专利名称：用于熔化曲线自动分析的系统和方法
技术领域：
本发明涉及熔化曲线分析，更具体地涉及用于化合物(诸如核酸或蛋白质)的熔化曲线自动分析的系统和方法。
图1是描绘了线性基线熔化曲线分析的图。图2是未标记探测熔化实验的未调整的实验熔化曲线的图，该图示出了低温下的多个基因型和指数背景荧光。图3是用于产生实验熔化曲线的偏离函数的方法的一个实施例的流程图。图4描绘了发夹结构(hairpin structure)的示例性的、未调整的实验熔化曲线的图。图5描绘了图4的熔化曲线的导数图。图6描绘了图4的熔化曲线在减去指数背景之后的导数图。图7描绘了存在于图4中的数据的偏离函数的图。图8描绘了在指数背景去除之后，图4中的数据的均一化熔化曲线的图。图9描绘了存在于图4中的数据的积分偏离函数的图。图10描绘了在对于复合基因型减去指数背景之后的熔化曲线数据的导数图。图11描绘了图10中的熔化曲线数据的偏差图。图12A描绘了示例性平滑化蛋白质熔化曲线。图12B描绘了图12A的平滑化蛋白质熔化曲线的导数图。图12C描绘了图12A的蛋白质熔化曲线数据的偏离函数图。图12D描绘了在背景校正之后的导数熔化曲线。图13描绘了图12A的蛋白质熔化曲线的归一化扩展曲线的导数图。图14A描绘了示例性平滑化蛋白质熔化曲线。图14B描绘了图14A的平滑化蛋白质熔化曲线的导数图。图14C描绘了图14A的蛋白质熔化曲线数据的偏离函数图。图14D描绘了在背景校正之后的导数熔化曲线。图15描绘了图14A的蛋白质熔化曲线的归一化展开曲线的导数图。图16是用于使用偏差分析来识别阴性样本的方法的一个实施例的流程图。图17是用于使用偏差分析来识别阴性样本的方法的另一个实施例的流程图。图18是用于自动地识别背景和/或熔化曲线的熔化区域的方法的一个实施例的流程图。图19描绘了示例性偏离函数的图。图20是用于自动地识别扩增子(amplicon)以及探测背景和/或熔化区域的方法的一个实施例的流程图。图21A是包括扩增子和探测熔化区域的偏差方法的图。
图21B是探测熔化区域的偏离函数的图。图22是用于自动背景去除的方法的一个实施例的流程图。
图23A和图2 描绘了示例性理想和熔化曲线。图M是用于自动背景去除的方法的另一个实施例的图。图25描绘了通过无偏分级方法自动地正确地集群的偏差图。图沈描绘了没有通过无偏分级方法正确地校正的、在指数背景去除之后的导数图。图27描绘了在PCR熔化分析之后包括阴性样本的一组未调整熔化曲线。图观描绘了使用振幅截止技术进行阴性样本排除之后的一组阴性样本指示器。图四描绘了在使用偏差分析进行阴性样本排除之后的一组熔化曲线。图30描绘了在使用背离分析进行阴性样本排除之后的一组阴性样本指示器。图31描绘了在探测熔化区域和扩增子熔化区域的自动定位之后的背离图。图32描绘了一组阴性样本和集群成员指示器。图33是用于分析熔化曲线数据的系统的框图。通过下面参照附图对优选实施例进行的说明，将清楚本发明的附加方面和优点。
具体实施例方式熔化曲线分析在各种物质的研究中非常有用。特别地，已经广泛地通过熔化曲线研究了核酸，其中熔化曲线的差异可以表示不同的核酸序列。熔化曲线也被用来研究蛋白质键联(binding)，其中特征熔化曲线表示特别配体的蛋白质键联吸引力。虽然本文是结合核酸和蛋白质熔化进行说明的，但是可以理解的是其他化合物的熔化曲线分析也在本发明的范围内。在这里的一个实施例中，熔化曲线分析可以提供关于核酸产品的一致性和/或结构的信息。破坏核酸结构内的基团-基团氢键所需的能量的量(例如，DNA的双(2)链之间)可能由于产品的结构相关的因素决定。这些因素可以包括(但不限于)长度、互配能力、鸟嘌呤-胞嘧啶(G-C)含量、重复序列存在或不存在等。可以通过将梯度能量施加到(例如，加热)含有核酸产品的溶液而获得熔化曲线。 