专利名称：使用会聚比决定簇和分流比决定簇来分析新陈代谢通量的方法
技术领域：
本发明涉及 一 种使用CRD(会聚比决定簇converging ratio determinant)和SRD(分流比决定簇，split ratio determinant)分析胞内新陈
代谢通量的方法，具体涉及一种新陈代谢通量分析方法，其包括选择 特定目标生物体，基于生物化学反应构建所选生物体的新陈代谢网络模 型，确定新陈代谢网络模型中特定新陈代谢通量之间的相关性，将该相 关性定义为CRD和SRD，通过13C标记实验确定新陈代谢网络模型中特 定生物化学反应的通量比，以确定的CRD、 SRD和人工代谢物修正化学 计算矩阵，并将修正的化学计算矩阵应用到新陈代谢网络模型以便进行 线性编程。
背景技术：
通过使用与基因重组技术相关的分子生物学技术引入新的生物化学 反应或者除去、放大或修改现存新陈代谢途径，新陈代谢工程提供了沿 着我们所需方向来改变细胞或者菌株的新陈代谢特性所需的信息。这种 新陈代谢工程包括生物工程的综合程度，诸如现有新陈代谢产物的过量 生产，新的新陈代谢产物的生产，不需要的新陈代谢产物生产的抑制， 以及廉价底物的利用。在与其一起新近发展的日益增加的生物信息的帮 助下，已经能够通过不同物质的基因组信息构建每个新陈代谢网络模型。 通过将新陈代谢网络信息和新陈代谢通量分析技术的组合，不同基本新 陈代谢产物和有用蛋白质的生产的工业化应用可能性现在被显示(Hong
9等人，Biotech. Bioeng， 83:854, 2003; US 2002/0168654; Price等人，Nat. Rev. Microbiol" 2:886, 2004)。
一般来说，在用于分析细胞新陈代谢的新陈代谢通量分析技术中， 基于仅仅认为简单生物化学方案的系数静态模型的方法可以被广义地分 成两种方法基于线性编程的以约束为基础的通量分析和基于非线性编 程的新陈代谢通量分析方法。基于线性编程的以约束为基础的通量分析 具有易获得性和简单的计算步骤，但具有的问题在于一些可使用的约束 很小，使其不能得到实际值。此外，基于非线性编程的方法可使用大量 的约束，因此可提供更精确的通量值，但具有的问题在于其限制了新陈 代谢网络模型的规模并需要复杂的计算步骤，实验过程困难，并且还需 要大量时间用于计算(Varma等人，Bio-Technol., 12:994, 1994; Nielsen 等人,Bioreaction Engineering Principles, Plenum Press, 1994; Lee等人, Metabolic Engineering, Marcel Dekker, 1999; K. Shimizu, Biotechnol. Bioprocess Eng., 7:237, 2002)。
新陈代谢通量分析是对生物体中新陈代谢通量进行定量的技术。新 陈代谢通量分析以拟稳态(pseudo-steady state)的假设为基础。即，由 于由外部环境的变化引起的内部代谢物浓度的变化是非常迅速的，这种 变化常常被忽略，并且假定内部代谢物的浓度没有发生变化。
如果所有的代谢产物、生物化学途径和途径中的化学计算矩阵(S/，
反应j中的代谢产物i)都是己知的，新陈代谢通量向量(Vj，途径j的
通量)可被计算，其中代谢产物X随时间的变化可被表示为所有新陈代 谢通量之和。假定X随时间的变化为常数，即在准稳态(quasi-steady state) 假设的条件下，下列方程被定义但是，存在许多情况，其中仅仅途径是已知的，并且对于每种新陈 代谢产物和途径以及新陈代谢通量向量(Vj)的化学计算值部分已知，因 此，上述方程被展开为下列方程
上述方程被分成两个矩阵；实验上已知的化学计算值(&(/xM)，其中 /=总代谢物数量，肘=总化学计算已知的反应数)次数通量(^(Mx/))的 限定矩阵和未知化学计算值(&(/xA/))次数通量(v"(MxT))的矩阵。在该关 系中，m为用于测定值的下标，u为用于未测定值的下标。
如果未知通量向量的列(Su)等于u (即如果变量数等于方程)，则 通量通过简单的矩阵计算就能被确定。但是，如果未知通量向量的列(Su) 大于u(即如果存在叠加方程)，为了更精确值的计算而进行验证总方程 的一致性，新陈代谢通量的测定值的精确性和准稳态的有效性的操作， 然后使用非线性编程诸如参数消耗近似方法等确定新陈代谢通量。
如果变量数大于方程，则使用特定对象函数和不同生理化学方程通 过线性编程来计算最佳新陈代谢通量分布，其中特定新陈代谢反应的通 量值可被限制为特定范围。这可通过下式来计算
最小化/最大化2=2>,巧
S.t. S、 = 0禾口 Ot肌",,S V; ^ Ot加叫/
其中。为加权值，并且v,为新陈代谢流。
一般来说，生物量形成率(即特定生长率)的最大化、典型代谢物 生产的最大化和副产品生产的最小化以及类似过程被用作目标函数。
CWu，,和是每个新陈代谢通量可具有的约束值，它们可被附值为每个
新陈代谢通量中允许的最大值和最小值。
