片羟基化:将预处理好的ITO玻片放入已冷却的食人鱼洗液中(配方体积比为:浓硫酸:双氧水=3: I)，然后水浴加热至70°C，待完全冷却后，取出，洗净，吹干。
[0041]4.将已经羟基化的ITO玻片分别浸入到PSS和PAH溶液中，28°C，30分钟，取出，洗净，吹干。
[0042]5.将4中已经修饰ITO玻片浸入到制备好的金纳米棒溶液中，28°C浸泡17小时，取出，洗净，吹干。经紫外分光光度计检测，其消光峰值为683nm.如图7所示。
[0043]6.将5中已结合金纳米棒的ITO玻片放入ScFv (日本血吸虫26-28KD单链抗体)溶液中，放置4°C，7小时，取出，洗净，吹干，用紫外分光光度计检测，其消光峰值为712nm，如图8所示。
[0044]7.将6中已构建好的固相传感器分别浸入到血吸虫感染的阴性兔血清，4°C，分别放置30分钟和2小时，取出，洗净，吹干。
[0045]8.将与血清反应的固相传感器置于紫外分光光度计检测，其消光峰值为723nm，723nm.如图9、图10所示。
[0046]实施例3
[0047]1.金纳米棒的制备:使用种子生长法，制备长径比为3.2的金纳米棒。如图1、图2所示
[0048]2.1TO玻片的预处理:先将ITO玻片用双蒸水清洗干净，然后放入煮沸的食人鱼洗液中(配方为:浓硫酸:双氧水=3: I)待完全冷却后，取出，洗净，吹干。
[0049]3.1TO玻片羟基化:将预处理好的ITO玻片放入已冷却的食人鱼洗液中(配方为:浓硫酸:双氧水=3: I)，然后水浴加热至75°C，待完全冷却后，取出，洗净，吹干。
[0050]4.将已经羟基化的ITO玻片分别浸入到PSS和PAH溶液中，30°C，30分钟，取出，洗净，吹干。
[0051]5.将4中已经修饰ITO玻片浸入到制备好的金纳米棒溶液中，25°C浸泡19小时，取出，洗净，吹干。经紫外分光光度计检测，其消光峰值为660nm。如图11所示。
[0052]6.将5中已结合金纳米棒的ITO玻片放入ScFv(日本血吸虫26-28KD单链抗体)溶液中，放置4°C，7小时，取出，洗净，吹干，用紫外分光光度计检测，其消光峰值分别为724nm。如图12所示
[0053]7.将6中已构建好的固相传感器分别浸入到血吸虫感染的阴性兔血清中，4°C，放置30分钟，2小时，取出，洗净，吹干。
[0054]8.将与血清反应的固相传感器置于紫外分光光度计检测，其消光峰值分别为723nm、723nm。图 13、图 14 所示。
【主权项】
1.一种诊断日本血吸虫循环抗原的方法，其特征在于包括以下步骤: A..金纳米棒的制备:使用种子生长法，制备金纳米棒； B.1TO玻片的预处理:先将ITO玻片用双蒸水清洗干净，然后放入煮沸的食人鱼洗液中，配方体积比为:浓硫酸:双氧水=3: 1，待完全冷却后，取出，洗净，吹干； c.1TO玻片羟基化:将预处理好的ITO玻片放入已冷却的食人鱼洗液中，然后水浴加热至65-75°C，40-50分钟，待完全冷却后，取出，洗净，吹干； D.将已经羟基化的ITO玻片分别浸入到聚苯乙烯磺酸钠(PSS)和聚丙烯胺盐酸盐(PAH)溶液中，25-300C，30-40分钟，取出，洗净，吹干； E.将D中已经修饰ITO玻片浸入到制备好的金纳米棒溶液中，25-30°C浸泡15-19小时，取出，洗净，吹干； F.将E中已结合金纳米棒的ITO玻片放入ScFv溶液中，即日本血吸虫26-28KD单链抗体，放置4°C，7小时，取出，洗净，吹干； G.将F中已构建好的固相传感器分别浸入到血吸虫感染的阳性兔血清和阴性兔血清中，4°C，放置30分钟-4小时，取出，洗净，吹干； H.将与血清反应的固相传感器置于紫外分光光度计检测其消光峰值； 最后，通过观察其消光值的变化来检测是否有日本血吸虫循环抗原的存在。
【文档编号】G01N33/543GK105891465SQ201410628016
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年11月11日
【发明人】何鑫, 汪世平, 周云飞
【申请人】中南大学