随着能量的添加以及溶液温度的增加，产品可能变性(例如，分裂)。虽然示例参照了温度的升高，但是其他熔化方法(例如，梯度地改变离子浓度)也是本领域中已知的。通过测量发生这种分裂的程度与温度(或者其他熔化梯度)的函数关系，可以产生熔化曲线。例如， 见美国专利No. 5，871，908，通过引用将之结合在这里。因此，如这里所使用的，熔化曲线可以指的是包括对化合物响应于熔化梯度(诸如温度和离子浓度)而改变其结构的程度进行量化的测量结果(例如，核酸中的链分裂的程度与施加到其上的能量梯度的函数关系)的任何数据组。在一些实施例中，可以电学地测量分裂。核酸产品(或者其他化合物)也可以被放置在包括键联染料(binding dye)的溶液中。在结合到双链DNA (dsDNA)时，键联染料可以适合于发射电-光(electro-optical，简记为E0)辐射随着产品分裂，键联染料可以停止发射EO辐射(例如，随着溶液的温度增加)。此外，可以通过获取从随着向其施加能量(例如， 随着溶液的温度增加)溶液发射的EO辐射(荧光)的测量结果而产生熔解曲线。此外，理解本发明不局限于荧光在熔解期间减小的实施例；在一些实施例中，诸如使用G淬火单标记探针的那些实施例中，荧光信号可以在熔解期间增加(例如，见美国专利No. 6，635，427)。因此，熔解曲线可以包括一系列EO辐射测量结果(例如，从溶液发射的荧光的测量结果)与温度的函数。然而，本发明的教导可以应用到包括以其他方式获得的分离测量结果的其他熔化曲线。因此，本发明不应当被解读为局限于用于获取熔化曲线数据的特定的方法和/或技术(例如，用于获取量化核酸分裂与施加到溶液的能量的函数关系的测量结果)ο如上所述，可以从熔化曲线推断关于核酸产品的结果的信息。因此，熔化曲线数据可以被用来研究聚合酶链式反应(PCR)产品。可以通过在键联染料存在的情况下，加热 PCR反应的产品来获取PCR产品的熔化曲线，如下所述，相比于结合到单链长度DNA (ssDNA) 时该曲线在结合到dsDNA时可以适合于更加强烈地发出荧光。因此，在相对低的温度下，在 PCR产品可以主要地存在为dsDNA的情况下，溶液可以以相对高水平发出荧光。随着溶液的温度增加，产品可以分裂(例如变性)为两个( 链的ssDNA，这可以使得在更低水平下发出荧光。在窄的温度窗口内，PCR产品会经历从dsDNA和ssDNA状态的相变。如上所述，这种转变可以减小由溶液发射的荧光。这种转变发生的温度窗口可以被称作熔化区域、熔化转变和/或熔化窗口。通常用在这种熔化曲线实验中的键联染料可以随着温度变化而自然地在溶液中发出荧光。例如，在不存在dsDNA的情况下，键联染料(诸如LCGreen Plus(这可以从 Idaho Technology公司买到，并且是其注册商标))的荧光信号可以作为温度的函数而单调减小。因此，以上述方式(例如，通过测量随着核酸产品和键联染料被加热而发射的EO 辐射)获得的熔化曲线可以包括由染料化合物发射到dsDNA产品的荧光与通过溶液中的键联染料和/或结合到ddDNA的染料而自然地产生的背景荧光的组合。因此，所测量结构，通过在键联染料存在的情况下加热核酸产品而获得的粗荧光信号，可以被建模为由于产品熔化而产生的荧光与背景荧光的总和(产品随着溶液被加热而从dsDNA分裂为ssDNA)。公式1示出了实验熔化曲线F(T)，实验熔化曲线F(T)包括“真实”熔化曲线M(T)(例如，通过产品熔化而产生的荧光)和背景荧光B(T)的总和F(T) = M (T)+B (T) 公式(1)如上所述，可以从实验熔化曲线F(T)推断和/或判断关于核酸产品的信息(例如，产品结构、成分等)。然而，其背景荧光B(T)成分使得对实验熔化曲线数据F(T)的分析变得复杂。