基于这种线性编程方法的新陈代谢通量分析技术提供了多种信息， 因此是非常有用的，但在大多数情况下，实际新陈代谢通量网络模型具有显著大于方程数的参数个数，因此不能提供用于内部新陈代谢通量值 的实际值。
出于这种原因，近来发展了用于分析细胞内新陈代谢通量的技术，
其中通过GCMS (气相色谱-质谱)使用放射性同位素标记的碳源测定来 自细胞生长实验的主要代谢物的同位素含量，并将其用作附加的约束。 这种技术(也被称为同位素体分析，isotopomer analysis)具有的优点在 于它在非线性编程方法的基础上进行计算并提供了用于中心新陈代谢 网络的实际新陈代谢通量分布。但是，这种技术具有的缺点是，由于它 以非线性编程方法为基础，它使用非常复杂的计算过程，给用户造成了 不便并需要很长的计算时间，并且由于其复杂性和约束的范围和数目方 面的限制，它还仅仅在小尺寸模型中进行计算，包括糖酵解、磷酸戊糖 途径、TCA、补给途径和一些氨基酸合成途径CB/o&c/mo/. 66:86, 1999; K. Shimizu， S/Wec/mo/. B/o戶c咖7:237, 2002)。
因此，本发明的发明人付出了许多努力以更精确更容易地方式来分 析新陈代谢通量，结果发现，用于分析目标生物体的新陈代谢特性的新 陈代谢通量分析能够以准确迅速的方式通过各种实验来确定特定代谢反 应的通量比而得到，从而完成了本发明，这些实验包括使用放射性同位 素标记的碳源的生长实验和用于酶反应速率测定的实验，使用CRD、SRD 以及人工代谢物概念将通量比应用于化学计算矩阵，并基于线性编程使 用化学计算矩阵进行新陈代谢通量分析。
发明内容
发明所要解决的技术课题
本发明的一个目的在于提供一种用于新陈代谢通量分析的方法，其 包括下列步骤选择特定目标生物体，构建所选生物体的新陈代谢网络
模型，将特定新陈代谢通量定义为CRD和SRD，通过实验诸如13C标记实验或者酶活性测定确定新陈代谢网络模型中的新陈代谢通量比，并
基于具有CRD、 SRD概念和人工代谢物的线性编程绘出新陈代谢网络的 总新陈代谢通量的谱图。
本发明的另一目的在于提供一种用于分析Exoli的新陈代谢通量的 方法，其包括所述步骤。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供一种用于分析目标生物体的通量分 布的方法，该方法包括下列步骤(a)选择目标生物体(人类除外)， 构建所选生物体的新陈代谢网络模型和待测的总新陈代谢通量；(b)识 别步骤(a)的新陈代谢网络模型中特定新陈代谢通量之间的相关性，并 将特定新陈代谢通量的相关比定义为CRD (会聚比决定簇)和SRD (分 流比决定簇)；(c)在所选生物体上进行各种实验诸如13C标记实验或 者酶活性测定，并在实验结果的基础上确定步骤(b)的相关比、CRD 和SRD并对它们进行校正；(d)定义特定新陈代谢通量之间的人工代 谢物；(e)通过将步骤(c)的校正相关比、CRD和SRD应用于化学计 算矩阵以便使用步骤(d)的人工代谢物解答线性方程来确定附加方程， 并将确定的附加方程应用于化学计算矩阵以修改化学计算矩阵；和(f) 根据线性编程使用在步骤(e)中修改的化学计算矩阵绘出新陈代谢网络 的最佳值和总新陈代谢通量的谱图。
在本发明中，目标生物体优选为微生物。而且，步骤(b)中特定新 陈代谢通量的相关比优选使用下列方程1和2定义为CRD和SRD。
Z斗-
cg=p^~~,v一
13<formula>formula see original document page 14</formula>
其中/p是特定新陈代谢通量p的相关比，/9是特定新陈代谢通量《 的相关比，q是用于会聚途径中特定新陈代谢通量Vq的CRD ， D《是用
于分流途径中特定新陈代谢通量^的SRD(假定PEP ，其中 P表示所有的会聚途径或者分流途径)。
而且，在步骤(c)中用于新陈代谢通量比的实验优选为使用放射性 同位素标记的碳源的生长实验和/或酶反应测定。
此外，步骤(d)中的人工代谢物优选使用下列方程3定义 <formula>formula see original document page 14</formula>其中AfS /是用于会聚途径中CRD的人工代谢物，"W^^是用于分 流途径中SRD的人工代谢物，/"/ ^^/是流到人工代谢物M中的新陈代 谢通量的总和，o"0z^^,是从人工代谢物M中流出的新陈代谢通量的总 和，vp和vg分别为新陈代谢通量p和q的新陈代谢通量速率，C《是用 于特定新陈代谢通量q的CRD，Z^是用于特定新陈代谢通量^的SRD 。
此外，在步骤(e)中的修改之前化学计算矩阵优选表示如下
<formula>formula see original document page 14</formula>而且，在步骤(e)中的修改之后化学计算矩阵优选表示如下
1-10-100
S.v= 0 1-1 0陽l C
0 00 11 -1
.0 00 1 -C《 0
另外，步骤(f)中总新陈代谢通量的最佳值和谱图优选使用下列方
程4绘出 [方程4]
最大化/最小化 Z=Z9V/
戸
条件 2LsVv产6/ V;E/
a/ < <卩 V/ = J
