倒置激光共聚焦显微镜动植物活体观测装置的制造方法
【技术领域】
[0001] 本实用新型属于微观组织及结构观测技术领域，具体涉及一种倒置激光共聚焦显 微镜动植物活体观测装置。
【背景技术】
[0002] 激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高 科技产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理， 把光学成像的分辨率提高了 309^40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组 织内部微细结构的荧光图像。激光扫描共聚焦显微镜在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+、pH值， 膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学、分子生物学、神经科学、药理学、遗传学 等领域中新一代强有力的研究工具。
[0003] 从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点 上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。共焦 显微镜[ConfocalLaserScanningMicroscope (CLSM 或 LSCM)]在反射光的光路上加上 了一块半反半透镜（BeamSplitter)，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点 上有一个带有针孔（Pinhole)的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管 (pHotomultipliertube，PMT)。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统， 必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。其意 义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。
[0004] 激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞 等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。 能够进行活体细胞中离子和PH值变化研究（RATIO)，神经递质研究，微分干涉及荧光的断 层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时 间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧 光原位杂交研究（FISH)，细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时PCR产物分析，荧光漂白 恢复研究（FRAP)，胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析 和三维重建等分析。
[0005] 但是共聚焦显微镜对样品要求较高，常规只能进行玻片和培养皿的观察，并且高 倍的活细胞观察只能在特制的培养皿中完成，无法进行动植物活体成像，使得其本身具有 的多通道荧光同时检测，以及多色荧光视频录制的功能在需要活体观察的领域使用范围受 到了局限。近期我们移植的转染GFP的干细胞的成活和转移实验，只能通过杀死动物后制 作玻片进行检测，必须在显微镜观察之前对样品进行固定切片等一系列操作，得到的结果 因为操作步骤多，与动植物活体时的状态有较大差异。在药物效果监测方面的病理切片会 受到药物体内代谢，动物体本身差异等影响导致检测结果可靠性较差。当我们获得了一个 比较理想的切片结果，需要进行下一步实验的时候，原实验动物已经处死，无法执行，新的 动物模型必然与原实验动物有差异，实验可重复性和结果可靠性较差。
[0006] 因此如何克服现有技术的不足是目前微观组织及结构观测技术领域亟需解决的 问题。 【实用新型内容】
[0007] 本实用新型的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种倒置激光共聚焦显微镜 动植物活体观测装置，本实用新型将传统细胞生物学的实验放到动植物活体上来进行，并 可用激光共聚焦显微镜观察动植物活体局部器官组织内部的高精度显微图像，结果更加可 〇
[0008] 本实用新型采用的技术方案如下：
[0009] 倒置激光共聚焦显微镜动植物活体观测装置，包括共聚焦样品平台、负压产生装 置和倒置式显微镜；
[0010] 所述的负压产生装置包括电机、负压泵和废液罐；所述电机用于驱动负压泵，所述 负压泵的进气口通过第一耐压软管与废液罐的出气口相连通，负压泵的出口连通大气； [0011] 废液罐的进气口通过第二耐压软管与钢管相连通，所述的共聚焦样品平台中间设 有凹槽，凹槽底部设有通孔，通孔处设有玻片，玻片通过凡士林与通孔密封连接；
[0012] 所述的钢管与凹槽相连通；倒置式显微镜位于共聚焦样品平台的正下方。
[0013] 进一步，优选的是所述的钢管通过环氧树脂固定与共聚焦样品平台固定连接。
[0014] 进一步，优选的是所述的钢管的弯折部分采用圆角折弯，保持内部畅通。钢管的作 用为导流气体及废液。
[0015] 进一步，优选的是所述的凹槽为倒置的圆台形。
[0016] 用上述倒置激光共聚焦显微镜动植物活体观测装置进行动植物活体观测方法，包 括如下步骤：
[0017] 步骤（1)，确认荧光指示剂标记方案并进行相应标记；
[0018] 步骤（2)，小动物按照体重比例由血管注入相应计量麻醉剂，全身麻醉，并作观测 部位相应手术，使观测部位暴漏出来，并进行相应的止血工作；
[0019] 步骤（3)，小动物肢体终端稳定固定在共聚焦样品平台上，通过观测部位实施手术 的创口，将观测器官置于观测平台玻片部位，排除气泡；
[0020] 步骤（4)，观测部位血管显微镜初检，确认血液流通良好，然后进行预扫描；
[0021] 步骤（5)，根据预扫描结果对观测部位进行牵拉压迫固定，但不能影响到血液流 通，直至观测画面稳定；
[0022] 步骤（6)，共聚焦timelapse扫描，对观测动物进行荧光指示剂标记和给药，获取 实时的共聚焦图片；
[0023] 步骤（7 )，数据分型，并形成相应视频文件。
[0024] 本实用新型的共聚焦样品平台可适合作为组织高倍放大观察的倒置式显微镜观 测平台，使得共聚焦能够获取活体内部组织细胞图像，并可记录视频图像，此平台利用负压 使观测组织紧密贴在观测平面上并排出组织积液。
[0025] 负压产生装置，包括电机、负压泵和废液罐。负压泵产生负压。废液罐也兼作负压 罐，不仅用来维持压力稳定，还用来储存组织积液。
[0026] 本实用新型与现有技术相比，其有益效果为：
[0027] 利用本实用新型技术方案，共聚焦可以用于观察动植物活体内部局部组织的高精 度显微图像。所有已进行的细胞层面的实验，可以扩展到细胞与组织层面，甚至来反映活体 整体的状况。同时，利用本实用新型技术方案可以将细胞层面的实验放到动植物活体上来 进行，观察动植物活体局部组织内部的高精度显微图像，同时获取多个指标，观察动植物组 织细胞和组织层面动态变化在动植物活体上的效果。
[0028] 共聚焦显微镜传统的用途主要是：观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征， 研究测定细胞内物质运输和能量转换，细胞形态学分析，荧光原位杂交研究，基因定位研究 及三维重建分析，这些都是细胞或者更细微层面的研究。本实用新型保持共聚焦的原有优 势，并将这些优势扩展到动植物活体的层面。
[0029] 将传统细胞生物学的实验放到动植物活体上来进行，并可用激光共聚焦显微镜观 察动植物活体局部器官组织内部的高精度显微图像，结果更加可靠。同时获取多个指标，