一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的方法
【专利摘要】本发明公开了一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的方法。它包括以下步骤：选取待测植株，取第二、第三和第四完全展开叶各一片剪碎充分混合，取其中0.1g进行酶液的提取，分别测定提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的磷酸果糖激酶活力和葡萄糖?6?磷酸脱氢酶的酶活力，依据公式计算出糖代谢中的糖酵解途径份额、磷酸戊糖途径份额以及糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例。本发明能快速定量不同环境下植物体糖代谢中的糖酵解途径份额、磷酸戊糖途径份额以及糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例，步骤少，计算简单，测定结果具有可比性以及可靠性，可以整体反映植物在环境变化时葡萄糖代谢的歧化情况。
【专利说明】
-种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磯酸戊糖途径份额的 方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和憐酸戊糖途径份额的方法，属 于生物生理生化领域。
【背景技术】
[0002] 生物在不利生境条件下，往往通过在形态和生理上发生改变使它们能适应环境的 变化W获得生存的机会。生物的生长发育都是W代谢为基础。因此，判断生物在逆境情况下 代谢系统发生的复杂变化，是研究植物对环境的适应性的基础。葡萄糖代谢是维持生命体 基本活动的最重要的代谢过程，为生命体提供能量、还原力和合成其他生物大分子的底物。 生命体内葡萄糖的代谢途径有很多种，分别是糖酵解途径、憐酸戊糖途径、糖醒酸途径、有 氧氧化途径、多元醇途径、糖原合成与糖原分解、糖异生W及其他己糖代谢。其中，糖酵解途 径和憐酸戊糖途径是葡萄糖的两个最主要的代谢途径，两者占葡萄糖代谢的份额超过 80%，在植物体中占的比例更大。糖酵解途径为生命体提供进行生命活动所必须的能量--- ATP，而憐酸戊糖途径为生命体提供物质合成和抵抗不利环境所需的还原力一-NAPDH。
[0003] 研究代谢途径的调控情况，常常通过研究其限速酶的活性变化来进行。在糖酵解 途径中，憐酸果糖激酶(PFK)是此途径的限速酶，其功能是不可逆的催化果糖-6-憐酸生成 果糖-1，6-二憐酸，导致葡萄糖进入糖酵解途径进行代谢;而葡萄糖-6-憐酸脱氨酶(G6PDH) 是憐酸戊糖途径的限速酶，其功能为催化葡萄糖-6-憐酸不可逆的转化为6-憐酸葡萄糖酸， 从而导致葡萄糖进入憐酸戊糖途径进行代谢。
[0004] W往常常通过研究一个代谢途径或几个代谢途径的变化情况来研究植物葡萄糖 代谢在环境变化时发生的改变，运样的研究方法割裂了各个代谢途径之间的联系，难W反 映各代谢途径之间的影响，不能够反映生物葡萄糖代谢整体的变化情况。因此，建立一种能 反映葡萄糖代谢整体变化趋势的方法，对研究生物葡萄糖代谢在环境变化时的歧化情况具 有极其重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种利用糖酵解途径和憐酸戊糖途径限速酶酶 活力比值判断葡萄糖代谢歧化情况的方法，W克服现有技术难W反映葡萄代谢整体变化情 况的弱点。
[0006] 本发明采取W下技术方案:它包括W下步骤：
[0007] 第一，选取待测植株，取第二、第=和第四完全展开叶各一片；
[000引第二，将上述叶片剪碎充分混合，取其中0.1 g进行酶液的提取；
[0009] 第=，测定上述提取的酶液中W单位体积单位时间吸光度变化值表示的憐酸果糖 激酶活力EAp化；
