一种定量糖蛋白上n-连唾液酸化糖链占有率的方法及其在肝癌标志物筛选中的应用
【专利摘要】本发明涉及一种定量糖蛋白上N-连唾液酸化糖链占有率的方法及其在肝癌标志物筛选中的应用。首先取同一种状态下含糖蛋白的生物样品等量两份，然后用高碘酸钠溶液对其分别处理以进行差异氧化，之后利用蛋白层次上的酰肼化学法富集差异氧化后的样品中的糖蛋白，然后利用不同稳定同位素差异标记酰肼微球上的糖肽，再然后用肽糖苷酶PNGase F处理，最后对混合差异标记的N-糖肽进行质谱分析，以定量N-连唾液酸化糖链的占有率。本方法可以用于糖基化修饰的蛋白质组学分析，能同时获取相应的糖蛋白、糖肽和糖基化位点的鉴定结果，尤其可用于人肝癌(HCC)的潜在生物标志物的筛选。本方法简便，高效。
【专利说明】
-种定量糖蛋白上N-连唾液酸化糖链占有率的方法及其 在肝癌标志物筛选中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于蛋白质组学研究方向糖基化蛋白质组学技术领域，具体设及基于酷阱 化学的差异氧化和标记法高通量定量糖蛋白上N-连唾液酸化糖链占有率的方法及其在肝 癌标志物筛选中的应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白质糖基化作为一种最普遍且最重要的翻译后修饰，在蛋白质折叠、构象稳定 和活性等方面起着重要的作用。糖基化蛋白质（简称糖蛋白）参与了细胞与细胞、细胞与细 胞外基质的分子识别、细胞调亡、蛋白质相互作用、免疫应答等生命过程。因此，糖蛋白的异 常变化往往伴随着许多疾病的发生和发展。也就是说，某一疾病中异常的糖蛋白可W作为 该疾病的标志物。目前，临床上所用的疾病标志物大多是糖基化蛋白质，如甲胎蛋白（AFP) 是肝癌的标志蛋白，癌症抗原125 (cancer antigen 125)是恶性肿瘤的标志物，W及前列腺 癌的特异抗原等等。因此，对于糖蛋白的深入研究具有非常重要的意义。
[0003] 糖蛋白上N-连唾液酸化糖链是一种常见且非常重要的聚糖，唾液酸位于糖链的 末端。在细胞中，唾液酸化糖链有着诸多重要的生物学功能，包括细胞分子间相互作用， 细胞特征的形成，W及细胞代谢等等。对于运类糖基化蛋白的研究表明，糖蛋白的唾液酸 化的异常与很多癌症如乳腺癌，结肠癌，白血病，膜腺癌等密切相关，因此，蛋白质组学专 家们对于运类糖蛋白的关注度越来越高。目前已有多种糖蛋白质组学的方法用于唾液 酸化糖蛋白的定性和定量，包括特异的凝集素方法（文献1. Kubota, K. et al. Analysis of glycopeptides using lectin affinity chromatography with MLDI-TOF mass spectrometry. Analytical chemistry 80,3693-3698,doi:10. 1021/ac800070d(2008).)， 二氧化镜（文献 2. Larsen, M.民.，Jensen, S. S.，Jakobsen, L. A. &Heegaard, N. H. Exploring the sialiome using titanium dioxide chromatography and mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics 6, 1778-1787, doi:10. 1074/mcp. M700086-MCP200 (2007)?)和 钥；（IV)金属离子亲和色谱法（文献 3. Zhu，J.et al. A simple integrated system for rapid analysis of sialic-acid-containing N-gIycopeptides from human serum.Proteomics 13, 1306-1313, doi: 10. 1002/pmic. 201200367(2013).)，W 及改进 的醜阱化学方法（文献 4. Zeng, Y.