专利名称:合成被保护的3′－氨基核苷单体的制作方法
技术领域：
本发明涉及合成可用于合成制备寡核苷酸类似物的被正交保护的(orthogonally protected)3’-氨基核苷单体的有效方法，并涉及通过这些方法制备的被正交保护的单体。
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背景技术：
依据于与靶核酸序列或蛋白质的特异性结合，已经广泛地研究了寡核苷酸和寡核苷酸类似物作为治疗药物的用途。已经设计出了结构上经修饰的寡核苷酸类似物，其缺少了天然(磷酸二酯连接的)寡核苷酸对核酸酶的易感性，且在一些情况中，其表现出了其他有益的性能，例如与靶的结合力增加或结合的特异性增强。一种此类型的寡核苷酸类似物是N3’→P5’二氨基磷酸酯连接的寡核苷酸(phosphorodiamidate-linkedoligonucleotide)(Gryaznov and Chen，1994；Chen et al.，1994)。这些化合物是抗核酸酶的，其与互补RNA或双链DNA靶形成了稳定双链，并且已经证实在体外和体内都具有显著的序列特异的反义活性(Gryaznov et al.，1995；Escude et al.，1996；Gryaznov et al，1996；Giovannangeli et al，1997；Skorski et al，1997)。相关的N3’→P5’硫代氨基磷酸酯寡核苷酸保留了N3’→P5’氨基磷酸酯的高RNA结合亲和力，并且也表现出提高了的酸稳定性(Pongracz and Gryaznov，1999；Gryaznov et al，2001)。某些N3’→P5’硫代氨基磷酸酯寡核苷酸已经显示出有治疗前途的端粒酶抑制活性(Gryaznov et al，2003；Asai et al，2003；Wang et al，2004)。
对N3’→P5’氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的逐步的、序列控制的制备采用了3’-氨基核苷单体，其中在添加过程中保护3’-氨基，然后被脱保护以添加更多的单体，以便生成寡核苷酸链(见，例如Gryaznovand Chen，1994；Pongracz and Gryaznov，1999)。因为通常在合成过程中被保护的核苷碱基上的基团是伯胺，所以保护这些基团中所具有的3’-氨基的需要已经使得这些单体的制备变得复杂化。现有的方法(见例如Nelsonet al，1997)需要多个步骤的保护，并通常涉及3’-羟基向3’-叠氮基(-N3)的转化，之后被还原成了3’-胺。这些方法耗时、昂贵并造成单体总产率低。因此，需要提高这些合成法的效率，这将有助于N3’→P5’氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的制备。
发明内容在一个方面，本发明提供了制备具有被保护的核苷碱基和被保护的3’-氨基的腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、或胞嘧啶核苷单体的方法，其中碱基和3’-氨基是被正交保护的。在一个实施方式中，方法包括以下步骤(a)提供3’-氨基-3’-脱氧腺嘌呤核苷、3’-氨基-3’-脱氧胞嘧啶核苷或3’-氨基-3’-脱氧鸟嘌呤核苷的单体，所述单体的5’-羟基、核苷碱基和3’-氨基是未被保护的。
(b)选择性地将3’-氨基与第一保护基团反应；将5’-羟基与第二保护基团反应；以及将核苷碱基与第三保护基团反应；其中，可以在不使核苷碱基脱保护的条件下从3’-氨基去除第一保护基团，且可以在不使核苷碱基或3’-氨基脱保护的条件下从5’-羟基去除第二保护基团。方法还可以包括步骤(c)在不使核苷碱基或3’-氨基脱保护的条件下从5’-羟基去除保护基团。
第一保护基团可以是酸不稳定的基团，例如三芳基甲基例如三苯甲基(三苯甲基)、单甲氧基三苯甲基(MMT)、或二甲氧基三苯甲基(DMT)。在另一个实施方式中，第一保护基团是可以被碱性胺例如DBU或哌啶去除的9-芴甲氧羰基(Fmoc)或其衍生物。
在一个实施方式中，被优选地应用于腺嘌呤核苷或胞嘧啶核苷单体的第二保护基团或第三保护基团是酰基例如苯甲酰基，以及(c)的条件包括氢氧化物离子的弱处理。
在另一个实施方式中，第二保护基团是碱不稳定的三烷基硅醚，例如三甲基硅(TMS)醚，第三保护基团是酰基，以及(c)的条件包括以氢氧化物离子进行弱处理。