[0010] 第四，测定上述提取的酶液中W单位体积单位时间吸光度变化值表示的葡萄糖- 6-憐酸脱氨酶的酶活力EAgSpdh;
[OCm]第五，将憐酸果糖激酶的酶活力EApfk与葡萄糖-6-憐酸脱氨酶的酶活力EAgSpdh累加 获得糖代谢关键酶的总活性EAe，计算公式为EAe=EApfk+EAgSpdh;
[0012] 第六，依据憐酸果糖激酶的酶活力EApfk和糖代谢关键酶的总活性EAe，计算出糖代 谢中的糖酵解途径份额扣MP，计算公式为扣MP = EApfk/EAE;
[0013] 第屯，依据葡萄糖-6-憐酸脱氨酶的酶活力EAgSp化和糖代谢关键酶的总活性EAe，计 算出糖代谢中的憐酸戊糖途径份额时PP;计算公式为时pp = EAg6pdh/EAE;
[0014] 第八，依据糖代谢中的糖酵解途径份额Pemp和糖代谢中的憐酸戊糖途径份额Pppp， 计算出糖代谢中的糖酵解途径和憐酸戊糖途径的比例P，计算公式为P = Pemp/Pppp。
[0015] 在第二步中，酶液的提取方法为:取的叶片组织放置于冰浴研鉢中，加入液氮进行 冷冻研磨，待液氮挥发后，加入酶提取液;把研磨后的匀浆移入离屯、管中，离屯、，取上清液冷 藏待测；其中酶提取液为50mM肥阳S化is-HCl(pH7.8)，3mMMgCl2，lmM抓TA，lmM二硫苏 糖醇和ImM苯甲基横酷氣;运里的皿PES为4-径乙基赃嗦乙横酸，Tris-肥1为盐酸S径甲基 氨基甲烧，邸TA为乙二胺四乙酸。
[0016] 在第四步骤中，酶液中憐酸果糖激酶的酶活力EApfk的测定方法为:憐酸果糖激酶 的酶活力等于ATP-PFK酶活力加上PPi-PFK酶活力;ATP-PFK酶活力的测定方法如下，把20化 L酶提取液加入到1.SmLATP-PFK酶活分析液中，利用紫外分光光度计在340nm处测定反应混 合液中5111111的吸光度的变化01;41?斗。閒每活分析液抑7.8，包括5〇11^皿?68化13-肥1， 2.5mM MgCl2,0.1mM NADH，5mM果糖-6-憐酸，2unit mL的醒缩酶，limit mL丙糖憐酸异构 酶，2unit ml 3-憐酸甘油脱氨酶和lmMATP;PPi-PFK酶活力的测定方法如下：把20化L酶提 取液加入到1 .SmL PPi-PFK酶活分析液中，利用紫外分光光度计在340nm处测定反应混合液 中5min的吸光度的变化D2; PPi-PFK酶活分析液抑7.8，包括50mM皿PES IYis-HCl，2.5mM MgCl2,0.1mM NA畑，5mM果糖-6-憐酸，2unit mL的醒缩酶，limit血丙糖憐酸异构酶，2unit ml 3-憐酸甘油脱氨酶和ImM PPi ;酶液中憐酸果糖激酶的酶活力EApfk可表示为D1+D2;运里 的PFK为憐酸果糖激酶，ATP为S憐酸腺巧，PPi为焦憐酸，NADH为还原型烟酷胺腺嚷岭二核 巧酸或还原型辅酶I。
[0017]在第五步骤中，酶液中葡萄糖-6-憐酸脱氨酶的酶活力EAgSpdh的测定方法为：葡萄 糖-6-憐酸脱氨酶的酶活力等于G6PDH和6PGDH总酶活力减去6PGDH酶活力；测定G6PDH和 6PGDH的总活力的方法为:把20化L酶提取液加入到1. SmL G6PDH和6PGDH总酶活分析液中， 利用紫外分光光度计在340nm处测定反应混合液中5min的吸光度的变化化;G6PDH和6PGDH 总酶活分析液抑7.8,包括50mM皿阳S化is-HCl，3.3mM MgCl2,0.5mM 6-憐酸葡萄糖酸脂 二钢盐，0.5mM 6-憐酸葡萄糖酸脂和0.5mM NADP化2;6PGDH的酶活力的测定方法:把20化L 酶提取液加入到1 .SmL 6PGDH酶活分析液中，利用紫外分光光度计在340nm处测定反应混合 液中5min的吸光度的变化化;6PGDH酶活分析液抑7.8,包括50mM皿阳S Tris-肥l，3.3mM MgCb，0.5mM 6-憐酸葡萄糖酸脂和0.5mM NADP化2;酶液中葡萄糖-6-憐酸脱氨酶的酶活力 EAgSp化可表示为Dt-Dp;运里的G6PDH为葡萄糖-6-憐酸脱氨酶，6PGDH为6-憐酸葡萄糖酸脱氨 酶，NADPNas为氧化型型辅酶II二钢盐。