，Ramya, T. N.，Dirksen, A.，Dawson, P. E. &Paulson, J. C. High-efficiency labeling of sialylated glycoproteins on living cells. Nature methods 6,207-209,doi:10. 1038/nmeth. 1305(2009)?文献 5.Nilsson, J. et al. Enrichment of glycopeptides for glycan structure and attachment site identification. Nature methods 6, 809-811，doi:10. 1038/nmeth. 1392 (2009)?文 南犬 6. Tian, Y.，Esteva, F. J.，Song, J. feZhang, H. Altered expression of sialylated glycoproteins in breast cancer using hydrazide chemistry and mass spectrometry. Mol. Cell?化oteomics，doi : 10. 1074/mcp. Mill. 011403 (2012) ?) D 改进的醜阱化学方法是 指用低浓度的高舰酸钢溶液在低溫下和短时间内去选择性氧化唾液酸化的糖蛋白或糖肤， 从而实现对其富集和分析。运些已报道的方法直接比较了疾病样品和正常样品间同一个糖 基化位点上唾液酸化的不同，而对于同一种状态的样品中的糖蛋白上的唾液酸化糖链的占 有率没有研究。
[0004] 唾液酸化糖链的占有率可定义为一个蛋白质上同一个糖基化位点上唾液酸化糖 链占所有糖链的摩尔比。研究表明，糖链的末端唾液酸可W被低浓度的高舰酸钢溶液选择 性氧化，而所有种类的糖链可W被高浓度的高舰酸钢溶液氧化。本发明首次利用不同浓度 的高舰酸钢溶液差异氧化同一个生物样品中的糖蛋白，发展了一种蛋白层次上高通量定量 糖蛋白上N-连唾液酸化糖链占有率的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种可W简便、准确、高通量定量复杂生物样品中糖蛋白 上N-连唾液酸化糖链占有率的方法。首先取同一种状态下含糖蛋白的生物样品等量两份， 然后用高舰酸钢溶液对其分别处理W进行差异氧化，之后利用蛋白层次上的酷阱化学法富 集差异氧化后的样品中的糖蛋白，再利用不同稳定同位素差异标记酷阱微球上的糖肤，然 后用肤糖巧酶PNGase F处理，最后对混合差异标记的N-糖肤进行质谱分析，W定量N-连 唾液酸化糖链的占有率。
[0006] 具体包含W下步骤，
[0007] 1)取同一种状态下含糖蛋白的生物样品等量两份，分别溶解在含6-8M化ea和 50-lOOmM NH4HCO3的缓冲溶液中，沸水加热失活5-lOmin，用蛋白除盐柱除去其中的小分子， 全蛋白在缓冲溶液中的浓度为2-lOmg/mL ;
[0008] 2)步骤1)结束后得到的两份经过处理的样品，一份用浓度为0. 5-lmM的高舰酸钢 溶液氧化，另一份用浓度为IO-ISmM的高舰酸钢溶液氧化，氧化之后的两个样品各W蛋白 除盐柱置换为含浓度为SO-IOOmM NaAC和130-150mM的化Cl的缓冲溶液，向两个溶液中各 加入预先W此缓冲溶液洗离过2~3次的酷阱微球，室溫震荡富集10-1化，酷阱微球自身所 占的体积与步骤2)所置换的缓冲溶液的体积比为1:5 ;
[0009] 扣步骤。结束后得到的酷阱微球用浓度为50-lOOmM的畑4肥〇3溶液洗离2~3 次W除去非糖蛋白，然后各分散在含浓度为6-8M的化ea和浓度为50-lOOmM的畑4肥〇3的 缓冲液中，用终浓度为10-20mM的孤T和浓度为20-40mM的IAA各依次处理后，再依次W 80-90% ACN(ACN和&0的体积比），50-lOOmM畑4肥〇3溶液各洗离2~3次，最后均分散在 50-lOOmM畑4肥〇3缓冲液中，酷阱微球自身所占的体积与加入的50-lOOmM畑4肥〇3缓冲液 的体积比为1:5,再各加入膜蛋白酶酶解12-1化，加入的膜蛋白酶的用量与步骤1)所取的 样品中蛋白质的质量比为1:25;