vl v2 v3 v4 v5 v6
=0
其中&是/反应中产代谢物的化学计算系数，".是/途径中的新 陈代谢通量向量，/是一组所有代谢物，J是所有途径中的一组新陈代谢 通量,￡是一组所有流入/流出的新陈代谢通量，。是用于/途径的新陈 代谢通量的加权值，6,是产代谢物的净输送通量，/,和",表示产代谢物 的净输送通量，以及ay和^是限制值，它们可在/途径中由新陈代谢通
量处理。
15发明效果
另一方面，本发明提供一种用于筛选待扩增或剔除的基因以便增加 有用物质的产量的方法，所述方法包括使用根据上述方法绘出的新陈代 谢网络的总新陈代谢通量的最佳值和谱图。
再一方面，本发明提供一种用于改进产生有用物质的生物体的方法， 所述方法包括扩增或剔除目标生物体中所述筛选基因。
还一方面，本发明提供一种用于分析Exoli.的新陈代谢通量的方法， 所述方法包括下列步骤(a)构建E.coli.的新陈代谢网络模型；(b) 识别步骤U)的新陈代谢网络模型中特定新陈代谢通量之间的相关性， 并将特定新陈代谢通量的相关比定义为CRD(会聚比决定簇)和SRD(分 流比决定簇)；(c)在E.coli.上进行实验以便测定新陈代谢通量比，并 在实验结果的基础上确定步骤(b)的相关比、CRD和SRD并对它们进 行校正；(d)定义特定新陈代谢通量之间的人工代谢物；(e)通过将 步骤(c)的校正的相关比、CRD和SRD应用于化学计算矩阵以便使用 步骤(d)的人工代谢物解答线性方程来确定附加方程，并将确定的附加 方程应用于化学计算矩阵以修改化学计算矩阵；和(f)根据线性编程使 用在步骤(e)中修改的化学计算矩阵绘出新陈代谢网络的最佳值和总新 陈代谢通量的谱图。
在本发明中，步骤(b)中特定新陈代谢通量的相关比优选使用下列 方程1和2定义为CRD和SRD:
Dg = p^,，P
其中/p是特定新陈代谢通量/7的相关比，《是特定新陈代谢通量《
的相关比，C《是用于会聚途径中特定新陈代谢通量v《的CRD ， ￡)9是用
于分流途径中特定新陈代谢通量^的SRD(假定Pep ，其中
P表示所有的会聚途径或者分流途径)。
而且，在步骤(c)中用于新陈代谢通量比的实验优选为使用放射性 同位素标记的碳源的生长实验和/或酶反应测定实验。
此外，步骤(d)中的人工代谢物优选使用下列方程3定义 [方程3]
C及D
^ g "PEP"
淑f伊
其中MS /是用于会聚途径中crd的人工代谢物，Mf^是用于分 流途径中SRD的人工代谢物，/"p"^^是流到人工代谢物M中的新陈代
谢通量的总和，OW0"fM。,/是从人工代谢物M中流出的新陈代谢通量的总
和，&和v《分别为新陈代谢通量p和q的新陈代谢通量速率，C《是用 于特定新陈代谢通量q的CRD，i^是用于特定新陈代谢通量^的SRD 。 此外，在步骤(e)中的修改之前化学计算矩阵优选表示如下<formula>formula see original document page 18</formula>而且，在步骤(e)中的修改之后化学计算矩阵优选表示如下:
<formula>formula see original document page 18</formula>另外，步骤(f)中总新陈代谢通量的最佳值和谱图优选使用下列方 程4绘出 [方程4]
最大化/最小化:
<formula>formula see original document page 18</formula>其中&是/反应中产代谢物的化学计算系数，力是/途径中的新 陈代谢通量向量，/是一组所有代谢物，J是所有途径中的一组新陈代谢 通量,￡是一组所有流入/流出的新陈代谢通量，。是用于/途径的新陈
代谢通量的加权值，6,是产代谢物的净输送通量，/,.和w,.表示^代谢物的净输送通量，以及力和A是限制值，它们可在/途径中由新陈代谢通 量处理。
再一方面，本发明提供一种用于筛选待扩增或剔除的基因以便增加 有用物质的产量的方法，所述方法包括使用根据上述方法绘出的新陈代 谢网络的总新陈代谢通量的最佳值和谱图。
再一方面，本发明提供了一种用于改进产生有用物质的E.coli.的方 法，所述方法包括扩增或剔除E.coli.中所述筛选基因。
通过下列具体实施方式
和附图，本发明的其它特征和实施方式将更 加明显。
图1显示了根据本发明的新陈代谢通量分析方法。
图2显示了根据本发明通过生长实验使用放射性同位素标记的碳源 定义CRD和SRD的方法。
图3显示了在根据本发明定义的CRD和SRD的基础上使用人工代 谢物定义相关反应方程之间的相关性的方法。
图4显示了根据本发明的使用MetaFluxNet的其中CRD和SRD被 应用的实施例。
图5显示了使用人工代谢物的其中CRD和SRD被应用于E.coli.的 新陈代谢网络模型的实施例，并显示了该实施例的结果值(图5A)和结 果值的准确性(图5B)。
具体实施例方式
在本文中，术语特定新陈代谢通量之间的"相关比"指的是相关性， 诸如从各种环境变化或者生长曲线得到的新陈代谢通量值，或者来自可通过新陈代谢通量值预测的所有实验数值的稳定增加或降低，并意味着 包括可表示相关性的所有条件。