[0018]在第六、屯和八步骤中，糖代谢中的糖酵解途径份额、糖代谢中的憐酸戊糖途径份 额W及糖代谢中的糖酵解途径和憐酸戊糖途径的比例均W百分比值来进行体现。
[0019]本发明的优点如下：
[0020] 1)由于还原型烟酷胺腺嚷岭二核巧酸憐酸或还原型辅酶II(NADPH)和还原型烟酷 胺腺嚷岭二核巧酸或还原型辅酶I (NADH)在34化m的毫摩尔消光系数均为6.22mM-icm-i，测 出的憐酸果糖激酶的酶活力和葡萄糖-6-憐酸脱氨酶的酶活力量纲相同，一个单位的葡萄 糖通过糖酵解途径消耗2个单位的NADH，而通过PPP途径恰好生成2个单位的NADPH，因此，用 憐酸果糖激酶的酶活力和葡萄糖-6-憐酸脱氨酶的酶活力代表两个途径无需归一化，计算 出的糖代谢中的糖酵解途径份额、糖代谢中的憐酸戊糖途径份额W及糖代谢中的糖酵解途 径和憐酸戊糖途径的比例具有可靠性
[0021] 2)能快速定量不同环境下植物体糖代谢中的糖酵解途径份额、糖代谢中的憐酸戊 糖途径份额W及糖代谢中的糖酵解途径和憐酸戊糖途径的比例，测定结果具有可比性。
[0022] 3)本方法无需测定酶液中的蛋白质浓度，步骤少，计算简单。
[0023] 4)本方法克服了现有研究将糖酵解途径和憐酸戊糖途径割裂开来的缺点，可W整 体反映植物在环境变化时葡萄糖代谢的歧化情况W及葡萄糖代谢在各途径中的分配情况。
[0024] 本发明的基本原理为：
[0025] 对限速酶活力的研究是研究葡萄糖代谢途径的基本手段。限速酶的酶活力能够代 表该途径进行葡萄糖代谢的活跃程度。憐酸果糖激酶(PFK)是此糖酵解途径的限速酶，而葡 萄糖-6-憐酸脱氨酶(G6PDH)是憐酸戊糖途径的限速酶，而憐酸果糖激酶(PFK)和葡萄糖-6- 憐酸脱氨酶(G6PDH)酶活力的比值可W代表葡萄糖代谢在糖酵解途径和憐酸戊糖途径之间 的分配情况。
[0026] 当生物体内的葡萄糖通过糖酵解途径进行代谢生成甘油时，会消耗生物体内的还 原性辅酶I(NADH),而还原性辅酶I(NADH)的消耗能够通过吸光度的变化来进行测量，即可 W通过测定一定波长下吸光度的变化来测量糖酵解途径关键酶PH(的酶活力。而在生物体 内的葡萄糖通过憐酸戊糖途径进行代谢时，会在生物体内生成还原性辅酶II(NADPH),同样 NADPH的增加也能够通过吸光度的变化来进行测量，即也可W通过测定一定波长下吸光度 的变化来测量憐酸戊糖途径关键酶G6PDH的酶活力。
[0027] 生物体酶液的提取。取0.1 g的生物组织放置于冰浴研鉢中，加入液氮进行冷冻研 磨，待液氮挥发后，加入ImL酶提取液，其中含有50mM肥PES Tris-HCUpH 7.8)，3mM MgCbamM抓TA, ImM二硫苏糖醇和ImM苯甲基横酷氣。把研磨后的匀浆移入离屯、管中，在4 °C下，12000g离屯、20min，取上清液冷藏待测。
[0028] PFK的总活力等于ATP-PFK酶活力加上PPi-PFK酶活力。ATP-PFK酶活力的测定方法 如下，把200化酶提取液加入到1. SmLATP-PFK酶活分析液中W测定ATP-PFK的酶活，ATP-PFK 酶活分析液包括50mM 皿阳S IYis-HCKpH 7.8),2.5mM MgCb,0.1ml NADH，5mM果糖-6-憐 酸，2unit mL的醒缩酶，limit mL丙糖憐酸异构酶，2unit ml 3-憐酸甘油脱氨酶和ImMATP; PPi-PFK酶活力的测定方法如下，把20化L酶提取液加入到1 .SmL PPi-PFK酶活分析液中W 测定 PPi-PFK 的酶活，PPi-PFK 酶活分析液包括 50mM HEPES Tris-HCUpH 7.8),2.5mM MgCl2,0.1mM NA畑，5mM果糖-6-憐酸，2unit mL的醒缩酶，limit血丙糖憐酸异构酶，2unit ml 3-憐酸甘油脱氨酶和ImM PPi。利用紫外分光光度计在340nm处测定反应混合液的光吸 收，W测量反应混合液中NADH氧化为NA护的速率的变化情况。