在一个进一步的实施方式中，第二保护基团是氟化物不稳定的硅醚，第三保护基团是酰基，以及(c)的条件包括以氟离子进行处理。这些氟化物不稳定的硅醚包括例如叔丁基二甲基硅醚、叔丁基二苯基硅醚、二苯甲基硅醚、以及三(异丙基)硅醚。在一个实施方式中，氟化物不稳定的硅醚是叔丁基二甲基硅(TBDMS)醚。
在另一个实施方式中，方法包括步骤(a)提供3’-氨基-3’-脱氧腺嘌呤核苷、3’-氨基-3’-脱氧胞嘧啶核苷或3’-氨基-3’-脱氧鸟嘌呤核苷的单体，所述单体的5’-羟基、核苷碱基和3’-氨基是未被保护的；(b)选择性地将3’-氨基与第一保护基团反应；以及选择性将核苷碱基与另一保护基团反应；其中，可以在不使核苷碱基脱保护的条件下从3’-氨基去除第一保护基团。
在这个方法的实施方式中，5’-OH基团在保护核苷碱基的条件下仍然基本上是未反应的，并且不需要分开的保护。在一个实施方式中，单体是胞嘧啶单体，第一保护基团是如上所述的保护基团，且所述另一保护基团是酰基，优选地是苯甲酰基。优选地可以通过与酰酐反应的方式掺入酰基保护基团。
在其他实施方式中，单体是鸟嘌呤核苷或腺嘌呤核苷单体，第一保护基团是如上所述的基团，而另一保护基团是甲脒基例如二烷基甲脒基。
在一个相关的方面，本发明提供了制备具有游离的5’-羟基和被保护的3’-氨基的胸腺嘧啶核苷单体的方法，方法包括(a)提供3’-氨基-3’-脱氧胸腺嘧啶核苷单体，所述单体的5’-羟基和3’-氨基是未被保护的，以及(b)选择性地将3’-氨基与第一保护基团反应。
第一保护基团可以是酸不稳定的基团，例如三芳基甲基例如三苯甲基(三苯甲基)。在另一个实施方式中，第一保护基团是可以被碱性胺例如DBU或哌啶所去除的9-芴甲氧羰基(Fmoc)或其衍生物。
这些合成方法中的起始单体和产物单体包括选自氢、羟基、低级烷氧基、低级烷基、和氟(fluoro)的2’-基团。在选定的实施方式中，单体包括选自氢、羟基、甲氧基和氟的2’-基团。在一个实施方式中，单体是2’，3’-双脱氧单体，这样2’-基团就是氢。
在另一个方面，本发明提供了具有一被保护的3’-氨基以及一核苷碱基的腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷或尿嘧啶核苷单体，所述核苷碱基(i)是未被保护的，或(ii)是被保护的，使得可以在不使核苷碱基脱保护的条件下使被保护的3’-氨基脱保护。在选定的实施方式中，可以用酸不稳定的保护基团例如三芳基甲基例如三苯甲基(三苯甲基)保护3’-氨基。在其他实施方式中，用可被碱性胺例如DBU或哌啶去除的9-芴甲氧羰基(Fmoc)或其衍生物保护3’-氨基。
在一个实施方式中，核苷碱基是未被保护的；在其他的实施方式中，用酰基保护核苷碱基。优选地，当单体是腺嘌呤核苷或胞嘧啶核苷单体时，酰基是苯甲酰基；当单体是鸟嘌呤核苷单体时，酰基是异丁酰基。在仍进一步的实施方式中，用甲脒基保护核苷碱基，优选地用二烷基甲脒基保护核苷碱基。
单体的5’-羟基可以是未被保护的，或者它可以是被保护的，使得可以在不使核苷碱基或3’-氨基脱保护的条件下将其脱保护。例如可以用对氟离子或弱碱不稳定的硅醚保护5’-羟基，所述硅醚是例如上面所提及的硅醚。
单体优选地包括2’-基团，其选自氢、羟基、低级烷氧基、低级烷基、和氟代基。在选定的实施方式中，单体包括2’-基团，其选自氢、羟基、甲氧基和氟代基。在一个实施方式中，单体是2’，3’-双脱氧单体，这样2’-基团就是氢。
当结合附图阅读下面的本发明的具体实施方式
时，本发明的这些和其他的目的和特点将变得更为明了。
图1是显示根据本发明的各种实施方式用于合成3’-氨基腺嘌呤核苷单体、也应用于合成3’-氨基胞嘧啶核苷单体的可选择的示例性方法的方案；图2A显示了根据本发明的一个实施方式用于合成3’-氨基鸟嘌呤核苷单体的示例性方法；图2B显示了根据本发明的一个实施方式用于合成3’-氨基鸟嘌呤核苷单体的可选择的示例性方法；图2C显示了根据本发明的另一个实施方式用于合成3’-氨基胞嘧啶核苷单体的方法；和图3显示了根据本发明的另一个实施方式用于合成3’-氨基胸腺嘧啶核苷单体的示例性方法。
具体实施方式I.定义除非另有说明，以下术语具有下面的含义。
对于同一分子中的多个被保护的官能团而言，“被正交保护的(orthogonally protected)”表示有可能使任何选定的基团成员脱保护而不使其他基团脱保护。