为了进行根据本发明的改进新陈代谢通量分析技术，其总新陈代谢 通量将被测定的目标生物体(人类除外)首先被选择，并且构建所选生 物体的新陈代谢网络模型。然后，其间具有相关性的特定新陈代谢通量 在上述实验的基础上被识别，是否存在从特定代谢物流入或流出的新陈 代谢通量被确定以便基于新陈代谢通量的数量级将新陈代谢通量的贡献
程度定义为CRD或者SRD。而且，为了测定所选生物体的新陈代谢通量， 进行实验包括使用放射性同位素标记的碳源的生长实验和用于酶反应测 定，并且基于实验结果确定CRD和SRD。然后，确定的CRD和SRD使 用人工代谢物被应用于化学计算矩阵，总新陈代谢通量的最佳值和谱图 在线性编程的基础上绘出。总新陈代谢通量的最佳值和谱图可使用下列 算法来计算
最大化/最小化 Z-2。"
戸
条件 2Ls》v7=&
严 ' a, <力s卩,
其中&是/反应中产代谢物的化学计算系数，"是/途径中的新 陈代谢通量向量，/是一组所有代谢物，J是所有途径中的一组新陈代谢 通量，￡是一组所有流入/流出的新陈代谢通量，。是用于/途径的新陈
代谢通量的加权值，^是产代谢物的净输送通量，/,和",表示产代谢物的净输送通量，以及力和A是限制值，它们可在/途径中由新陈代谢通 量处理。
图1显示了使用根据本发明的改进新陈代谢通量技术执行绘出具有
更高精确性的总新陈代谢通量谱图的方法的全部过程，图2示意性地示 出了将所述方法应用于新陈代谢通量分析的实施例。
为了应用根据本发明的改进的新陈代谢分析方法，用于主要会聚途 径(A)或分流途径(B)的CRD和SRD首先应当被定义。通过初步实 验，包括使用放射性同位素标记的碳源测定典型代谢物的同位素标记和 用于测定主要会聚途径或分流途径的酶反应的测定，特定新陈代谢通量 和f的相关比被测定，并在确定的相关比的基础上定义CRD和SRD。这 里，主要分流途径或会聚途径的相关比之和被定义为1:
其中/p是特定新陈代谢通量p的相关比，P表示所有的会聚途径或 者分流途径。
下面显示通过图2的示例性模型定义用于会聚途径(图2A)中特定 新陈代谢通量的CRD的算术表示，以便应用本发明
其中/p是特定新陈代谢通量p的相关比，《是特定新陈代谢通量《的
相关比，q是用于会聚途径中特定新陈代谢通量^的CRD。
下面显示通过图2的示例性模型定义用于分流途径(图2B)中特定 新陈代谢通量的SRD的算术表示，以便应用本发明 Z 4-《
21其中/p是特定新陈代谢通量p的相关比,/g是特定新陈代谢通量《的
相关比，i^是用于分流途径中特定新陈代谢通量v《的SRD。
为了将定义的CRD或者SRD应用于化学计算矩阵以解决线性编程，
相关新陈代谢通量之间的人工代谢物M^f如图2所示被定义。通过上述
计算过程得到的CRD和SRD可直接预测为用于人工代谢物Martf的化学
计算系数，假定为准稳态的情况下其反应方程如下，其和为0: (^CV^ c及"
__^= /，W/ -卯,財(V孤^D-o
蕴: —
其中A'/g /是用于会聚途径中crd的人工代谢物，^r^是用于
分流途径中SRD的人工代谢物，、新陈代谢通量《的新陈代谢通量速率， C9是用于特定新陈代谢通量Vq的CRD, D《是用于特定新陈代谢通量v《 的SRD。结果，用于人工代谢物的反应方程被应用为线性编程中的等式 约束。
根据各种实验误差，CRD和SRD值有时可变成具有最大值和最小值 之间的范围的值。因此，在这种情况下，人工代谢物的反应方程还可具 有范围，并被应用于不等式限制，其数学表示如下
^^^^ c1111^
-^- ^-々、甲—v《 j》o
广max
^M"， 一 ，max 、
j :■■:■■: = V^r —'( ，.j vp —可 J《0
其中A/art/是人工代谢物M的最小化学计算值，Af。《是人工代谢
物M的最大化学计算值，C《mZ 是用于^的最小CRD值,C《w";c是用于 v,的最大CRD值。
22在本发明中，人工代谢物被用于将上述定义的CRD和SRD应用于 化学计算矩阵来解答线性方程以便有效地应用附加限制值，所产生的化 学计算矩阵被用于在线性编程的基础上进行总新陈代谢通量分析。
下列软件系统可被用于计算新陈代谢通量以Matlab为基础的软件 系统，诸如FluxAnalyzer (Klamt等人，^/o/w/wtwW/w, 19:216， 2003)和 Metabologica (Zhu等人，Afeto6. 5:74， 2003)，可独立进行计算的程序， 包括 Fluxor(http:〃arep.med.harvard. edu/moma/biospicefluxor.html), Simpheny (Genomatica Inc., San Diago, CA)， INSILICO Discovery (腦ILCO biotechnology Inc., Stuttgart, Germany), FBA (http:〃systemsbiology.ucsd. edu/downloads/fba.htm)，和MetaFluxNet (Lee等人,别o/"/orm油'w, 19:2144， 2003),以及计算机语言通用程序工具， 诸如Gams (GAMS Development Corporation, NW Washington, DC), C语 言禾卩Fortran 。