[0029] G6PDH酶活的值等于G6PDH和6PGDH总酶活值减去6PGDH酶活值。首先测定G6PDH和 6PGDH(6-憐酸葡萄糖酸脱氨酶）的总活力，把20化L酶提取液加入到1.8mL G6PDH和6PGDH总 酶活分析液中W测定G6P畑和6PGDH的总酶活。G6PDH和6PG畑总酶活分析液包括50mM肥阳S Tris-肥1(抑7.8)，3.3mM MgCl2,0.5mM 6-憐酸葡萄糖酸脂二钢盐，0.5mM 6-憐酸葡萄糖 酸脂和0.5mM NADPNas。把20化L酶提取液加入到1. SmL 6PGDH酶活分析液中W测定6PGDH的 酶活。6PGDH酶活分析液中包括50mM 肥PES IYis-HCKpH 7.8),3.3mM MgCb,0.5mM 6-憐 酸葡萄糖酸脂和〇.5mM NADP化2。利用紫外分光光度计在340nm处测定反应混合液的光吸 收，W则量反应混合液中NADP+还原为NADPH的速率的变化情况。
[0030] 酶活力的计算公式见式1，其单位为nmol min-Vg-ipr。
[0031]
Cl)
[0032] A A为在测定时间A t(min)内反应系统在测定波长的吸光值的变化；
[0033] Ve为测定的酶液加入的体积(化）；
[0034] EiAi为所用的底物的微摩尔消光系数，可由底物的标准曲线求出。
[0035] Cpr为酶液的蛋白浓度(g [1或yg ml/i)。
[0036] NADPH和NADH在340nm的毫摩尔消光系数均为6.22mM-icm-i，其微摩尔消光系数即 0.00622iiM-V-i，其意义即在Icm的光路中1.0皿〇1 L-I浓度的NADPH或NADH其在340皿的吸光 值为0.00622。
[0037] 由W上的方法和式1，可W计算出PFK酶活力为EApfk,G6PDH酶活力为EAgSpdh,同时假 设生物体内参与葡萄糖代谢的代谢途径的关键酶的总活性为EAe,除糖酵解途径和憐酸戊 糖途径之外参加葡萄糖代谢的各途径的限速酶活力为EAelse,且各途径的限速酶的活力代 表了该途径进行葡萄糖代谢的活跃程度。则生物体内参与葡萄糖通过糖酵解途径代谢的占 t化EMP可表示为：
[003引扣 MP = EAp&/(EApfk+EAgf5p<ih+EAeise)X100% (2)
[0039] 同理，憐酸戊糖途径在葡萄糖代谢中的占比时PP可表示为：
[0040] Pppp = EAgfSpdh/(EAp化+EAgSpdh+EAeise) X 100% (3)
[OOW 在式3和式4中，因为EAeise的占比很小，且我们只研究PFK和G6PDH的酶活力关系， 在此我们对其忽略。所W，糖酵解途径进行葡萄糖代谢与憐酸戊糖途径进行葡萄糖代谢之 比可简单的表示为：
[0042] P = Pemp/Pppp = EApfk: EAgSpdh (4)
[0043] 由于测定时间A t、酶液加入的体积、所用的底物的微摩尔消光系数及酶液的 蛋白浓度相同，所W无论是憐酸果糖激酶的酶活力EApfk还是葡萄糖-6-憐酸脱氨酶的酶活 力都可W W单位体积单位时间吸光度变化值表示其活力，它们的比值更是如此。
【具体实施方式】
[0044] 本发明的实例:它包括W下步骤：
[0045] 第一，选取待测植株，取第二、第=和第四完全展开叶各一片；
[0046] 第二，将上述叶片剪碎充分混合，取其中0.1 g进行酶液的提取；
[0047] 第=，分别测定上述提取的酶液中W单位体积单位时间吸光度变化值表示的憐酸 果糖激酶活力EApfk和葡萄糖-6-憐酸脱氨酶的酶活力EAgSpdh;
