一种检测炎症性肌病特异性自身抗体mda5的非放射标记免疫沉淀方法及应用
【专利摘要】本申请公开了一种检测炎症性肌病特异性自身抗体MDA5的非放射标记免疫沉淀方法，本发明通过提供下述方法：构建含MDA5C末端(447?1025aa)以及N端带有Myc标签的质粒pCMV?myc?MDA5C，瞬时转染HEK293细胞，炎症性肌病患者的待测血清与过表达MDA5C末端的HEK293细胞裂解液进行免疫沉淀，然后进行SDS?PAGE凝胶电泳，用c?myc抗体检测沉淀的MDA5C末端，解决了目前国内还没有商业化的检测MDA5抗体的ELISA试剂盒以及免疫印迹膜条的问题，以及自行包被MDA5抗原的ELISA试剂盒的高成本、高假阳性率和放射标记免疫沉淀法的安全性等问题。
【专利说明】
一种检测炎症性肌病特异性自身抗体MDA5的非放射标记免疫 沉淀方法及应用
技术领域
[0001 ]本申请属于生物技术领域，具体地说，涉及一种检测炎症性肌病特异性自身抗体 MDA5的非放射标记免疫沉淀方法及应用。
【背景技术】
[0002]特发性炎症性肌病（idiopathic inflammatory myopathies，IIM)是一组以侵害 骨骼肌为主的系统性自身免疫性疾病，自身免疫的异常是ΠΜ的发生、发展的关键。根据最 近的途断分类标准，ΠΜ可分为多发性肌炎(polymyositis，PM)、皮肌炎(dermatomyositis， DM)、免疫介导的坏死性肌炎（immune-mediated necrotizing myopathy，IMNM)、非特异性 肌炎（nonspecific myositis，NSM)和包涵体肌炎（inclusion body myositis，sIBM)DIIM 临床特点表现为四肢近端肌无力、特征性皮疹、系统性损害以及血清中存在多种自身抗体， 这些自身抗体与临床表型密切相关（Mei Zong&Ingrid E · Lundberg · Pathogenesis， classification and treatment of inflammatory myopathies.Nature Reviews Rheumatology,2011,7,297-306.)〇
[0003] IIM患者的自身抗体主要分为肌炎特异性自身抗体（myosi t i s spec if i c autoantibodies，MSAs)和肌炎相关性自身抗体(myositis associated autoantibodies， MAAs) 传统的MSAs包括抗氨基酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase，ARS)抗体、抗 Mi-2抗体和抗信号识别颗粒(signal recognition parti cl e，SRP)抗体，近些年也发现多 种新的MSAs，如抗黑色素瘤分化相关基因 （melanoma differentiation associated gene 5，MDA5)抗体、抗核基质蛋白2(nuclear matrix protein 2，NXP2)抗体、抗转录中介因子1 (transcriptional intermediary factor 1，TIF1)抗体等，MSAs-般仅见于ΠΜ患者，对于 疾病的临床-血清学分类有重要的指导意义（Sarah L Tansley，Zoe E，Betteridge，Neil J,McHugh. The diagnostic utility of autoantibodies in adult and juvenile myositis.Current Opinion in Rheumatology，2013，25(6):772-777·)〇
[0004] MDA5是一种细胞质RNA解旋酶，在病毒感染时，可通过上调MDA5的表达抑制病毒复 制，调节固有免疫，从而控制病毒感染。MDA5也可以与病毒RNA结合，促进干扰素及细胞因子 的释放（Masahide Funabiki，Hiroki Kato , Yoshiki Miyachi et al. Autoimmune disorders associated with gain of function of the intracellular sensor MDA5. Immunity 2014,40:199-212.)〇Sato(Shinji Sato,Michito Hirakata，Masataka Kuwana et al.Autoantibodies to a 140-kd polypeptide，CADM-140，in Japanese patients with clinically amyopathic dermatomyositis .Arthritis&Rheumstism, 2005,52: 1571-1576.)