已经发展了各种系统和方法来建模并从实验熔化曲线数据F(T)去除背景荧光 B(T)信号。在一个示例中，背景荧光B(T)被建模为线性函数。许多普通染料的荧光随着温度而线性地减小(在特定温度范围内随温度增加而降低)。在核酸熔化曲线中，产品的荧光在熔化区域内快速地下降。然而，在熔化区域之外，荧光随着温度的变化是基本线性的。因此，实验熔化曲线可以通过在熔化转变之前或之后外推线性基线而归一化。图1描绘了具有线性基线L1(T)和Ltl(T)的实验熔化曲线F(T)。可以从下基线 L0(T)上方的实验熔化曲线F(T)的高度与上、下基线(它们可以具有相同的斜率)之间的差的比例来计算归一化熔化曲线。图2描绘了通过在未标注探测(probe)存在的情况下将不对称PCR反应的产物熔化而获得的熔化曲线的图。所述曲线包括未标注探测和PCR产物熔化转变部。如图2所示，因为上、下基线由于其非线性而穿插到熔化曲线下方，所以上述线性基线方法的使用是有问题的，并且图1中描绘的线性补偿公式的分母变为零(0)。在替换方法中，可以使用指数衰减函数对背景荧光B(T)建模。在PCT申请 No. W02007/035806中提供了用于指数背景建模和去除的系统和方法，其申请日为2006 年9 月 20 日，并且题为“MELTING CURVEANALYSIS WITH EXPONENTIAL BACKGROUND SUBTRACTION”，通过弓I用将其全部结合在这里。实验证据提出在特定温度下(例如，小于85°C的温度)，来自键联染料的背景荧光信号可以被精确地建模为以下形式的延迟指数B(T) = Cea[T_TD公式 2在公式2中，C和a是待从熔化曲线数据F(T)拟合的常数，并且IY是用于指数的自变量的偏移参数(下文中描述的指示器位置)，其通常位于熔化曲线F(T)内的熔化转变部下方。在其他因素中，由于背景荧光的大小在熔化区域之前和之后改变，所以公式2的背景荧光的模型不会直接地符合所观察到的荧光数据。基于用来对背景荧光B(T)建模的指数特性(例如，指数的导数自身是指数)，可以获得公式3 B’=aCea(T—n)公式 3根据背景荧光模型，在熔化过渡区域之前和之后，产品熔化函数是恒定的。可以选择两个温度以限定熔化过渡区域的边界在熔化过渡区域之前选择第一温度ιγ，并且可以在熔化过渡区域之后选择第二温度τκ。这些温度可以被称作为“归一化指示器”。归一化指示器IY和Tk可以被用来通过结合公式2和3而构成指数背景信号B (T)F' (Tl)=B' (Tl) = aC 公式 4aF1(Tr) = B'(Tr) = aCea(T-h)公式 4b所观察的荧光数据的推导可以例如适当地使用中心差分技术。公式如和4b可以解出a和C，产生公式fe和恥a = K RJ v 公式 5a
权利要求
1.一种用于分析熔化曲线数据的方法，所述方法包括获取实验熔化曲线数据，所述实验熔化曲线数据包括作为温度的函数的多个电-光 (EO)辐射测量结果，通过将包括荧光染料的混合物熔化而获得所述测量结果，其中，所述实验熔化曲线数据包括背景EO辐射信号； 获取所述背景EO辐射信号的模型；计算偏离函数，所述偏离函数将所述实验熔化曲线数据与背景EO辐射信号的模型之间的偏差量化为温度的函数；以及将所述偏离函数存储在计算机可读存储介质上，以用来分析所述混合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过将能量梯度施加到包括所述荧光染料的混合物而获得所述实验熔化曲线数据。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述背景EO辐射信号的模型包括由指数衰减函数和二次函数构成的组的其中之一。