[0048] 第四，将憐酸果糖激酶的酶活力EApfk与葡萄糖-6-憐酸脱氨酶的酶活力AgSp化代入 公式EAE = EApfk+EAg6pdh中，获得糖代谢关键酶的总活性EAe ;
[0049] 第五，分别将憐酸果糖激酶的酶活力EApfk、葡萄糖-6-憐酸脱氨酶的酶活力EAgSpdh 和糖代谢关键酶的总活性EAe代入公式扣MP = EApf k/EAE、Pppp = EAg6pdh/EAE计算出糖代谢中的 糖酵解途径份额扣MP和糖代谢中的憐酸戊糖途径份额Pppp ;
[0050] 第六，将糖代谢中的糖酵解途径份额扣MP和糖代谢中的憐酸戊糖途径份额Pppp代入 到公式P = Pemp/Pppp中，计算出糖代谢中的糖酵解途径和憐酸戊糖途径的比例P。
[0化1]实施例1
[0052] 第一，选取对照环境中构树植株，取第二、第=和第四完全展开叶各一片；
[0053] 第二，将上述叶片剪碎充分混合，取其中0.1 g进行酶液的提取；
[0054] 第S，测定构树叶片中糖酵解途径限速酶憐酸果糖激酶(PFK)的酶活力EApfk和憐 酸戊糖途径限速酶葡萄糖-6-憐酸脱氨酶(G6PDH)的酶活力EAgSpdh;计算糖代谢关键酶的总 活性EAe;
[0化5] 第四，将EApfk、EAgSp化和EAe分别带入扣MP = EApfk/EAE、Pppp = EAg6pdh/EAE计算出糖代 谢中的糖酵解途径份额扣MP和糖代谢中的憐酸戊糖途径份额Pppp ;
[0056]第五，最后，将糖代谢中的糖酵解途径份额Pemp和糖代谢中的憐酸戊糖途径份额 时PP代入到公式P = Pemp/Pppp中，计算出糖代谢中的糖酵解途径和憐酸戊糖途径的比例P。 [0化7]实施例2
[005引第一，选取对照环境中桑树植株，取第二、第=和第四完全展开叶各一片；
[0059] 第二，将上述叶片剪碎充分混合，取其中0.1 g进行酶液的提取；
[0060] 第S，测定构树叶片中糖酵解途径限速酶憐酸果糖激酶(PFK)的酶活力EApfk和憐 酸戊糖途径限速酶葡萄糖-6-憐酸脱氨酶(G6PDH)的酶活力EAgSpdh;计算糖代谢关键酶的总 活性EAe;
[0061 ] 第四，将￡八。:1<、6八86。化和￡八￡分别带入扣1^> = 6八。:1</6八￡心口口 = 6八86。化/6八￡计算出糖代 谢中的糖酵解途径份额扣MP和糖代谢中的憐酸戊糖途径份额Pppp ;
[0062] 第五，最后，将糖代谢中的糖酵解途径份额Pemp和糖代谢中的憐酸戊糖途径份额 时PP代入到公式P = Pemp/Pppp中，计算出糖代谢中的糖酵解途径和憐酸戊糖途径的比例P。
[0063] 实施例3
[0064] 第一，选取胁迫环境1中构树植株，取第二、第=和第四完全展开叶各一片；
[0065] 第二，将上述叶片剪碎充分混合，取其中0.1 g进行酶液的提取；
[0066] 第S，测定构树叶片中糖酵解途径限速酶憐酸果糖激酶(PFK)的酶活力EApfk和憐 酸戊糖途径限速酶葡萄糖-6-憐酸脱氨酶(G6PDH)的酶活力EAgSpdh;计算糖代谢关键酶的总 活性EAe;
[0067] 第四，将EApfk、EAgSp化和EAe分别带入扣MP = EApfk/EAE、Pppp = EAg6pdh/EAE计算出糖代 谢中的糖酵解途径份额扣MP和糖代谢中的憐酸戊糖途径份额Pppp ;
[0068] 第五，最后，将糖代谢中的糖酵解途径份额Pemp和糖代谢中的憐酸戊糖途径份额 时PP代入到公式P = Pemp/Pppp中，计算出糖代谢中的糖酵解途径和憐酸戊糖途径的比例P。
[0069] 实施例4
[0070]第一，选取胁迫环境I中桑树植株，取第二、第=和第四完全展开叶各一片；
[0071 ]第二，将上述叶片剪碎充分混合，取其中0.1 g进行酶液的提取；
[0072] 第S，测定构树叶片中糖酵解途径限速酶憐酸果糖激酶(PFK)的酶活力EApfk和憐 酸戊糖途径限速酶葡萄糖-6-憐酸脱氨酶(G6PDH)的酶活力EAgSpdh;计算糖代谢关键酶的总 活性EAe;