在本发明中，选择E.coli.模型系统作为用于应用所述方法的模型系 统，Exoli.新陈代谢通量的总新陈代谢通量分析通过初步实验进行。
实施例
下面，将通过特定实施例对本发明进行更为详细地描述，但是，本 发明并不限于这些实施例，对本领域技术人员来说显而易见的是，可在 本发明的精神和范围内进行各种变化和修改。
特别是，下面的实施例示出了使用五sc&n'cWfl co/M乍为待分析新陈 代谢通量的菌株进行改进的新陈代谢通量分析，对本领域技术人员来说 显而易见的是，通过本发明公开的内容，也可使用除E.coli.以外的其它 菌株来进行新陈代谢通量分析。
而且，在下面的实施例中，在整个实验中新陈代谢通量的相关比使 用放射性同位素标记的碳源由GC-MS (气相色谱质谱)确定为用于定义
23CRD和SRD的初步实验。但是，对本领域技术人员来说显而易见的是， 通过本发明公开的内容，可表示新陈代谢通量之间的关系的所有其它实 验，包括酶反应速率测定都可被用作定义CRD和SRD的实验。
实施例l: CRD和SRD在示范性模型中的应用
作为用于新陈代谢通量分析的示范性模型，构建了图3中显示的系 统。设置了包括5个反应方程、3个代谢物及1个吸收(uptake, Rl)和 最大值v6作为新陈代谢通量分析的目标函数的示范性模型。使用 MetaFluxNet 1.6进行刺激，其可通过http:〃mbel.kaist.ac.kr/下载(Lee 等人，所o/"/orma"d 19:2144, 2003)。
为了进行比较，初步进行了不包括CRD和SRD的新陈代谢通量分 析。当假定为准稳态时，示范性模型的化学计算矩阵如下
<formula>formula see original document page 24</formula>
在化学计算矩阵的基础上根据线性编程进行新陈代谢通量分析。对 于实验限制值的输入的类似实验来说，R3新陈代谢速率，即客观新陈代 谢通量之一被设置为lmmol/g DCWh并输入为限制值，作为碳源吸收的 新陈代谢通量的Rl的新陈代谢通量被设置为5mmol/g DCWh，结果如下 最大化 &
A v，- a- a =0 :约束条件 <formula>formula see original document page 24</formula>包括一种相对于代谢物C的会聚途径的这种示范性模型和用于会聚 途径的反应方程R4和R5被设置为具有相关性。而且，根据相关比，CRD、 Cq被设定为0.5。
为了应用CRD，具有相关性的两种新陈代谢通量之间的人工代谢物 M时f被设定，图3显示了将CRD应用于这种模型的方法。而且，根据本 发明，人工代谢物的系数被定义为/^ = 0.5，其为CRD值。得到的修改 的化学计算矩阵如下
<formula>formula see original document page 25</formula>
在根据线性编程的化学计算矩阵的基础上进行新陈代谢通量分析。
对于实验限制值输入的类似实验来说，R3新陈代谢速率，即客观新陈代
谢通量之一被设置为lmmol/gDCWh并输入为限制值，作为碳源吸收的
新陈代谢通量的Rl的新陈代谢通量被设置为5mmol/g DCWh，结果如下
<formula>formula see original document page 25</formula>如图3所示，CRD没有被应用于其上的一般新陈代谢通量分析的实 施例显示了内部新陈代谢通量分布的简单组合，特别是用于代谢物C的 会聚途径之一的R4不具有其值。显然，这是一种在使用根据实际线性编 程的新陈代谢网络进行新陈代谢通量分析中对于一些会聚途径或者分流 途径来说新陈代谢通量分布中频繁出现的现象，而且显然不是实际现象。
但是，与上面的情况不同，在通过将构成会聚途径的两种新陈代谢 通量之间的相关比定义为CRD和人工代谢物的新陈代谢通量分布中，会 聚途径的新陈代谢通量分布根据相关比被识别，甚至目标函数的值都是 相同的。由于这种相关比是以实验为基础的，其显示非常好的效果，即 显示更接近实际现象的新陈代谢通量分布。
实施例2: CRD应用于E.coli.新陈代谢网络模型中的实施例
在E.coli.的情况下，由979生物化学反应和814代谢物构成的新的 新陈代谢网络被作为新陈代谢网络。包括所有E.coli.生物化学反应和用 于形成待使用生物量形成方程作为目标函数的E.coli.的生物量组成中的 大多数的这种系统如下(Neidhardt等人，CW/m/ct Mo/ecw/w 5z'o/ogy, 1996): 55%蛋白质，20.5% RNA, 3.1% DNA， 9.1%脂类，3.4%脂多糖， 2.5%肽聚糖，2.5%糖原，0.4%聚胺和3.5%其它代谢物，辅因子及离子。
一般来说，E.coli.似乎使用最大细胞组分生长，这被表示为特定生长 率。因此，使用特定生长率作为目标函数根据线性编程进行新陈代谢通 量分析。