4.根据权利要求1所述的方法，还包括在人机界面装置上向用户呈现所述偏离函数。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，计算所述偏离函数包括将所述实验熔化曲线数据划分为多个窗口，每个窗口被限定在所述实验熔化曲线数据的区域内；以及计算多个拟合参数，在各相应窗口中计算每个拟合参数，所述拟合参数对所述各个窗口内的所述实验熔化曲线数据与背景EO辐射信号的模型之间的偏差进行量化，其中，所述偏离函数通过所述拟合参数形成。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述混合物包括核酸样本，并且其中，通过将所述实验熔化曲线数据拟合到所述背景EO辐射信号的模型来计算所选择的窗口的拟合参数，拟合的形式为
7.根据权利要求5所述的方法，其中，计算偏离函数还包括从其减去所述偏离函数的最小值。
8.根据权利要求7所述的方法，还包括通过以下步骤来判断所述实验熔化曲线数据是否包括有效熔化转变区域计算偏离函数的最大值与所述偏离函数的平均值和中值的其中之一的比率；并且在所述比率超出阈值时判断所述实验熔化曲线数据包括有效熔化转变区域。
9.根据权利要求7所述的方法，还包括识别所述偏离函数的第一温度区域内的高背景去除指示器和低背景去除指示器；以及使用所述高和低背景去除指示器来计算经背景校正的熔化曲线。
10.根据权利要求9所述的方法，还包括将第一背景温度识别为所述第一温度区域内的在所述偏离函数超出阈值处的最高温度；限定包括比所述第一背景温度高和/或与第一背景温度相等的温度的指示器探测区域；以及从所述指示器探测区域选择所述高背景去除指示器和低背景去除指示器。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述混合物包括蛋白质样本，所述方法还包括获得所述实验熔化曲线数据内的聚集信号的导数的模型；以及使用所述导数信号模型来从所述经过背景校正的熔化曲线去除所述聚集信号。
12.根据权利要求9所述的方法，其中，所述混合物包括核酸样本，所述方法还包括 将高背景温度识别为所述第一温度区域内所述偏离函数超出阈值加上第一缓冲常数处的最高温度；将低背景温度识别为所述第一温度区域内所述偏离函数超出阈值减去第二缓冲常数处的最低温度；限定高探测区域，所述高探测区域包括大于和/或等于所述高背景温度的温度并且具有预定宽度；限定低探测区域，所述低探测区域包括小于和/或等于所述低背景温度的温度并且具有预定宽度；以及从所述高探测区域选择所述高背景去除指示器和从所述低探测区域选择所述低背景去除指示器。
13.根据权利要求9所述的方法，其中，通过使得目标函数最小化来选择所述高背景去除指示器和所述低背景去除指示器，所述目标函数被构造为对所述实验熔化曲线数据与所述背景EO辐射信号的模型之间的误差进行量化。
14.根据权利要求9所述的方法，还包括 将多个经背景校正的熔化曲线彼此比较；基于所述比较，将所述多个经背景校正的熔化曲线聚集为两个以上的组； 基于所述两个以上的聚集之内的背离以及所述两个以上的聚集之间的背离来计算聚集质量度量；以及基于所述聚集质量度量来判断是否改进所述背景去除指示器，并且在要改进所述背景去除指示器时，调整所述背景去除指示器，使用经调整的背景去除指示器来计算经调整的经背景校正的熔化曲线，以及重新计算所述聚集质量度量。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述混合物包括核酸样本，所述方法还包括 扩大所述核酸样本；通过施加能量梯度来熔化包括核酸样本和荧光染料的溶液；以及获取作为温度的函数的多个EO辐射测量结果。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述混合物包括蛋白质样本。