[0073] 第四，将EApfk、EAgSp化和EAe分别带入扣MP = EApfk/EAE、Pppp = EAg6pdh/EAE计算出糖代 谢中的糖酵解途径份额扣MP和糖代谢中的憐酸戊糖途径份额Pppp ;
[0074] 第五，最后，将糖代谢中的糖酵解途径份额Pemp和糖代谢中的憐酸戊糖途径份额 时PP代入到公式P = Pemp/Pppp中，计算出糖代谢中的糖酵解途径和憐酸戊糖途径的比例P。
[00巧]实施例5
[0076] 第一，选取胁迫环境2中构树植株，取第二、第=和第四完全展开叶各一片；
[0077] 第二，将上述叶片剪碎充分混合，取其中0.1 g进行酶液的提取；
[0078] 第S，测定构树叶片中糖酵解途径限速酶憐酸果糖激酶(PFK)的酶活力EApfk和憐 酸戊糖途径限速酶葡萄糖-6-憐酸脱氨酶(G6PDH)的酶活力EAgSpdh;计算糖代谢关键酶的总 活性EAe;
[0079] 第四，将EApfk、EAgSp化和EAe分别带入扣MP = EApfk/EAE、Pppp = EAg6pdh/EAE计算出糖代 谢中的糖酵解途径份额扣MP和糖代谢中的憐酸戊糖途径份额Pppp ;
[0080] 第五，最后，将糖代谢中的糖酵解途径份额Pemp和糖代谢中的憐酸戊糖途径份额 时PP代入到公式P = Pemp/Pppp中，计算出糖代谢中的糖酵解途径和憐酸戊糖途径的比例P。 [0081 ] 实施例6
[0082] 第一，选取胁迫环境2中桑树植株，取第二、第=和第四完全展开叶各一片；
[0083] 第二，将上述叶片剪碎充分混合，取其中0.1 g进行酶液的提取；
[0084] 第S，测定构树叶片中糖酵解途径限速酶憐酸果糖激酶(PFK)的酶活力EApfk和憐 酸戊糖途径限速酶葡萄糖-6-憐酸脱氨酶(G6PDH)的酶活力EAgSpdh;计算糖代谢关键酶的总 活性EAe;
[00化]第四，将EApfk、EAgSp化和EAe分别带入扣MP = EApfk/EAE、Pppp = EAg6pdh/EAE计算出糖代 谢中的糖酵解途径份额扣MP和糖代谢中的憐酸戊糖途径份额Pppp ;
[0086] 第五，最后，将糖代谢中的糖酵解途径份额Pemp和糖代谢中的憐酸戊糖途径份额 时PP代入到公式P = Pemp/Pppp中，计算出糖代谢中的糖酵解途径和憐酸戊糖途径的比例P。
[0087] 本发明的实施效果如下：
[0088] 分别将构树和桑树分成S个处理组培养，S个处理组分别是对照组（1/2化agland 营养液）、胁迫组l(l/2Hoagland营养液+SOg L-ipEG6000)和胁迫组2(l/2Hoagland营养液+ 30mM化肥化）。培养6天后分别取叶片测定植株叶片中憐酸果糖激酶(PFK)和葡萄糖-6-憐 酸脱氨酶(G6PDH)的活性，并计算出糖酵解途径和憐酸戊糖途径之间的比值Pemp:Pppp，其结 果如W下表所示(表1)。
[0089] 从表1中可W看出，桑树和构树在对照条件下Pemp :Pppp的比值分别为74% : 26%和 76 % : 24 %，其结果较为接近。在胁迫条件下，測n可W看到时PP的比值分布在52 % - 64 %之 间，运与逆境下植物W增强憐酸戊糖途径来适应环境的事实相符的。也与前人的估算结果 相近的。
[0091]
[0090] 表1桑树和构树在不同处理条件下糖酵解途径和憐酸戊糖途径之间的比值
[0092]
[0093] 从W上数据可看出，利用本发明获取葡萄糖代谢在EMP途径和PPP途径之间分配比 例的方法简单可靠，能够很好的说明在不同环境条件下生物体内葡萄糖在EMP途径和PPP途 径之间的歧化情况。
【主权项】