[0010] 4)步骤3)得到的微球各依次W 1. 0-1. 5M化Cl溶液，80-90 % ACN (ACN和&0的体 积比），50-lOOmM NH4HCO3溶液和水洗去非特异性吸附和非糖肤，并分别分散在200-400 iiL SO-IOOmM TEAB 中，分别取 8-16 y L 4-8wt % CD20/CH20(CD20 和邸2〇 都是 4 % -8 % )和 0. 6-1. 2M NaBHsCN各依次加入到两种样品中，室溫反应3-4h W实现糖肤的二甲基重/轻标 记，4-8 % 〇2〇/邸2〇与微球自身体积比为2:25-4:25,0. 6-1. 2M NaBHsCN与微球自身的体积 比为 2:25-4:25 ;
[0011] 5)在用水洗离步骤4)得到的酷阱微球2~3次后，各加入含500-100(KJnites PNGase F的10-20mM畑4肥〇3缓冲液震荡酶切10-1化，将二甲基标记的N-糖肤酶切 下来，将对应的轻标和重标的样品W等体积混合，所得的样品W MLDI-T0F/T0F mass spectrometer或LC-MS/MS分析，W定量N-连唾液酸化糖链的占有率；其中加入的含 PNGase F的缓冲溶液的体积与酷阱微球自身所占体积的比例为2:1-4:1。
[0012] 其中，步骤1)所述的除去的小分子为尿素、碳酸氨锭W及样品中其他分子量小于 7000Da的分子；步骤4)所述的IOOmM TEAB的抑为7. 5-8. 0。
[0013] 本发明所述的定量糖蛋白上N-连唾液酸化糖链占有率的方法可W用于糖基化修 饰的蛋白质组学分析，能同时获取相应的糖蛋白、糖肤和糖基化位点的鉴定结果，尤其可W 用于人肝癌（HCC)的潜在生物标志物的筛选。
[0014] 所述的基于酷阱化学的差异氧化和标记法用于高通量定量糖蛋白上N-连唾液酸 化糖链的占有率，所用的糖蛋白富集材料为商品化的琼脂糖酷阱微球度io-Rad，CA, USA)。
[0015] 所述的基于酷阱化学的差异氧化和标记法用于高通量定量糖蛋白上N-连唾液酸 化糖链的占有率，所用的定量方法为相对定量法。即用CDzO标记0. 5-lmM高舰酸钢溶液氧 化后富集的糖肤，用CHzO标记IO-ISmM高舰酸钢溶液氧化后富集的糖肤，两者等摩尔量混 合后进行质谱分析。
[0016] 本发明的优点：
[0017] 本发明所述方法具有明显的优点：简便，高效，高通量。酷阱化学法富集糖肤已在 糖蛋白质组学分析中广泛应用，它具有材料易得，操作简便，富集特异性高，高效等优点。本 发明的实验流程是在蛋白层次上运用酷阱化学法，使得一个样品的整个操作流程可W在一 个样品管中完成，大大简化了操作，节省了时间。本发明首次利用酷阱化学法中不同浓度的 高舰酸钢溶液差异氧化同一个糖蛋白上的末端是唾液酸的糖链和全部类型的糖链，再利用 轻重同位素标记和高分辨率的RPLC-MS/MS分析，从而实现对分析样品中N-连唾液酸糖链 占有率的高效、高通量定量。
【附图说明】
[0018] 下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明：
[0019] 图1为所述基于酷阱化学的差异氧化和标记法高通量定量糖蛋白上N-连唾液酸 化糖链占有率的实验流程图。
[0020] 图2A为所述基于酷阱化学的差异氧化和标记法用于特异性富集、定量标准糖蛋 白一人血清转铁蛋白（Transferrin from human blood plasma, HT)上N-连唾液酸化糖 链占有率的MLDT-TOF质谱图；图2B为所述基于酷阱化学的差异氧化和标记法用于特异 性富集、定量标准糖蛋白一部分去唾液酸化的人血清转铁蛋白（Asialo transferrin化om human blood plasma, AHT)上N-连唾液酸化糖链占有率的MALDT-TOF质谱图。
