本发明涉及农业
技术领域：
，特别是一种越橘耐较高土壤ph值胁迫能力鉴定指标的筛选方法。
背景技术：
：越橘(blueberry)为杜鹃花科(ericaceae)越橘属(vacciniumspp.)植物。越橘果实富含花青素等物质，具有清除自由基、延缓衰老、抗癌等作用，被认为是21世纪新兴保健果品(johnsonsa,figueroaa,navaein,etal.dailyblueberryconsumptionimprovesbloodpressureandarterialstiffnessinpostmenopausalwomenwithpre-andstage1-hypertension:arandomized,double-blind,placebo-controlledclinicaltrial.journaloftheacademyofnutritionanddietetics,2015,115(3):369-377.)。近年来越橘产品在世界范围内快速增加(李亚东，裴嘉博，孙海悦.全球蓝莓产业发展现状及展望.吉林农业大学学报，2018，v.40(04)：47-58.)。越橘生长对土壤要求苛刻，目前普遍认为越橘正常生长需要ph值4.5～5.5的酸性根际环境，而不适宜的土壤酸度对越橘植物则是一种环境胁迫(korcakrf.nutritionofblueberryandothercalcifuges.horticulturalreviews,volume10.johnwiley&sons,inc.2011.)，通过直接或间接途径影响植物根系发育及生理生化过程，限制其生长和发育，因而成为影响越橘生长并限制产业发展的重要因素。生产中，绝大多数地区土壤ph值过高，需要土壤改良，才能满足越橘正常生长发育的需要。土壤改良不仅花费昂贵，而且也不能作为较高ph值土壤上越橘生产的长期解决方案。因此挖掘越橘本身的耐土壤高ph值胁迫能力，筛选和培育耐土壤高ph值的越橘品种，是十分迫切和重要的。许多研究表明，当越橘生长在较高ph值土壤中时，常表现为营养缺乏、生长迟缓和产量下降，生理代谢过程产生也受到一定影响(trehanej.blueberries,cranberries,andothervacciniums.portland:timberpress,2004；李晴晴，鲁珊珊，张红，等.乌饭树和蓝莓对不同土壤ph值的生理反应.浙江大学学报(农业与生命科学版)，2017，43(4)：469-475；张宇，张丙秀，魏媛媛，等.土壤ph值对蓝莓叶片生理生化的影响.江苏农业科学，2017(13)：107-109；皇甫诗男，高庆玉，张丙秀，等.不同土壤ph值对蓝莓光合作用的影响.北方园艺,2017(13)：31-37.)。目前多数研究集中在不同土壤ph值体系对不同越橘品种生长、营养及生理代谢影响，而对耐较高土壤ph值胁迫品种资源评价和指标筛选研究较少，且评价指标多为单一的生长指标(finnce,lubyjj,rosencj,etal.blueberrygermplasmscreeningatseveralsoilphregimes.i.plantsurvivalandgrowth.journaloftheamericansocietyforhorticulturalscience.americansocietyforhorticulturalscience,1993,118(3):377-382；finnc,lubyjj,rosencj,etal.evaluationinvitroofblueberrygermplasmforhigherphtolerance.journaloftheamerican.societyforhorticulturalscienceamericansocietyforhorticulturalscience,1991,116(2):312-316.)