17.一种计算机可读存储介质，其包括被构造为使得计算装置执行用于分析熔化曲线数据的方法的计算机可读指令，所述方法包括获取实验熔化曲线数据，所述实验熔化曲线数据包括作为温度的函数的多个电-光 (EO)辐射测量结果，通过将包括荧光染料的混合物熔化而获得所述测量结果，其中，所述实验熔化曲线数据包括背景EO辐射信号；获取所述背景EO辐射信号的模型；以及计算偏离函数，所述偏离函数将所述实验熔化曲线数据与背景EO辐射信号的模型之间的偏差量化为温度的函数。
18.根据权利要求17所述的计算机可读存储介质，其中，通过将能量梯度施加到包括所述荧光染料的混合物而获得所述实验熔化曲线数据。
19.根据权利要求17所述的计算机可读存储介质，其中，所述背景EO辐射信号的模型包括由指数衰减函数和二次函数构成的组的其中之一。
20.根据权利要求17所述的计算机可读存储介质，所述方法还包括在人机界面装置上向用户呈现所述偏离函数。
21.根据权利要求17所述的计算机可读存储介质，其中，计算所述偏离函数包括 将所述实验熔化曲线数据划分为多个窗口，每个窗口限定在所述实验熔化曲线数据的温度范围内；以及计算多个拟合参数，在各个所述窗口中计算每个拟合参数，所述拟合参数对所述各个窗口内的所述实验熔化曲线数据与背景EO辐射信号的模型之间的偏差进行量化，其中，所述偏离函数通过所述拟合参数形成。
22.根据权利要求21所述的计算机可读存储介质，其中，所述混合物包括核酸样本，并且其中，通过将所述实验熔化曲线数据拟合到所述背景EO辐射信号的模型来计算所选择的窗口的拟合参数，拟合的形式为 W
23.根据权利要求22所述的计算机可读存储介质，其中，计算的偏离函数还包括从其减去所述偏离函数的最小值。
24.根据权利要求23所述的计算机可读存储介质，所述方法还包括通过以下步骤判断实验熔化曲线数据是否包括有效熔化转变区域计算偏离函数的最大值与所述偏离函数的平均值和中值的其中之一的比率；并且在所述比率超出阈值时判断所述实验熔化曲线数据包括有效熔化转变区域。
25.根据权利要求23所述的计算机可读存储介质，所述方法还包括识别所述偏离函数的第一温度区域内的高背景去除指示器和低背景去除指示器；以及使用所述高和低背景去除指示器来计算经背景校正的熔化曲线。
26.根据权利要求25所述的计算机可读存储介质，所述方法还包括将第一背景温度识别为所述第一温度区域内在所述偏离函数超出阈值处的最高温度；限定包括比所述第一背景温度高和/或与第一背景温度相等的温度的指示器探测区域；以及从所述指示器探测区域选择高背景去除指示器和低背景去除指示器。
27.根据权利要求沈所述的计算机可读存储介质，其中，所述混合物包括蛋白质样本， 所述方法还包括获得所述实验熔化曲线数据内的聚集信号的导数的模型；以及使用所述导数信号模型来从所述经过背景校正的熔化曲线去除所述聚集信号。
28.根据权利要求25所述的计算机可读存储介质，其中，所述混合物包括核酸样本，所述方法还包括将高背景温度识别为所述第一温度区域内所述偏离函数超出阈值加上第一缓冲常数处的最高温度；将低背景温度识别为所述第一温度区域内所述偏离函数超出阈值减去第二缓冲常数处的最低温度；限定高探测区域，所述高探测区域包括大于和/或等于所述高背景温度的温度并且具有预定宽度；限定低探测区域，所述低探测区域包括小于和/或等于所述低背景温度的温度并且具有预定宽度；以及从所述高探测区域选择所述高背景去除指示器和从所述低探测区域选择所述低背景去除指示器。
29.根据权利要求25所述的计算机可读存储介质，其中，通过使得目标函数最小化来选择所述高背景去除指示器和所述低背景去除指示器，所述目标函数被构造为对所述实验熔化曲线数据与所述背景EO辐射信号的模型之间的误差进行量化。