[0021] 图3A为所述基于酷阱化学的差异氧化和标记法定量到的人肝癌组织（肥C)和正 常肝组织（Normal)中糖蛋白上N-连唾液酸化糖链占有率的Lo拓值的分布图；图3B为所 述基于酷阱化学的差异氧化和标记法定量到的人肝癌组织（肥C)和正常肝组织（Normal) 中同时存在的糖蛋白上N-连糖基化位点数图。
[0022] 图4为所述基于酷阱化学的差异氧化和标记法定量到的人肝癌组织（肥C)和正常 肝组织（Normal)中同时存在的糖蛋白上N-连唾液酸化糖链的占有率的比值的Log2值的 分布图。
【具体实施方式】 阳〇2引材料与试剂： |；0024]人血清转铁蛋白（Transferrin from human blood plasma, HT)，高舰 酸钢（sodium periodate)，二硫苏糖醇（I, 4-dithiot虹eitol, DTT)，舰代乙酷胺 (iodacetamide, IAA)，膜蛋白酶（t;rypsin)，2, 5-二径基苯甲酸化 5-dihy化〇巧1 benzoic acid, D皿）和S乙基碳酸氨锭（triethylammonium bicarbonate buffer, TEAB)缓冲液均 购自 Sigma 公司（]X,U.S.A.)。蛋白除盐柱狂eba Spin desalting columns)购自 Thermo Scientific 公司（]X,U.S. A.)。琼脂糖酷阱微球（hy 化azide Se地arose resin)购自 Bio-Rad 公司（CA, U. S. A.)。肤糖巧酶（P巧tide-N-glycosidase F, PNGase 巧和去唾液 酸酶（Neuraminidase)购自化W !England Biol油S公司（MA, U. S. A.)。实验用水经购自 Millipore公司（MA，U.S.A.)的Milli-Q水处理系统纯化。其他试剂均为分析纯或更高纯 度。 阳O巧]实施例1定量标准糖蛋白上N-连唾液酸化糖链的占有率 [00%] 人血清转铁蛋白（HT)是一种简单易得的糖蛋白，它的两个N-糖基化位点上的糖 链末端均是唾液酸（文献 7. Satomi, Y.,化imonishi, Y. , Hase, T. &Takao, T. Site-specific C曰rbohydr曰te profiling of human transferrin by nano-flow liquid chromatography/ electrospray ionization mass spectrometry. Rapid communications in mass spectro metry:RCM18, 2983-2988, doi: 10. 1002/rcm. 1718(2004).)。末端唾液酸可W被去唾液酸酶 部分去除，得到去唾液酸化的转铁蛋白（AHT)(文献6)。利用本发明所述的方法定量运两 种标准糖蛋白上N-连唾液酸化糖链占有率的实验流程如图1所示。
[0027] 1.两种标准糖蛋白各取两份Img，分别溶解在IOOyL含8M化ea和IOOmM畑4肥化 的缓冲液中（pH 8. 2)，在沸水中加热失活IOmin后，用蛋白除盐柱除去小分子。接下来的实 验是对四个样品分别、平行进行操作。
[0028] 2. HT和AHT各一份用ImM高舰酸钢氧化，另一份用IOmM高舰酸钢氧化。四个样品 各W蛋白除盐柱置换为含IOOmM NaAc和150mM化Cl的缓冲溶液（pH 5. W后，各加入预先 W此缓冲溶液洗离过两次的100 y L酷阱微球（微球自身所占体积），室溫震荡富集过夜。
[0029] 3.酷阱微球用500 y L IOOmM畑4肥〇3 (抑8.。洗离立次W除去非糖蛋白，然后各 分散在500 y L含8M Urea和IOOmM畑4肥〇3的缓冲液中（pH 8. 2)。用终浓度为IOmM DTT 和20mM IAA处理后，再依次W 500 y L 80% ACN，IOOmM畑4肥〇3各洗离立次，最后均分散在 SOOiiL IOOmM畑4肥〇3中，各加入40 yg膜蛋白酶酶解过夜。