，而通过对生长指标、生理指标、气体交换参数和叶绿素荧光参数等测定，利用多种数学分析方法进行指标筛选的研究尚未见报道。植物的抗逆性是一个受多基因和胁迫因子双重控制的复杂性状，不同植物种类或品种抗逆机制差异较大。一方面，利用单一性状指标评价其抗逆性有较大的局限性，容易造成片面性和不稳定性；另一方面，多指标的综合评价方法虽然可以改善单纯使用个别指标的片面性，但依然存在局限性，如主成分分析方法利用降维方法将多个指标进行了简化，却忽略了某些指标之间存在着密切的内在联系，它们的变化趋势基本一致，这些指标实际属于同一类型；此外，使用指标过多增加了鉴定工作的复杂程度。因此，本发明通过对较高土壤ph值胁迫下越橘品种15项指标的测定，通过主成分分析、隶属函数分析和多元逐步回归方法，筛选出与越橘耐较高土壤ph值胁迫能力最相关的指标，并获得最优回归方程，从而建立高效、可靠的越橘品种耐较高土壤ph值胁迫能力的评价方法。技术实现要素：本发明的目的是提供一种越橘耐较高土壤ph值胁迫能力鉴定指标的筛选方法。以一年生不同品种越橘作为评价材料，对不同土壤ph值条件下生长指标、生理指标、气体交换参数和叶绿素荧光参数进行测定，利用主成分分析、隶属函数法和回归分析进行越橘品种耐较高土壤ph值胁迫鉴定指标的筛选，具体为：利用主成分分析和隶属函数值分析法计算各品种耐较高土壤ph值胁迫能力的综合评价值；建立耐较高土壤ph值胁迫能力鉴定的最优回归方程；利用最优回归方程获得各品种预测的综合评价值。以预测的综合评价值为依据评价越橘品种耐土壤较高ph值能力，预测的综合评价值越大，耐较高土壤ph值胁迫能力越强，反之，耐较高土壤ph值胁迫能力越弱。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种越橘品种耐较高土壤ph值胁迫能力鉴定指标的筛选方法，包括以下步骤：(1)提前一年进行土壤改良，将园土和草炭土按体积比1:1(v:v)配比混合，再按1.2kg/m3的量添加硫磺粉，将上述成分混匀备用；选取高度一致且长势良好的待评价的一年生越橘品种扦插苗栽植于装有上述改良土壤的花盆中；栽植(苗木生长)一个月后，对于每个越橘品种进行2种土壤ph值处理：对照ph值为5.0，胁迫ph值为6.0。分别用硫酸在ph检测仪下调配成处理溶液用于土壤ph处理。每隔2d浇灌处理溶液1次，每次每盆浇300ml，每次浇灌前用自来水冲洗土壤。ph值处理90d后进行与耐较高土壤ph值胁迫能力相关指标的测定，所述耐较高土壤ph值胁迫能力的相关指标为：生长指标、生理指标、气体交换参数和叶绿素荧光参数。(2)为消除品种间基础性状的差异，采用耐较高土壤ph值胁迫能力相关指标的相对值(公式：指标相对值＝胁迫下指标值/对照指标值)进行耐较高土壤ph值胁迫能力鉴定指标的筛选。对步骤(1)获得的指标的相对值进行主成分分析，获得每个主成分的贡献率，累计贡献率达到80％以上则保留该主成分，所保留成分即为用于较高土壤ph值胁迫鉴定指标的主成分，将原有的单项筛选指标转化为相互独立的综合指标(主成分)，利用公式(1)可计算出各品种的综合指标值zi；所述公式(1)为：式中，zi为综合指标值，ai为单一指标特征根所对应的特征向量，xi为单一指标经标准化处理值。(3)采用隶属函数法将步骤(2)获得的综合指标值标准化，即根据某一越橘品种第i个综合指标值以及所有品种综合指标值中的最大值和最小值，计算每个品种每个综合指标值的隶属函数值，所述隶属函数值计算公式(2)为：μ(zi)＝(zi–zimin)/(zimax-zimin)(i＝1，2，···，n)(2)式中，μ(zi)为各综合指标值的隶属函数值，zi为各品种第i个综合指标值；zimax和zimin分别为各品种第i个综合指标值中的最大值和最小值。(4)根据越橘品种第i个综合指标值的贡献率，利用公式(3)计算每个综合指标对应的权重值(重要程度)；所述公式(3)为：式中，wi为权重，表示第i个综合指标在所有综合指标中的重要程度；pi为第i个综合指标的贡献率。