1. 一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的方法，其特征在于：它 包括以下步骤:第一，选取待测植株，取第二、第三和第四完全展开叶各一片;第二，将上述 叶片剪碎充分混合，取其中进行酶液的提取;第三，测定上述提取的酶液中以单位体积单位 时间吸光度变化值表示的磷酸果糖激酶活力EA pfk;第四，测定上述提取的酶液中以单位体 积单位时间吸光度变化值表示的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EA g6pdh;第五，将磷酸果糖 激酶的酶活力EApfk与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EA g6pdh累加获得糖代谢关键酶的总活 性ΕΑΣ，计算公式为EAj： = EApfk+EAg6pdh;第六，依据磷酸果糖激酶的酶活力EApfk和糖代谢关键 酶的总活性ΕΑ Σ，计算出糖代谢中的糖酵解途径份额Pemp，计算公式为Pemp = EApfk/EAj：;第七， 依据葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EAg6pdh和糖代谢关键酶的总活性ΕΑ Σ，计算出糖代谢中 的磷酸戊糖途径份额Pppp ;计算公式为PPPP = EAg6pdh/EAj：;第八，依据糖代谢中的糖酵解途径 份额Pemp和糖代谢中的磷酸戊糖途径份额Pppp，计算出糖代谢中的糖酵解途径和磷酸戊糖途 径的比例P，计算公式为P = Pemp/Pppp。2. 根据权利要求1所述的一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的 方法，其特征在于:在第二步中，酶液的提取方法为:取的叶片组织放置于冰浴研钵中，加入 液氮进行冷冻研磨，待液氮挥发后，加入酶提取液;把研磨后的匀浆移入离心管中，离心，取 上清液冷藏待测；其中酶提取液为HEPES Tris-HCl、MgCl2、EDTA、二硫苏糖醇和苯甲基磺酰 氟;这里的HEPES为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，Tris-HCl为盐酸三羟甲基氨基甲烷，EDTA为乙二 胺四乙酸。3. 根据权利要求1所述的一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的 方法，其特征在于:在第四步骤中，酶液中磷酸果糖激酶的酶活力EA pfk的测定方法为:磷酸 果糖激酶的酶活力等于ATP-PFK酶活力加上PPi-PFK酶活力。4. 根据权利要求1所述的一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的 方法，其特征在于:在第五步骤中，酶液中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EA g6pdh的测定方法 为:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力等于G6TOH和6PGDH总酶活力减去6PGDH酶活力。5. 根据权利要求1所述的一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的 方法，其特征在于:在第六、七和八步骤中，糖代谢中的糖酵解途径份额、糖代谢中的磷酸戊 糖途径份额以及糖代谢中的糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例均以百分比值来进行体现。6. 