[0030] 4.依次W 500 y L 1. 5M化Cl, 80% ACN, IOOmM畑4肥〇3溶液和水洗去非特异性吸 附和非糖肤，并分别分散在400 y L IOOmM TEAB (pH 8.0)中。分别取16 y L 4% CD2O/CH2O 和16 ii L 0. 6M NaBHsCN依次加入ImM/lOmM高舰酸钢氧化的样品中，室溫反应Sh W实现二 甲基重/轻标记。 阳03U 5.在用水洗离酷阱微球立次后，各加入200 y L含SOOUnites PNGase F的IOmM 畑4肥〇3缓冲液震荡酶切过夜，将二甲基标记的N-糖肤酶切下来。将HT和AHT对应的轻标 和重标的样品各自W等体积混合，所得的两个样品，即HT-10mM_L-and-lmM_H和AHT-10mM_ kand-lmM_H。分别 W MALDI-TOF/TOF mass spectrometer 分析。 阳0巧分析结果： 阳03引如图2A和2B所示，HT中轻重标记的糖肤W相近峰强度被检出，而AHT中两个N-连 糖基化位点对应的重标标记的糖肤的峰强度明显低于轻标标记的糖肤的峰强度。图2A说 明HT的两个糖基化位点上N-连唾液酸化糖链的占有率接近100 %，运与文献报道的一致 (文献7)。图2B说明N-连唾液酸化糖链去唾液酸后，其对应的糖肤的峰强度也随之降低。 因此，两种糖蛋白的对应的糖基化位点上N-连唾液酸化糖链的占有率可W由重标糖肤的 峰强度比上轻标糖肤的峰强度计算得到（H/L),如表1所示。显然，本发明设计的方法可W 简便、高效的定量糖蛋白上N-连唾液酸化糖链的占有率。
[0034] 表1.所述基于酷阱化学的差异氧化和标记法定量到的HT和AHT上N-连唾液酸 化糖链的占有率
[0035]
[0036] 实施例2
[0037] 我们将此方法用于分别定量肝癌病人的肝组织和正常人的肝组织中糖蛋白上 N-连唾液酸化糖链的占有率，并比较两种状态下糖蛋白上N-连唾液酸化糖链的占有率的 变化，从而发现人肝癌中潜在的生物标志物。
[0038] 本实验所用的人肝组织样品由大连医科大学附属第二医院（大连，中国）提供，是 肝细胞癌（肥C)肝脏外周2cm)的非癌症组织。正常组织部分（Normal)做过病理切 片，样品的取得和使用完全合法，并符合该院伦理委员会的相关规定。从肝组织中提取的蛋 白质溶液的处理流程与标准蛋白一样，如图1所示。最终，W在两次及两次W上质谱重复中 均定量到为标准，从肝癌组织中共定量到334个糖蛋白上496个位点特异性的N-连唾液酸 化糖链的占有率；从正常肝组织中共定量到394个糖蛋白上632个位点特异性的N-连唾 液酸化糖链的占有率。两种样品的N-连唾液酸化糖链占有率的Logz值的分布如图3A所 示。可W看出，正常肝组织中N-连唾液酸化糖链的占有率在总体上较癌组织中更高。可W 推测，两种样品中某些特定的糖蛋白上的N-连唾液酸化糖链的占有率发生了显著变化。如 图3B所示，有284个N-连糖基化位点同时存在于两个样品中。我们计算了运284个位点 上N-连唾液酸化糖链占有率的比值，图4给出了运个比值的Logz值的分布。发现两个样 品中共同的76个N-糖基化位点上的唾液酸化糖链的占有率有显著差异，其中37个糖蛋白 上的40个N-连唾液酸化糖链的占有率显著下调，31个糖蛋白上的36个N-连唾液酸化糖 链的占有率显著上调。运些糖蛋白可W用来进一步筛选人肝癌的标志物。
[0039] 结论
[0040] 显然，本发明发展的方法可W简便、高效、高通量的定量复杂生物样品中糖蛋白上 N-连唾液酸化糖链的占有率，为筛选疾病标志物提供了一种不受蛋白质丰度影响的新思 路，在疾病标志物的研究中将起到重要作用。
【主权项】