对于具有多个未被保护的官能团的分子中的靶官能团的保护而言，“选择性地被保护”表示在分子与保护剂的反应中，靶官能团比任何非靶官能团受到了更大程度的保护。靶官能团的反应程度与任何非靶官能团的反应程度的比例大于1∶1，优选地大于2∶1，以及更优选地大于3∶1或更高，例如大于9∶1。相同的定义适用于给定的官能团与保护基团的“选择性地反应”。
“与保护基团反应”在此等同于“提供保护基团”、“用保护基团保护”、或“与保护基团试剂反应”。
“烷基”指的是由碳和氢组成的完全饱和的非环状部分，其可以是线性的或分支的。烷基的实例是甲基、乙基、正丁基、叔丁基、正庚基、和异丙基。通常优选的烷基是具有1到6个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基、异戊基、正戊基、和异丙基。在其他实施方式中，低级烷基包括具有1到4个碳原子、或1到2个碳原子(甲基和乙基)的基团。
“环烷基”指的是饱和的环状烃，优选地具有4到7个碳原子，更优选地具有5个或6个碳原子(即环戊基或环己基)。
“烯基”指的是由碳和氢组成的不饱和的非环状部分，其可以是线性的或分支的，具有1个或多个双键。通常优选的烯基是低级烯基，其具有2到6个、或2到4个碳原子。
“炔基”指的是由碳和氢组成的不饱和的非环状的部分，其可以是线性的或分支的，含有1个或多个三键。通常优选的炔基是低级炔基，其具有6个、或2到4个碳原子。
“芳基”指的是取代的或未取代的单价芳基，通常具有单个环(例如苯)或两个缩合环(例如萘基)，其中单环的芳基是优选的。术语包括杂芳基，其是在其环内具有1个或多个氮、氧、或硫原子的芳香环基团，例如呋喃基、吡咯基、吡啶基、和吲哚基。“取代的”意思是芳基中的一个或多个环氢(优选地1个或两个环氢)被优选地选自氟、氯、溴、甲基、乙基、甲氧基、卤代甲氧基、和卤代甲基的基团所取代。用于保护基团的优选的芳基是碳环芳基，其可以是未取代的或者是被低级烷氧基(除了连接基团与被保护基团的取代基)取代的。
“芳烷基”指的是烷基，优选地是低级(C1-C4，更优选地C1-C2)烷基，取代基还被芳基(优选地是单环的芳基)取代，实例是苯甲基(CH2C6H5)和苯乙基。
“酰基”指的是R(C＝O)-形式的取代基，其中R是如上定义的烷基、烯基、炔基、芳烷基、或芳基，并且优选地选自低级烷基和单环的碳环芳基。实例包括苯甲酰基(Ph(C＝O)-)、乙酰基(CH3(C＝O)-)、和异丁酰基((CH3)2CH(C＝O)-)。
II.合成被保护单体在一个方面，本发明提供了被正交保护的3’-氨基-5’-羟基核苷单体的有效合成，所述单体3’-位点上的氨基以及核苷碱基是被正交保护的，其起始于相应的未被保护的3’-氨基核苷。典型地，然后将产物单体的游离的5’-羟基磷脂酰化，用于合成N3’→P5’-氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯寡核苷酸(见例如图2B和图3)。
A.起始材料用于单体合成的起始材料是具有下面的通用结构式的3’-氨基核苷 其中BASE是选自鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)的未被保护的核苷碱基。例如在用于生成DNA类似物的2’，3’-双脱氧单体中，2’-取代基X可以是氢。同样，在用于生成RNA或O-烷基RNA类似物中，X可以是羟基或低级烷氧基例如甲氧基。2’-取代基也可以是氟(见例如美国专利No.5,684,143)或低级烷基例如甲基。
可以从位于芬兰Littoinen的Metkinen Oy商品化地得到用作在此所述合成中的起始材料的3’-氨基-2’，3’-双脱氧核苷。也可以从不同的来源例如Dalton Chemical Labs(Toronto，Canada)和MP Biomedicals Inc.(Irvine，CA)中商品化地得到3’-氨基-2’，3’-双脱氧胸腺嘧啶核苷。在文献中已经报道了3’-氨基-2’，3’-双脱氧核苷的各种合成制剂(例如Zaitseva etal，1994；Cech et al，1996；Zaitseva et al，1984)。根据Zaitseva et al，1994，通过酶转糖基作用可以将3’-氨基-2’，3’-双脱氧胸腺嘧啶核苷转化成相应的腺嘌呤核苷或鸟嘌呤核苷单体。