等通过免疫沉淀法和免疫印迹法发现8例临床无肌病性皮肌炎 (clinical amyopathic derma tomyosit is，CADM)患者血清中存在一种针对分子质量为 140KD多肽的自身抗体，命名为抗CADM-140抗体，进一步研究证实抗CADM-140抗体的靶抗原 是位于细胞核内的黑色素瘤分化相关基因（MDA5)，并且鉴定MDA5的C末端(447-1025aa)是 抗原表位所在位置（Shinji Sato，Kana Hoshino，Takashi Satoh et al.RNA helicase encoded by melanoma differentiation-associated gene 5is a major autoantigen in patients with clinically amyopathic dermatomyositis:Association with rapidly progressive interstitial lung disease .Arthritis&Rheumstism,2009,60: 2193-2200.；Ran Nakashima,Yoshitaka Imura,Shio Kobayashi et al.The RIG-I-like receptor IFIH1/MDA5 is a dermatomyositis-specific autoantigen identified by the anti-CADM_140antibody·Rheumatology，2010，49:443_440·)。在亚洲国家，DM患者中 抗MDA5抗体的阳性率约为19-35% (Fang Chen，Dongxue Wang，Xiaoming Shu et al.Anti-MDA5 antibody is associated with A/SIP and decreased T cells in peripheral blood and predicts poor prognosis of ILD in Chinese patients with dermatomyositis.Rheumatol Int 2012;32:3909-3915.)，而欧美国家约为6.9-13% (John C. Hal 1, Li via Casciola-Rosen，Lesly_Ann Samedy et al.Anti-Melanoma Differentiation-Associated Protein 5-Associated Dermatomyositis:Expanding the Clinical Spectrum.Arthritis Care&Research2013；65:1307-1315；Moises Labrador- Horrillo，Maria Angeles Martinez，Albert Selva-0'Callaghan et al.Anti-MDA5 Antibodies in a Large Mediterranean Population of Adults with Dermatomyositis.Journal of Immunology Research.2014doi:10.1155/2014/290797； David Fiorentino，Lorinda Chung , Jeff Zwerner et al. The mucocutaneous and systemic phenotype of dermatomyosi tis patients with antibodies to MDA5(CADM-140) :A retrospective study.J Am Acad Dermatol2011，65:25_34.)，提;^遗传或环境因 素在抗CADM-140抗体的产生过程中起到一定作用。多项研究证实，抗MDA5抗体阳性患者中 肺间质病变（Interstitial lung disease，ILD)的发生率显著高于抗体阴性患者，且约 50%抗体阳性的患者表现为急性进展性11^，预后更差（31&11^1^1〇81^(13111-1(13,〇^8七6『 V.Oddis,Shinji Sato et al.Anti-MDA5 is associated with rapidly progressive lung disease and poor survival in U.S.patients with amyopathic and myopathic dermatomyositis.Arthritis Care Res(Hoboken)2015doi:10·1002/acr·22728·)。