根据权利要求3所述的一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的 方法，其特征在于= ATP-PFK酶活力的测定方法如下，把酶提取液加入到ATP-PFK酶活分析液 中，利用紫外分光光度计在340nm处测定反应混合液中5min的吸光度的变化Dl ;ATP-PFK酶 活分析液pH 7.8,包括50mM HEPES Tris-HCl，2.5mM MgCl2,0.1 mM NADH，5mM果糖-6-磷酸， 2unit mL的醛缩酶，lunit mL丙糖磷酸异构酶，2unit mL 3-磷酸甘油脱氢酶和ImMATP，所 述的PFK为磷酸果糖激酶，ATP为三磷酸腺苷，PPi为焦磷酸，NADH为还原型烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸或还原型辅酶I。7. 根据权利要求3所述的一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的 方法，其特征在于:PPi-PFK酶活力的测定方法如下:把酶提取液加入到PPi-PFK酶活分析液 中，利用紫外分光光度计在340nm处测定反应混合液中5min的吸光度的变化D2;PPi-PFK酶 活分析液pH 7.8,包括50mM HEPES Tris-HCl，2.5mM MgCl2,0.1mMNADH，5mM果糖-6-磷酸， 2unit mL的醛缩酶，lunit mL丙糖磷酸异构酶，2unit mL 3-磷酸甘油脱氢酶和ImM PPi;酶 液中磷酸果糖激酶的酶活力EApfk可表示为D1+D2;所述的PFK为磷酸果糖激酶，ATP为三磷酸 腺苷，PPi为焦磷酸，NADH为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或还原型辅酶I。8. 根据权利要求4所述的一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的 方法，其特征在于:测定G6PDH和6P⑶H的总活力的方法为:把酶提取液加入到G6PDH和6P⑶H 总酶活分析液中，利用紫外分光光度计在340nm处测定反应混合液中5min的吸光度的变化 DT;G6PDH和6P⑶!1总酶活分析液pH 7.8,包括50mM HEPES Tris-HCl，3.3mM MgCl2,0.5mM 6-磷酸葡萄糖酸脂二钠盐，〇. 5mM 6-磷酸葡萄糖酸脂和0.5mM NADPNa2，所述的G6TOH为葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶，6PGDH为6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，NADPNa 2为氧化型型辅酶II二钠盐。9. 根据权利要求4所述的一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的 方法，其特征在于:6PGDH的酶活力的测定方法:把酶提取液加入到6PGDH酶活分析液中，利 用紫外分光光度计在340nm处测定反应混合液中5min的吸光度的变化D P;6PGDH酶活分析液 pH 7.8,包括50mM HEPES Tris-HCl，3.3mM MgCl2,0.5mM6-磷酸葡萄糖酸脂和O .5mM NADPNa2;酶液中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EAg6Pdh可表示为Dt-Dp ;所述的G6roH为葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶，6PGDH为6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，NADPNa2为氧化型辅酶II二钠盐。
【文档编号】G01N21/33GK105954221SQ201610303346
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】吴沿友, 姚凯, 杭红涛, 王瑞, 张开艳, 饶森, 陆叶, 赵丽华, 李海涛, 刘丛强
【申请人】中国科学院地球化学研究所