首先，在E.coli.中，可定义相关比的实验值通过使用放射性同位素 标记的碳源的实验得到。为了通过GCMS (气相色谱-质谱)测定确定新 陈代谢通量之间的相关比，进行E. Fischer等人的方法(E. Fischer等乂, 五w. / 270:880， 2003)，其数学表示如下。
26根据通过除去天然放射性同位素含量的测定值修正的主要代谢物的
同位素含量定义MDV (质量分布向量)，将每种代谢物的元素之和定义为l:
—)
定位在主要会聚途径中的代谢物的成分的同位素含量以其前体的同位素含量为基础，并依赖于以新陈代谢通量网络为基础的新陈代谢通量
的数量级，特别是，定义每种代谢物的同位素含量的MDV的元素之和为l。因此，通过每种代谢物的MDV，定位在会聚途径中并彼此相关的新陈代谢通量之间的相关比定义如下
力一 MZH; - MDFp2
Pi 一 A鼎；-扁&2
其中M是会聚途径中存在的目标代谢物，和是用作代谢物M的前体的代谢物，/p/表示来自pl的新陈代谢通量与来自p2的新陈代谢通量的相关比。这里，相关新陈代谢通量的相关比之和被定义为1，其数
学表示如下PEP
为了应用本发明，对于特定新陈代谢通量的CRD被定义，其数学表
示如下
其中/p是特定新陈代谢通量p的相关比，/《是特定新陈代谢通量《
的相关比，CV是对于会聚途径中特定新陈代谢通量《的CRD。在E.coli.的新陈代谢通量网络中，包括糖酵解、磷酸戊糖途径、TCA
及补给途径的主要中心新陈代谢通量网络中的5个会聚途径之间的关系
被定义，并以目标代谢物和如图4中显示的主要会聚途径的反应方程的
名义被表达。为了应用来自实验数据的相关新陈代谢通量的相关比，使
用相关新陈代谢通量之间的人工代谢物定义附加的反应方程，并且当假
定为准稳态时，用于每种人工代谢物的反应方程如下叔
== 2(v加一 & — v加)—C (v* + v汰+ 3v汰2 + 2v似)=0
Z = VWa - C- (vw* + v, ) = 0= v解一 Cy vWfc = O
max
= U - d + v一)》O
= +3&2 + 2vto)-Cr(U +2 -2v汰2-2、)《0
其中，参见图4， Vh是从F6P到T3P的fba反应的通量的量，Vtk2是从E4P和P5P到F6P和T3P的tk2反应的通量的量，vtkl是从P5P到S7P和T3P的tkl反应的通量的量， 是从S7P和T3P到F6P和E4P的ta反应的通量的量，vppe是从PEP到OAA的ppc反应的通量的量，veda是从6-P-葡萄糖酸到T3P和PYR的eda反应的通量的量，vmdh是从MAL到OAA的mdh反应的通量的量，vpyk是从PEP到PYR的pyk反应的通量的量，v皿是从MAL到PYR的mez反应的通量的量，Ca和M。分别表示对于特定会聚途径a的CRD和人工代谢物，Cp和Mp分别表示对于特定会聚途径p的CRD和人工代谢物，CY和MY分别表示对于特定会聚途径y的CRD和人工代谢物，并且Q和Ms分别表示对于特定会聚途径S的CRD和人工代谢物。
28确定了对于5个会聚途径的5个人工代谢物的总和，它们的反应方程被定义，并且基于根据实验值的相关比值是否具有范围定义了三个等式约束和两个不等式约束。
根据Fischer等人04脂/. 5foc/zem. 325:308, 2004)的实验数据计算了得自用于确定用于每种人工代谢物的反应方程中的每个CRD值的实际实验的每种代谢物的MDV和得自MDV值的相关比，并与使用20/80M[U-13C]葡萄糖/[1-13C]葡萄糖标记的碳源得到的实验数值一致。根据上述方法定义的CRD值在下表1中显示。
表1
人工代谢物会聚比决定簇(C)
用于丝氨酸的iVf。2.57 ±0.06
用于丙酮酸盐的3/60.01 ±0.10
用于草酰乙酸盐的Mg1.86 ±0.06
用于丙酮酸盐的^/rf(上限)0.19±0.14
用于丙酮酸盐的3^(下限)0.06 ±0.04
用于磷酸烯醇丙酮酸盐的3fe(上限)0.20 ±0.10
如上所述，当应用了用于人工代谢物的附加定义的反应方程和CRD值，E.coli.的新陈代谢通量根据假定为准稳态的线性编程来进行。
在分析结果中，主要中心新陈代谢网络中的新陈代谢通量的实施例在图5中显示。而且，基于根据非线性编程得到的用于主要中心新陈代谢通量网络的新陈代谢通量分布，使用本发明的结果(图5A中上位值)和不使用本发明的结果(图5B中下位值)的准确性在图5B中显示。
在上面的结果的基础上可以发现，当一些通过附加实验得到的附加数值有效地用作线性编程的附加限制值时，可得到更为准确的细胞内新陈代谢通量分布。
29实施例3:使用本发明来增加有用物质产量的基因筛选和生物体改进为了增加有用物质的产量，使用根据实施例1和2得到的总新陈代谢通量最佳值和谱图筛选了增加有用物质产量的待扩增基因。待扩增基因的筛选根据公开号为10-2005-0086119的韩国专利文献中描述的方法进行。
而且，根据公开号为10-2005-0086119的韩国专利文献中的方法筛选的待扩增基因可被引入相关生物体中或者在其中扩增，以构建相关生物体的突变体。