(5)根据步骤(3)获得的每个品种综合指标的隶属函数值和步骤(4)获得的每个综合指标的权重值，利用公式(4)计算各品种耐较高土壤ph值能力综合评价值(d值)，所述公式(4)为：式中d值为各品种耐较高土壤ph值胁迫能力综合评价值，wi值表示第i个综合指标在所有综合指标中的重要程度，μ(zi)为各综合指标值的隶属函数值。(6)以d值为因变量，以各鉴定指标的相对值作为自变量，进行逐步回归分析，获得越橘耐较高土壤ph值胁迫能力的回归方程。通过回归方程获得的预测的d值越大，越橘品种耐较高土壤ph值能力越强，反之，耐较高土壤ph值胁迫能力越弱。优选地，所述步骤(1)中，栽植(苗木生长)一个月后，对于每个越橘品种，土壤ph值处理设置为2组：对照ph值为5.0，胁迫ph值为6.0；每个处理3次重复，每个处理4盆，每盆栽植1株苗木，即每个处理12株苗木。优选地，所述步骤(1)中，所述与耐较高土壤ph值能力相关的指标为：株高生长量、丙二醛含量、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性，过氧化氢酶活性、叶绿素含量、净光合速率、胞间co2浓度、气孔导度、蒸腾速率、最大光化学效率、非光化学猝灭系数、光化学猝灭系数和电子传递速率。优选地，所述步骤(1)中，采用酸性茚三酮比色法测定脯氨酸含量。优选地，所述步骤(1)中，采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量。优选地，所述步骤(1)中，用丙酮浸提分光光度法测定叶绿素含量。优选地，所述步骤(1)中，用氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶活性。优选地，所述步骤(1)中，用愈创木酚法测定过氧化物酶活性。优选地，所述步骤(1)中，用双氧水法测定过氧化氢酶活性。优选地，所述步骤(1)中，用茚三酮显色法测定脯氨酸含量。优选地，所述步骤(1)中，气体交换参数的测定方法为：使用li-6400xt便携式光合仪(美国li-cor公司)于上午8:00-11:00测定叶片光合参数，包括净光合速率、胞间co2浓度、气孔导度、蒸腾速率。光强设定为1000μmol·m-2·s-1，温度控制在(26±1)℃，气体流速设置为500μmol·s-1。选择中部同向成熟叶作为测定叶，每株测定3片叶，取平均值。先对叶片进行20min光诱导，然后进行测定。优选地，所述步骤(1)中，叶绿素荧光参数的测定方法为：应用li-6400xt便携式光合仪的荧光模式测定。选取中部同向成熟叶片作为测定叶，每株3片叶，取平均值。测定前一天傍晚用锡箔纸包裹测定叶，经充分暗适应后，于第二天清晨测定初始荧光(fo)、可变荧光(fv)和最大荧光(fm)，计算psii最大光化学效率fv/fm＝(fm-fo)/fm。随后，将植物置于自然光下活化20min，再测定非光化学猝灭系数、光化学猝灭系数和psⅱ光量子产量。电子传递速率＝活化光强度×psⅱ光量子产量×0.5×0.84；非光化学猝灭系数(npq)＝fm/fm′-1，式中fm′为光适应过程中的饱和荧光值。其余参数由仪器自动给出。优选地，所述步骤(2)中，利用spss软件进行主成分分析。优选地，所述步骤(6)中，越橘耐土壤高ph值胁迫能力的回归方程为公式(5)，所述公式(5)为：d＝-4.002+0.156x1+0.609x2+4.015x3(5)式中，d值为各品种耐较高土壤ph值胁迫能力综合评价值的预测值，x1、x2和x3分别代表过氧化氢酶活性、株高生长量和最大光化学效率的相对值。相关分析表明按回归方程获得的预测的d值与实际d值呈极显著相关关系(r2＝0.994)，表明这3个指标对越橘耐土壤较高土壤ph值胁迫能力有显著影响，因此确定通过这3个指标来鉴定越橘耐较高土壤ph值胁迫能力，可使评价工作简化。本发明具有如下优点：本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种越橘耐较高土壤ph值胁迫能力鉴定指标的筛选方法。