1. 一种定量糖蛋白上N-连唾液酸化糖链占有率的方法，其特征在于：首先取同一种状 态下含糖蛋白的生物样品等量两份，然后用高碘酸钠溶液对其分别处理以进行差异氧化， 之后利用蛋白层次上的酰肼化学法富集差异氧化后的样品中的糖蛋白，再利用不同稳定同 位素差异标记酰肼微球上的糖肽，然后用肽糖苷酶PNGase F处理，最后对混合差异标记的 N-糖肽进行质谱分析，以定量N-连唾液酸化糖链的占有率。2. 根据权利要求1所述的定量糖蛋白上N-连唾液酸化糖链占有率的方法，其特征在 于：具体包含以下步骤， 1) 取同一种状态下含糖蛋白的生物样品等量两份，分别溶解在含6-8M Urea和 50-100mM NH4HC03的缓冲溶液中，沸水加热失活5-10min，用蛋白除盐柱除去其中的小分子， 全蛋白在缓冲溶液中的浓度为2-10mg/mL ; 2) 步骤1)结束后得到的两份经过处理的样品，一份用浓度为0. 5-lmM的高碘酸钠溶液 氧化，另一份用浓度为10-15mM的高碘酸钠溶液氧化，氧化之后的两个样品各以蛋白除盐 柱置换为含浓度为80-100mM NaAC和130-150mM的NaCl的缓冲溶液，向两个溶液中各加入 预先以此缓冲溶液洗离过2~3次的酰肼微球，室温震荡富集10-12h，酰肼微球自身所占的 体积与步骤2)所置换的缓冲溶液的体积比为1:5 ; 3) 步骤2)结束后得到的酰肼微球用浓度为50-100mM的順4!10)3溶液洗离2~3次以 除去非糖蛋白，然后各分散在含浓度为6-8M的Urea和浓度为50-100mM的順 4!10)3的缓冲液 中，用终浓度为10_20mM的DDT和浓度为20-40mM的IAA各依次处理后，再依次以80-90 % ACN(AC_P H20的体积比），50-100mM NH4HC03溶液各洗离2~3次，最后均分散在50-100mM NH4HC0 3中，酰肼微球自身所占的体积与加入的50-100mM NH4HC03缓冲液的体积比为1:5,再 各加入胰蛋白酶酶解12-16h，加入的胰蛋白酶的用量与步骤1)所取的样品中蛋白质的质 量比为1:25 ; 4) 步骤3)得到的微球各依次以1. 0-1. 5M NaCl溶液，80-90% ACN(ACN和H20的体积 比），50-100mM順4!10)3溶液和水洗去非特异性吸附和非糖肽，并分别分散在200-400 μ L 50-100mM ΤΕΑΒ 中，分别取 8-16 μ L 4-8wt % CD20/CH20(CD20 和 CH20 都是 4 % -8 % )和 0. 6-1. 2M NaBH3CN各依次加入到两种样品中，室温反应3-4h以实现糖肽的二甲基重/轻标 记，4-8 % D20/CH20与微球自身体积比为2:25-4:25,0. 6-1. 2M NaBH3CN与微球自身的体积 比为 2:25-4:25 ; 5) 在用水洗离步骤4)得到的酰肼微球2~3次后，各加入含500-1000Unites PNGase F的10-20mM NH4HC0#1冲液震荡酶切10-12h，将二甲基标记的N-糖肽酶切下来，将对应 的轻标和重标的样品以等体积混合，所得的样品，以MALDI-TOF/TOF mass spectrometer或 LC-MS/MS分析，以定量N-连唾液酸化糖链的占有率；其中加入的含PNGase F的缓冲溶液 的体积与酰肼微球自身所占体积的比例为2:1-4:1。3. 根据权利要求2所述的定量糖蛋白上N-连唾液酸化糖链占有率的方法，其特征在 于：步骤1)所述的除去的小分子为尿素、碳酸氢铵以及样品中其他分子量小于7000Da的分 子。4. 根据权利要求2所述的定量糖蛋白上N-连唾液酸化糖链的占有率的方法，其特征在 于：步骤4)所述的lOOmM TEAB的pH为L 5-8. 0。5. -种权利要求1所述的定量糖蛋白上N-连唾液酸化糖链占有率的方法的应用，其特 征在于：该方法可以用于糖基化修饰的蛋白质组学分析，能同时获取相应的糖蛋白、糖肽和 糖基化位点的鉴定结果。6.根据权利要求5所述的定量糖蛋白上N-连唾液酸化糖链占有率的方法的应用，其特 征在于：该方法尤其可以用于人肝癌（HCC)的潜在生物标志物的筛选。
【文档编号】G01N27/62GK105987945SQ201510060851
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月5日
【发明人】邹汉法, 张章, 叶明亮
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所