虽然已经参照特定特征对本发明进行了详细描述，但对本领域技术人员来说显而易见的是，该描述仅仅用于优选实施方式，而不是对本发明进行限制。因此，本发明的实质范围将由所附的权利要求书及其等同物来限定。本领域技术人员应当理解，对本发明的简单修改、变化和附加都是可能的，都不偏离在所附权利要求书中限定的本发明的精神和范围。
工业实用性
如上面详细描述的那样，本发明提供了新陈代谢通量分析方法和用于分析E.coli.的新陈代谢通量的方法。根据本发明，相对于目标生物体中特定代谢物(该目标生物的基因组水平的新陈代谢网络模型被构建)的流入/流出新陈代谢通量之间的关系可使用得自各种实验包括使用放射性同位素标记的碳源的生长实验和用于测定酶反应速率的实验的有用信息定义为相关比，使内部新陈代谢通量可以更为准确迅速的方式定量并分析。
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权利要求
1、一种分析目标生物体的新陈代谢通量的方法，该方法包括下列步骤(a)选择目标生物体(人类除外)，其总新陈代谢通量被测定，并构建所选生物体的新陈代谢网络模型；(b)识别步骤(a)的新陈代谢网络模型中特定新陈代谢通量之间的相关性，并将特定新陈代谢通量的相关比定义为CRD和SRD；(c)在所选生物体上进行实验以测定新陈代谢通量比，并在实验结果的基础上确定步骤(b)的相关比、CRD和SRD并对它们进行校正；(d)定义特定新陈代谢通量之间的人工代谢物；(e)通过将步骤(c)的校正的相关比、CRD和SRD应用于化学计算矩阵以便使用步骤(d)的人工代谢物解答线性方程来确定附加方程，并将确定的附加方程应用于化学计算矩阵以修改化学计算矩阵；和(f)根据线性编程使用在步骤(e)中修改的化学计算矩阵绘出新陈代谢网络的最佳值和总新陈代谢通量的谱图。
2、 根据权利要求l所述的分析目标生物体的新陈代谢通量的方法， 其特征在于，目标生物体优选为微生物。
3、 根据权利要求l所述的分析目标生物体的新陈代谢通量的方法， 其特征在于，步骤(b)中特定新陈代谢通量的相关比使用下列方程l和 2定义为CRD和SRD:[方程1][方程2]<formula>formula see original document page 3</formula>其中/p是特定新陈代谢通量/7的相关比，/《是特定新陈代谢通量《的相关比，C《是用于会聚途径中特定新陈代谢通量v《的CRD ， 是用于分流途径中特定新陈代谢通量v《的SRD(假定l'v^sp， 其中P表示所有的会聚途径或者分流途径)。
4、 根据权利要求l所述的分析目标生物体的新陈代谢通量的方法， 其特征在于，在步骤(c)中用于新陈代谢通量比的实验为使用放射性同 位素标记的碳源的生长实验和/或酶反应测定实验。
5、 根据权利要求1所述的分析目标生物体的新陈代谢通量的方法， 其特征在于，步骤(d)中的人工代谢物使用下列方程3定义[方程3〗<formula>formula see original document page 3</formula>其中A/art/是用于会聚途径中CRD的人工代谢物，Mart/是用于 分流途径中SRD的人工代谢物，/"pwfMw是流到人工代谢物M中的新陈 代谢通量的总和，oW/w^^是从人工代谢物M中流出的新陈代谢通量的 总和，vp和Vq分别为新陈代谢通量p和q的新陈代谢通量速率，Cg是 用于特定新陈代谢通量q的CRD， D,是用于特定新陈代谢通量v《的 SRD 。
6、根据权利要求1所述的分析目标生物体的新陈代谢通量的方法， 其特征在于，在步骤(e)中的修改之前化学计算矩阵表示如下<formula>formula see original document page 4</formula>
7、根据权利要求1所述的分析目标生物体的新陈代谢通量的方法, 其特征在于，在步骤(e)中的修改之后化学计算矩阵表示如下 <formula>formula see original document page 4</formula>
8、根据权利要求1所述的分析目标生物体的新陈代谢通量的方法， 其特征在于，步骤(f)中总新陈代谢通量的最佳值和谱图使用下列方程4绘出[方程4]戸最大化/最小化:9"条件》=J其中&是/反应中产代谢物的化学计算系数，力是/途径中的新 陈代谢通量向量，/是一组所有代谢物，/是所有途径中的一组新陈代谢通量，￡是一组所有流入/流出的新陈代谢通量，c,是用于/途径的新陈代谢通量的加权值，^是产代谢物的净输送通量，/,和表示产代谢物 的净输送通量，以及ay和A是限制值，它们可在/途径中由新陈代谢通 量处理。
9、 一种筛选待扩增或剔除的基因以便增加有用物质的产量的方法， 所述方法包括使用根据权利要求1-8中任一项所述的方法绘出的新陈代 谢网络的总新陈代谢通量的最佳值和谱图。
10、 一种改进产生有用物质的生物体的方法，所述方法包括扩增或 剔除目标生物体中通过权利要求9所述的方法筛选的基因。