此外， 抗体阳性患者更容易发生皮肤黏膜损害如皮肤溃疡、斑丘疹、脂膜炎、口腔溃疡和脱发等 (Neera S.Narang,Livia Casciola-Rosen,Shufeng Li et al.Cutaneous Ulceration in Dermatomyositis:Association With Anti-Melanoma Differentiation-Associated Gene 5Antibodies and Interstitial Lung Disease.Arthritis Care Res(Hoboken) 2015;67:667-672.)。陈芳等对我国113例PM/DM患者的研究发现，抗MDA5抗体在DM中的阳性 率22.6%，其中78.9%的抗体阳性患者合并急性/亚急性间质性肺炎(A/SIP)，多因素分析 得出血清抗MDA5抗体阳性可能是DM合并ILD患者死亡的独立危险因素3有研究报道抗 MDA5抗体滴度与DM合并ILD患者的疾病活动度密切相关，经治疗缓解后，抗体滴度会相应下 降甚至转阴，而治疗无效者则维持高水平（Shin j i Sato，Masataka Kuwana，Takashi Fujita et al.Anti-CADM-140/MDA5 autoantibody titer correlates with disease activity and predicts disease outcome in patients with dermatomyositis and rapidly progressive interstitial lung disease.Mod Rheumatol 2013,23:496-502.) ^因此认为抗MDA5抗体的检测可作为判断CADM合并ILD病情活动度、治疗疗效及预后 的有效血清标志物。
[0005] 检测自身免疫性疾病自身抗体的主要方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、放射标记 的免疫沉淀方法、免疫印迹法，但是目前国内还没有商业化的检测MDA5抗体的ELISA试剂盒 以及免疫印迹膜条，大部分实验室对于MDA5抗体的检测包括：（1)购买纯化的MDA5蛋白包被 酶标反应板，加入待测血清后孵育，使用酶标的抗人免疫球蛋白抗体可以检测出与抗原结 合的抗体，随后用合适的酶底物进行显色；（2)购买纯化的MDA5蛋白与待测血清进行免疫沉 淀，采用western Blot检测沉淀后的产物；（3)采用S35标记Hela细胞，然后用待测血清进行 免疫沉淀，SDS-PAGE电泳分离沉淀物，放射自显影，这是检测MSA的金标准。以上方法各有优 缺点，酶联免疫吸附法为自身抗体的检测提供了敏感性高且较迅速的方法，但是目前尚无 商业化的检测MDA5抗体的ELISA试剂盒，这种方法需要高度纯化的抗原，而且抗原包被的条 件需要最优化，容易出现假阳性的结果，需要批量操作，对于发病率不是那么高的炎症性肌 病，导致成本的增加;作为金标准的放射标记免疫沉淀法有很高的特异性和敏感性，而且这 种方法沉淀的是以天然构象存在的抗原以及与靶抗原相互作用的蛋白分子，但是放射同位 素只能用于装备良好的实验室，并要求严格控制，不适合推广使用。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本申请针对上述问题，提供了一种检测炎症性肌病特异性自身抗体 MDA5的非放射标记免疫沉淀方法及应用，解决了目前国内还没有商业化的检测MDA5抗体的 ELISA试剂盒以及免疫印迹膜条的问题，以及自行包被MDA5抗原的ELISA试剂盒的高成本、 高假阳性率和放射标记免疫沉淀法的安全性等问题。
[0007] 为了解决上述技术问题，本申请公开了一种检测炎症性肌病特异性自身抗体MDA5 的非放射标记免疫沉淀方法，包括以下步骤：
[0008] 1)利用引物MDA5-F和MDA5-R从PENTER-MDA5质粒中扩增人MDA5的C末端；
[0009] 2)回收纯化PCR片段克隆至pCMV-myc载体，构建含MDA5 C末端以及N端带有Myc标 签的质粒P CMV-my c -MD A 5C，酶切鉴定确定p CMV-my c -MD A 5 C的插入子；
[0010] 3)测序证实MDA5 C末端序列和读码框的准确性；
[0011] 4)将pCMV-myc-MDA5C质粒瞬时转染HEK293细胞48小时，采用western Blot以及c-myc抗体或MDA5抗体确定MDA5 C末端在HEK293细胞中的过表达；
[0012] 5)采用20ul MDA5抗体阳性的炎症性肌病患者血清或健康对照血清与200ug过表 达MDA5 C端的细胞裂解液进行免疫沉淀，然后进行SDS-PAGE凝胶电泳，用c-myc抗体进行检 测。