该方法利用主成分分析法、隶属函数法和回归分析法筛选出对越橘耐较高土壤ph值胁迫能力影响最大的指标，并建立了回归方程。该方法建立了评价越橘耐较高土壤ph值胁迫能力的最优体系，评价方法高效、简单，评价结果准确、可靠，适用于评价不同品种越橘耐较高土壤ph值胁迫能力，为耐较高土壤ph值胁迫越橘新品种的培育以及在较高ph值土壤上的越橘栽培提供技术依据。具体实施方式下面将结合具体实施例对本发明进行进一步详细的说明。实施例1下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。本实施例的越橘耐较高土壤ph值胁迫能力鉴定指标的筛选方法，包括以下步骤：(1)鉴定材料及各指标的测定方法：用于鉴定的材料为一年生越橘扦插苗，品种为‘蓝丰’、‘瑞卡’、‘双迪’、‘斯巴坦’、‘卡拉’、‘伊丽莎白’、‘钱德勒’、‘布里吉塔’、‘公爵’、‘甜心’、‘埃利奥特’，共计11个品种。试验在大连大学现代农业试验基地温室内进行。提前一年进行土壤改良，将园土和草炭土按1:1(v:v)配比混合，再按1.2kg/m3的量添加硫磺粉，将上述成分混匀备用。2018年5月2日，各品种选取高度一致且长势良好的扦插苗栽植于装有上述改良土壤的花盆中。6月1日开始布设试验，对于每个越橘品种，土壤ph值处理设置为2组：对照ph值为5.0，胁迫处理ph值为6.0。每个处理3次重复，每个处理4盆，每盆栽植1株苗木，即每个处理12株苗木。用硫酸在ph检测仪下调配成处理溶液。每隔2d浇灌处理溶液1次，每次每盆浇300ml，每次浇灌前用自来水冲洗土壤。ph值处理90d后进行苗木生长指标、生理指标以及气体交换参数和叶绿素荧光指标测定，选取从枝条顶端往下第5～8成熟叶片，测定生理指标，每项指标重复5次。生长指标测定方法：株高用卷尺测定，株高增长量为不同水平ph值处理后值减去处理前的测定值。生理指标测定方法：参考高俊凤(高俊凤.植物生理学实验指导.北京：高等教育出版社,2006)的方法，用丙酮浸提分光光度法测定叶绿素含量；硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量；氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶活性；愈创木酚法测定过氧化物酶活性，双氧水法测定过氧化氢酶活性；茚三酮显色法测定脯氨酸含量。气体交换参数测定方法：使用li6400xt便携式光合仪(美国li-cor公司)于2018年9月8:00-11:00测定叶片光合参数，包括净光合速率、胞间co2浓度、气孔导度、蒸腾速率。光强设置为1000μmol·m-2·s-1，温度控制在(26±1)℃，气体流速设置为500μmol·s-1。选择中部同向成熟叶作为测定叶，每株测定3片叶。先对叶片进行20min光诱导，然后进行测定。叶绿素荧光参数测定方法：应用li-6400xt便携式光合仪的荧光模式测定。选取中部同向成熟叶片作为测定叶，每株测定3片叶，取平均值。测定前一天傍晚用锡箔纸包裹测定叶片，经充分暗适应后，于第二天清晨测定初始荧光(fo)、可变荧光(fv)和最大荧光(fm)，计算psii最大光化学效率fv/fm＝(fm-fo)/fm。随后，将植物置于自然光下活化20min，再测定非光化学猝灭系数、光化学猝灭系数和psⅱ光量子产量。电子传递速率＝活化光强度×psⅱ光量子产量×0.5×0.84；非光化学猝灭系数(npq)＝fm/fm′-1，式中fm′为光适应过程中的饱和荧光值。其余参数由仪器自动给出。(2)为消除品种间基础性状的差异，采用与较高土壤ph值胁迫能力筛选指标的相对值(公式：指标相对值＝胁迫下指标值/对照指标值)进行耐较高土壤ph值胁迫能力鉴定指标的筛选。各指标相对值列于表1。利用spss22.0软件对15个筛选指标的相对值进行主成分分析，结果(表2)显示，前2个主成分的方差贡献率分别为72.06％和9.40％，累计贡献率达81.46％，其余可忽略不计。