30.根据权利要求25所述的计算机可读存储介质，所述方法还包括 将多个经背景校正的熔化曲线彼此比较；基于所述比较，将所述多个经背景校正的熔化曲线聚集为两个以上的组； 基于所述两个以上的聚集之内的背离以及所述两个以上的聚集之间的背离来计算聚集质量度量；以及基于所述聚集质量度量来判断是否改进所述背景去除指示器，并且在要改进所述背景去除指示器时，调整所述背景去除指示器，使用经调整的背景去除指示器来计算经调整的经背景校正的熔化曲线，以及重新计算所述聚集质量度量。
31.根据权利要求17所述的计算机可读存储介质，其中，所述混合物包括核酸样本，所述方法还包括扩大所述核酸样本；通过施加能量梯度至所述混合物以及增加所述混合物的离子浓度这两者之一来熔化所述混合物；以及获取作为温度和离子浓度这两者之一的函数的多个EO辐射测量结果。
32.一种用于分析熔化曲线数据的设备，包括 包括处理器的计算装置；获取模块，其可以在所述处理器上运行并且被构造为获取实验熔化曲线数据，所述实验熔化曲线数据包括通过将包括荧光染料的混合物熔化而获得的多个电-光(EO)辐射测量结果，其中，所述实验熔化曲线数据包括背景EO辐射信号；建模模块，其可以在所述处理器上运行并且被构造为获取所述背景EO辐射信号的模型；处理模块，其可以在所述处理器上运行并计算偏离函数，所述偏离函数将所述实验熔化曲线数据与背景EO辐射信号的模型之间的偏差进行量化，其中，所述处理模块通过下述方式来计算所述偏离函数将所述实验熔化曲线数据划分为多个窗口，每个窗口限定在所述实验熔化曲线数据的区域内，计算多个拟合参数，每个拟合参数在一个相应的所述窗口中计算，以及对所述各个窗口内的所述实验熔化曲线数据与背景EO辐射信号的模型之间的偏差进行量化，其中，所述偏离函数通过所述拟合参数形成。
33.根据权利要求32所述的设备，其中，基于所述实验熔化曲线数据的分辨率、所述实验熔化曲线数据内的感兴趣的特征的特性、以及性能度量的其中之一来选择窗口的宽度。
34.根据权利要求32所述的设备，其中，通过将所述实验熔化曲线数据拟合到所述背景EO辐射信号的模型来计算所选择的窗口的拟合参数，拟合的形式为
35.根据权利要求32所述的设备，其中，所述处理模块被构造为从所述偏离函数去除所述偏离函数的最小值。
36.根据权利要求35所述的设备，其中，所述处理模块被构造为通过下述方式来判断实验熔化曲线数据是否包括有效熔化转变区域计算偏离函数的最大值与所述偏离函数的平均值和中值的其中之一的比率，在所述比率超出阈值时判断所述实验熔化曲线数据包括有效熔化转变区域，并且在所述比率不超出阈值时判断所述实验熔化曲线数据不包括有效熔化转变区域。
37.根据权利要求36所述的设备，其中，使用多个偏离函数来计算所述阈值，每个阈值是使用不同的相应实验熔化曲线数据来计算的，并且其中，使用每个所述相应偏离函数的最大值与每个所述相应偏离函数的平均值或中值比率的平均值或中值来计算所述阈值。
38.根据权利要求37所述的设备，其中，所述阈值基于所述多个偏离函数的复活个比率之内的标准差。
39.根据权利要求37所述的设备，其中，所述处理模块被构造为识别在所述偏离函数的第一温度区域内的高背景去除指示器和低背景去除指示器，以及被构造为使用所述高和低背景去除指示器来计算经背景校正的熔化曲线数据。
40.根据权利要求39所述的设备，其中，所述处理模块被构造为将第一背景温度识别为所述第一温度区域内在所述偏离函数超出阈值处的最高温度；限定包括比所述第一背景温度更高和/或与第一背景温度相等的温度的指示器探测区域；以及从所述指示器探测区域选择高背景去除指示器和低背景去除指示器。
41.根据权利要求40所述的设备，其中，所述混合物包括蛋白质样本，其中，所述处理模块被构造为获得所述实验熔化曲线数据内的聚集信号的导数的模型，以及使用所述导数信号模型来从所述经过背景校正的熔化曲线去除所述聚集信号。