[0013] 进一步地，引物MDA5-F的序列如SEQ ID N0:1所示，所述引物MDA5-R的序列如SEQ ID N0:2所示。
[0014] 本发明还公开了一种引物包括引物MDA5-F和引物MDA5-R，引物MDA5-F的序列如 SEQIDN0:1所示，引物MDA5-R的序列如SEQIDN0:2所示。
[0015]本发明还公开了一种质粒pCMV-myc-MDA5C在检测炎症性肌病特异性自身抗体 MDA5中的应用。
[0016]与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：
[0017] 1)在真核细胞中表达抗原表位所在的MDA5 C末端，该蛋白分子的分子量变小，更 易于转染和高表达，增加免疫沉淀的敏感性；
[0018] 2)HEK293细胞中高表达的MDA5 C末端是以天然构象与血清中的MDA5抗体相结合， 增加免疫沉淀的特异性。
【附图说明】
[0019] 此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申 请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
[0020] 图1是本申请PCR扩增人MDA5的C末端以及pCMV-myc-MDA5C质粒的酶切鉴定结果； 其中，（a)、PCR扩增人MDA5的C末端；（b)、pCMV-myc-MDA5C质粒的酶切鉴定结果；
[0021] 图2是本申请构建的含MDA5 C末端以及N端带有Myc标签的pCMV-myc-MDA5C质粒图 谱；
[0022] 图3是本申请测序证实pCMV-myc-MDA5C质粒中MDA5 C末端序列和读码框的准确 性；
[0023] 图4是本申请Western Blot检测pCMV-myc-MDA5C质粒在HEK293细胞的过表达；其 中，（a)、c-myc抗体检测pCMV-myc-MDA5C质粒在HEK293细胞的过表达；（b)、MDA5抗体检测 pCMV-myc-MDA5C质粒在HEK293细胞的过表达；
[0024] 图5是本申请采用MDA5抗体阳性的炎症性肌病患者血清或健康对照血清与过表达 MDA5 C端的HEK293细胞裂解液进行免疫沉淀，western Blot检测沉淀的MDA5蛋白，从而证 实炎症性肌病患者血清中MDA5抗体能够识别HEK293细胞中的含Myc标签的MDA5 C端；
[0025] 图6是本申请采用建立的非放射标记免疫沉淀方法筛选炎症性肌病患者血清中的 MDA5抗体;其中，HC为健康对照，頂为炎症性肌病。
【具体实施方式】
[0026] 以下将配合附图及实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用 技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
[0027] 实施例1检测炎症性肌病特异性自身抗体MDA5的非放射标记免疫沉淀方法
[0028] (1)设计引物|?^5-卩（5'-1'1^661^6八0^八〇八八八6八八6〇八6丁6丁八-3'）和]\?^5-1?(5'-GCGGTACCCTAATCCTCATCACTAAATAAACA G-3'）从pENTER-MDA5质粒中扩增人MDA5的C末端 (Genbank:NM022168，1743bp-3479bp)(图la) 〇
[0029] (2)回收纯化PCR片段，用Sal I和ΚρηI限制性内切酶进行双酶切，与Sal I和ΚρηΙ已 双酶切的pCMV-myc载体连接过夜，转化JM109细菌感受态，在含50ug/ml氨苄青霉素的平板 上筛选阳性克隆，小量提取阳性克隆的质粒DNA，用Sal I和ΚρηΙ酶切该质粒DNA，结果显示该 质粒含1.7kb的插入子(图lb)。
[0030] (3)将该质粒DNA进行测序，证实MDA5 C末端序列和读码框(447-1025aa)的准确性 (图3)，结果提示含MDA5 C末端(GenBank: AAG34368，447-1025aa)以及N端带有Myc标签的质 粒pCMV-myC-MDA5C构建成功(图2)。
[0031] (4)将4ug pCMV-myc-MDA5C质粒或pCMV-myc瞬时转染HEK293细胞48小时，SDS裂解 液裂解HEK293细胞，进行SDS-PAGE凝胶电泳和转膜，一张膜采用c-myc抗体进行孵育，发现 转染pCMV-myc-MDA5C质粒的HEK293细胞中有约为70Kd的特异性条带，而转染pCMV-myc质粒 的HEK293细胞中没有特异性条带（图4a);同时另一张膜采用MDA5抗体进行孵育，发现70Kd 的特异性条带也能被MDA5抗体识别（图4b)，以上结果提示pCMV-myc-MDA5C质粒能在HEK293 细胞中过表达，表达的蛋白质约为70Kd的带有Myc标签的MDA5 C末端。