11、 一种分析E.coli.的新陈代谢通量的方法，所述方法包括下列步骤(a) 构建E.coli.的新陈代谢网络模型；(b) 识别步骤(a)的新陈代谢网络模型中特定新陈代谢通量之间 的相关性，并将特定新陈代谢通量的相关比定义为CRD和SRD;(c) 在E.coli.上进行实验以便测定新陈代谢通量比，并在实验结果 的基础上确定步骤(b)的相关比、CRD和SRD并对它们进行校正；(d) 定义特定新陈代谢通量之间的人工代谢物；(e) 通过将步骤(c)的校正的相关比、CRD和SRD应用于化学计 算矩阵以便使用步骤(d)的人工代谢物解答线性方程来确定附加方程， 并将确定的附加方程应用于化学计算矩阵以修改化学计算矩阵；和(f) 根据线性编程使用在步骤(e)中修改的化学计算矩阵绘出新 陈代谢网络的最佳值和总新陈代谢通量的谱图。
12、 根据权利要求ll所述的分析E.coli.的新陈代谢通量的方法，其 特征在于，步骤(b)中特定新陈代谢通量的相关比使用下列方程1和2 定义为CRD和SRD:[方程1]<formula>formula see original document page 6</formula>[方程2] <formula>formula see original document page 6</formula>其中/p是特定新陈代谢通量/7的相关比，/g是特定新陈代谢通量^的相关比，Q是用于会聚途径中特定新陈代谢通量v《的CRD ， Z)9是用于分流途径中特定新陈代谢通量^的SRD(假定PEP其中P表示所有的会聚途径或者分流途径)。
13、 根据权利要求ll所述的分析E.coli.的新陈代谢通量的方法，其 特征在于，在步骤(c)中用于新陈代谢通量比的实验为使用放射性同位 素标记的碳源的生长实验和/或酶反应速率测定实验。
14、 根据权利要求ll所述的分析E.coli.的新陈代谢通量的方法，其 特征在于，步骤(d)中的人工代谢物使用下列方程3定义[方程3]<formula>formula see original document page 6</formula>"Ci P w战" 其中》/art/是用于会聚途径中CRD的人工代谢物，Af art/是用于分流途径中SRD的人工代谢物，/"/n^^/是流到人工代谢物M中的新陈代 谢通量的总和，oW;n^^/是从人工代谢物M中流出的新陈代谢通量的总 和，vp和vq分别为新陈代谢通量p和q的新陈代谢通量速率，C9是用 于特定新陈代谢通量q的CRD, Z)《是用于特定新陈代谢通量V《的SRD。
15、根据权利要求ll所述的分析E.coli.的新陈代谢通量的方法，其 特征在于，在步骤(e)中的修改之前化学计算矩阵表示如下<formula>formula see original document page 7</formula>
16、根据权利要求ll所述的分析E.coli.的新陈代谢通量的方法，其 特征在于，在步骤(e)中的修改之后化学计算矩阵表示如下<formula>formula see original document page 7</formula>
17、根据权利要求ll所述的分析E.coli.的新陈代谢通量的方法，其 特征在于，步骤(f)中总新陈代谢通量的最佳值和谱图使用下列方程4 绘出[方程4]最大化/最小化 Z = 2条件<formula>formula see original document page 7</formula>其中是/反应中产代谢物的化学计算系数，力是/途径中的新 陈代谢通量向量，/是一组所有代谢物，J是所有途径中的一组新陈代谢 通量,￡是一组所有流入/流出的新陈代谢通量，。是用于/途径的新陈 代谢通量的加权值，^是产代谢物的净输送通量，/,和表示产代谢物 的净输送通量，以及巧和A是限制值，它们可在/途径中由新陈代谢通 量处理。
18、 一种筛选待扩增或剔除的基因以便增加有用物质的产量的方法， 所述方法包括使用根据权利要求11-17中任一项所述的方法绘出的新陈 代谢网络的总新陈代谢通量的最佳值和谱图。
19、 一种用于产生有用物质的改进E.coli.的方法，所述方法包括扩 增或剔除Exoli.中通过权利要求18所述方法筛选的基因。
全文摘要
本发明涉及一种使用CRD和SRD分析新陈代谢通量的方法，具体地，所述方法包括选择特定目标生物体，并基于生物化学反应构建所选生物体的代谢网络模型，确定代谢网络模型中特定代谢通量之间的相关性，将相关比定义为CRD和SRD，为了测定新陈代谢通量比通过实验定义新陈代谢通量的相关比，使用确定的CRD、SRD和人工代谢物相关比修改化学计算矩阵，并应用代谢网络模型的修改的化学计算矩阵以便进行线性编程。根据本发明的方法，相对于目标生物体(包括E.coli.)，该目标生物的基因组水平的新陈代谢网络模型被构建，其中特定代谢物的流入/流出新陈代谢通量之间的关系可使用得自各种实验包括使用放射性同位素标记的碳源的生长实验和用于测定酶反应速率的实验的有用信息定义为相关比。因此，来自各种实验的限制值可被有效使用，使内部新陈代谢通量可以更为准确迅速的方式定量并分析。
文档编号G06F19/00GK101460844SQ200680054294
公开日2009年6月17日 申请日期2006年9月8日 优先权日2006年4月21日
发明者崔亨奭, 李相烨, 金兑勇 申请人:韩国科学技术院