42.根据权利要求39所述的设备，其中，所述处理模块被构造为，将高背景温度识别为所述第一温度区域内所述偏离函数超出阈值加上第一缓冲常数处的最高温度，将低背景温度识别为所述第一温度区域内所述偏离函数超出阈值减去第二缓冲常数处的最低温度，限定高探测区域，所述高探测区域包括大于和/或等于所述高背景温度的温度并且具有预定宽度，限定低探测区域，所述低探测区域包括小于和/或等于所述低背景温度的温度并且具有预定宽度，以及从所述高探测区域选择所述高背景去除指示器和从所述低探测区域选择所述低背景去除指示器。
43.根据权利要求39所述的设备，其中，所述处理模块被构造为通过使得目标函数最小化来选择所述高背景去除指示器和所述低背景去除指示器，所述目标函数被构造为对所述实验熔化曲线数据与所述背景EO辐射信号的模型之间的误差进行量化。
44.根据权利要求39所述的设备，其中，所述处理模块被构造为， 将多个经背景校正的熔化曲线彼此比较，基于所述比较，将所述多个经背景校正的熔化曲线聚集为两个以上的组， 基于所述两个以上的聚集之内的背离以及所述两个以上的聚集之间的背离来计算聚集质量度量，以及基于所述聚集质量度量来判断是否改进所述背景去除指示器，并且在要改进所述背景去除指示器时，所述处理模块被构造为， 调整所述背景去除指示器，使用经调整的背景去除指示器来计算经调整的经背景校正的熔化曲线，以及重新计算所述聚集质量度量。
45.根据权利要求32所述的设备，其中，所述混合物包括核酸样本，所述设备还包括 被构造为获取所述实验熔化曲线数据的仪器，所述仪器包括用于保持所述混合物的容ο
46.根据权利要求45所述的设备，其中，所述仪器包括热循环器。
47.一种用于分析熔化曲线数据的方法，所述方法包括获取实验熔化曲线数据，所述实验熔化曲线数据包括沿着熔化梯度的多个电-光(EO) 辐射测量结果，通过将熔化梯度施加至包括EO辐射染料的混合物熔化而获得所述测量结果，其中，所述实验熔化曲线数据包括背景EO辐射信号； 获取所述背景EO辐射信号的模型；计算偏离函数，所述偏离函数将所述实验熔化曲线数据与背景EO辐射信号的模型之间的偏差量化为温度的函数，计算的方式为将所述实验熔化曲线数据划分为多个窗口，每个窗口限定在所述实验熔化曲线数据的区域内，计算多个拟合参数，每个拟合参数对相应窗口内的所述实验熔化曲线数据与背景EO 辐射信号的模型之间的偏差进行量化，并且通过所述拟合参数形成所述偏离函数；以及将所述偏离函数存储在计算机可读存储介质上，以用于分析所述混合物。
48.根据权利要求47所述的方法，其中，通过施加能量梯度至所述混合物以及增加所述混合物的离子浓度的混合物熔化而获取实验熔化曲线数据。
全文摘要
本发明提供了一种用于熔化曲线自动分析的系统和方法。实验熔化曲线被建模为真实熔化曲线和背景荧光的和。可以基于实验熔化曲线数据和背景信号模型来产生偏离函数。可以通过将实验曲线的范围划分为多个窗口来生成偏离函数。在每个窗口内，可以计算背景信号的模型与实验熔化曲线数据之间的拟合。所述偏离函数可以以所得到的拟合参数形成。所述偏离函数可以包括背景信号补偿以及可以被用在各种熔化曲线分析操作(诸如数据可视化、聚集、建立基因组、扫描、阴性样本去除等)中。所述偏离函数可以被用来引起自动的背景校正处理。经背景校正的熔化曲线还可以被进一步处理以去除聚集信号。
文档编号G06F9/00GK102428459SQ201080021436
公开日2012年4月25日 申请日期2010年5月14日 优先权日2009年5月15日
发明者卡尔·托马斯·威特沃, 托马斯·查尔斯·罗宾斯, 罗伯特·安德鲁·帕莱斯 申请人:爱达荷科技公司, 犹他州立大学研究基金会