[0032] (5)取50ul Protein G Magnetic Bead悬液与20ul MDA5抗体阳性的炎症性肌病 患者血清/健康对照血清室温持续混匀1 h以捕获抗体；反应后用5 0 0 μ L P B S (含0.1 % Tween(i〇20)洗涤磁珠3-5次，加入300ug过表达MDA5-C端的ΗΕΚ293细胞裂解液，并用RIPA (含1%蛋白酶抑制剂)裂解液补足体积至500ul，2-8°C持续混匀过夜进行抗原吸附。重复上 述清洗磁珠步骤3-5次，向其中加入40yL IXSDS-PAGE Loading Buffer混合均匀，70-90°C 加热lOmin。立即收集上清液至新的EP管。上述样品于10%SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜 上，加入C-myc抗体杂交，ECL化学发光，证实炎症性肌病患者血清的MDA5抗体能够特异性地 将HEK293细胞中过表达的带Myc标签的MDA5 C末端沉淀下来(图5)。
[0033]实施例2检测50例炎症性肌病患者血清的MDA5抗体的阳性率 [0034] (1)接种30 %HEK293细胞于75cm2的细胞培养皿，37培养小于24小时；
[0035] (2)将30ug pCMV-myc-MDA5C质粒转染HEK293细胞48小时；
[0036] (3)采用1ml含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解HEK293细胞，蛋白进行定量；
[0037] (4)采用c-myc抗体证实HEK293细胞中过表达的MDA5 C末端。
[0038] 取20ul炎性肌病患者待测血清、阳性血清、阴性血清与过表达MDA5 C末端的细胞 裂解液进行免疫沉淀，进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后用c-myc抗体进行检测，确定MDA5抗体 在炎症性肌病患者中的阳性率约为10 % (图6为部分检测的炎症性肌病患者）。
[0039]上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非 局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改 和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行 改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权 利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种检测炎症性肌病特异性自身抗体MDA5的非放射标记免疫沉淀方法，其特征在 于，包括以下步骤： 1) 利用引物MDA5-F和MDA5-R从pENTER-MDA5质粒中扩增人MDA5的C末端； 2) 回收纯化PCR片段克隆至pCMV-myc载体，构建含MDA5C末端以及N端带有Myc标签的质 粒pCMV-myc_MDA5C，酶切鉴定确定pCMV-myc_MDA5C的插入子； 3) 测序证实MDA5C末端序列和读码框的准确性； 4) 将pCMV-myc_MDA5C质粒瞬时转染HEK293细胞48小时，米用western Blot以及c-myc 抗体或MDA5抗体确定MDA5C末端在HEK293细胞中的过表达； 5) 采用20ul MDA5抗体阳性的炎症性肌病患者血清或健康对照血清与200ug过表达 MDA5C端的细胞裂解液进行免疫沉淀，然后进行SDS-PAGE凝胶电泳，用c-myc抗体进行检测。2. 根据权利要求1所述的检测炎症性肌病特异性自身抗体MDA5的非放射标记免疫沉淀 方法，其特征在于，所述引物MDA5-F的序列如SEQ ID NO: 1所示，所述引物MDA5-R的序列如 SEQIDN0:2**。3. 引物对在检测炎症性肌病特异性自身抗体MDA5中的应用，其特征在于，所述引物对 包括引物MDA5-F和引物MDA5-R，所述引物MDA5-F的序列如SEQ ID NO: 1所示，所述引物 MDA5-R的序列如SEQIDN0:2所示。4. 质粒pCMV-myc-MDA5C在检测炎症性肌病特异性自身抗体MDA5中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK105974124SQ201610332542
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】张华莉, 王莉, 左晓霞, 朱红林, 罗卉, 李懿莎, 贺维佳, 刘可, 刘梅冬, 陈广文, 肖献忠
【申请人】中南大学