这样将原有的15个单项筛选指标转化为2个相互独立的综合指标(主成分)。(3)计算越橘品种的综合指标值利用公式(1)可计算出各越橘品种的综合指标值(分别用z1和z2表示)。式中，zi为综合指标值，ai为单个指标特征根所对应的的特征向量，xi为单个指标经标准化处理值，计算结果如表3所示。表1与越橘耐较高土壤ph值胁迫能力相关指标的相对值表中：mda-丙二醛；pro-脯氨酸；sod-超氧化物歧化酶；pod-过氧化物酶；cat-过氧化氢酶；chl-叶绿素；pn-净光合速率；gs-气孔导度；ci胞间co2浓度；tr-蒸腾速率；fv/fm-最大光化学效率；etr-电子传递速率；qp-光化学猝灭系数；npq-非光化学猝灭系数。表2各主成分载荷系数及累计贡献率表3不同越橘品种的综合指标值品种z1z2‘蓝丰’-0.580.29‘瑞卡’-1.29-0.2‘双迪’4.89-1.34‘斯巴坦’-4.270.04‘卡拉’-2.740.18‘伊丽莎白’2.923.15‘钱德勒’1.010.08‘布里吉塔’-3.02-0.94‘公爵’-3.620.26‘甜心’4.53-0.48‘埃利奥特’2.17-1.03(4)越橘品种综合指标值的隶属函数值根据某一越橘品种第i个综合指标值以及所有品种综合指标值中的最大值和最小值，利用公式(2)计算出各品种综合指标值的隶属函数值：μ(zi)＝(zi–zimin)/(zimax–zimin)(i＝1，2，···，n)(2)计算结果如表4所示。(5)越橘品种综合指标值的权重、d值及综合评价根据越橘品种第i个综合指标的贡献率，利用公式(3)计算每个综合指标对应的权重值：式中，wi值表示第i个综合指标在所有综合指标中的重要程度；pi为第i个综合指标的贡献率。利用公式(4)计算综合耐较高土壤ph值胁迫能力d值：式中，d为各品种耐较高土壤ph值能力综合评价值，wi值表示第i个综合指标在所有综合指标中的重要程度，μ(zi)为各综合指标的隶属函数值。表4不同越橘品种综合指标值的权重、隶属函数值、d值、预测的d值及耐较高土壤ph值胁迫能力排序品种μ(z1)μ(z2)d值预测的d值排序‘蓝丰’0.4030.3630.3980.3917‘瑞卡’0.3250.2540.3170.3956‘双迪’1.0000.0000.8850.9141‘斯巴坦’0.0000.3070.0350.04911‘卡拉’0.1670.3390.1870.2038‘伊丽莎白’0.7851.0000.8100.7783‘钱德勒’0.5760.3160.5460.5315‘布里吉塔’0.1360.0890.1310.1319‘公爵’0.0710.3560.1040.06810‘甜心’0.9610.1920.8720.8822‘埃利奥特’0.7030.0690.6300.5844权重(wi)0.88460.1154(6)以d值为因变量，以各鉴定指标的相对值作为自变量，进行逐步回归分析，获得越橘耐较高土壤ph值胁迫能力鉴定的回归方程：d＝-4.002+0.156x1+0.609x2+4.015x3式中，d值为各品种耐较高土壤ph值能力综合评价值的预测值，x1、x2和x3分别代表过氧化氢酶活性、株高生长量和最大光化学效率的相对值。相关分析表明按回归方程获得的预测d值与实际d值呈极显著相关关系(r2＝0.994)，表明这3个指标对越橘耐较高土壤ph值胁迫能力有显著影响，故以这3个指标评价越橘较高土壤ph值胁迫能力。根据上述公式计算得到的预测的d值大小来评价各参试品种耐较高土壤ph值胁迫能力的强弱，得出参试品种耐较高土壤ph值胁迫能力由大到小依次为‘双迪’>‘甜心’>‘伊丽莎白’>‘埃利奥特’>‘钱德勒’>‘瑞卡’>‘蓝丰’>‘卡拉’>‘布里吉塔’>‘公爵’>‘斯巴坦’(表4)。以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。当前第1页1 2 3