B1.保护策略概述本发明提供了用于将上述核苷转化成相应的碱基被保护的(对于A、G、和C而言)、3’-氨基被保护的单体的有效方法。因为碱基上必须被保护的基团也是氨基，过去还没有成功地在碱基未被保护的情况下进行3’氨基的选择性保护，反之亦然，且现有的用于制备这些单体的方法(见例如Nelson et al，1997)都需要多个保护步骤，并且通常涉及3’-羟基向叠氮基的转化，其随后被还原成了3’-胺。
本发明已经提供了用于在存在核苷碱基的情况下选择性地保护3’-氨基的有效方法，这样使得然后可以以正交保护基团(orthogonal protectinggroup)对核苷碱基进行保护；即，在所选定的能有效去除3’-氨基保护基团(或5’-羟基保护基团，如果存在的话)的条件下，所述正交保护基团不被去除。
另外，在存在5’-羟基时，也选择性地保护3’-氨基，或者反之亦然。因此，给游离的5’-羟基提供保护基团是有可能的，可以在所选定的不会去除3’-氨基保护基团或碱基保护基团的条件下去除该保护基团。(或者，对于胸腺嘧啶而言，游离的5’-羟基可以被直接磷脂酰化)。
5’-羟基的保护基团可以是例如硅烷基，其在例如弱碱或氟离子的条件下可以被去除，该条件不会去除用于核苷碱基的保护基团(通常是酰基或酰胺基)。或者，相同的保护基团(例如酰基)可以被用于5’-羟基和核苷碱基，其中所采用的将其去除的条件(例如弱碱)将使羟基脱保护但不使核苷碱基的氨基脱保护。
在进一步的策略中，可以在使5’-羟基不发生反应且因此不需要被保护的条件下对核苷碱基进行保护。
在所有的情况中，所采用的核苷碱基的保护基团在寡核苷酸合成中所采用的单体偶联反应的条件中都是稳定的。例如在Gryaznov and Chen(1994)和Pongracz and Gryaznov(1999)中描述了用于由在此所述的单体制备成N3’→P5’氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯的方法。
B2.保护策略A、G、和C单体对于腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷或胞嘧啶核苷单体，本发明提供了制备具有游离的5’-羟基、被保护的核苷酸碱基、和被保护的3’-氨基的所述单体的方法，其中碱基和3’-氨基是被正交保护的，如上所定义的那样。起始材料是3’-氨基-3’-脱氧腺嘌呤核苷、3’-氨基-3’-脱氧胞嘧啶核苷、或3’-氨基-3’-脱氧鸟嘌呤核苷的单体，所述单体的5’-羟基、核苷碱基、和3’-氨基是未被保护的。
在一个通用策略中，方法包括选择性地将3’-氨基与第一保护基团反应、将5’-羟基与第二保护基团反应、以及将核苷碱基与第三保护基团反应。第一保护基团(用于保护3’-氨基)是使得在不会使核苷碱基脱保护的条件下而可以将其(第一保护基团)从3’-氨基去除的保护基团。此外，如果存在，第二保护基团(用于保护5’-羟基)是使得在不会使核苷碱基或3’-氨基脱保护的条件下而可以将其(第二保护基团)从5’-羟基去除的保护基团。
根据上面的通用策略，在保护了所需的反应基团之后，如果存在，可以在不会使核苷碱基或3’-氨基脱保护的条件下去除5’-羟基中的第二保护基团。然后可以将单体磷脂酰化，例如用于寡核苷酸合成。
第一、第二、和第三保护基团通常是依次使用的，不过第二和第三个基团实际上可以是相同的，因此可以被用于单个反应。此外，在采用该步骤的策略中，对5’-羟基的保护可以发生在对3’-氨基的保护之前或之后。通常在单容器反应中进行两个反应，不过优选地不同时添加试剂。优选地，首先添加3’-氨基保护剂，如在下面的实施例中所举例说明的那样。
在选定的实施方式中，如下面进一步的讨论的那样，在如例如在图1(结构2向结构6的转化)和图2B中所示的碱基保护步骤过程中，采用了用碱不稳定的硅醚(例如TMS)对5’-羟基的临时保护。
在其他实施方式中，用同一试剂保护5’-羟基和核苷碱基，随后选择性地使羟基脱保护。这样一种试剂通常是酰化剂例如异丁酰基卤化物或苯甲酰卤化物。在图1的结构2向3的转化中显示了这种类型的示例性方案，随后在选择性地使羟基脱保护的温和条件下，用碱进行处理(3向6的转化)。
如上所述，用于保护3’-氨基的第一保护基团是在能去除第二保护基团(对于5’-羟基)(如果存在)的条件下是稳定基团，同时在不会去除第三保护基团(对于核苷碱基)的条件下是不稳定基团。在一个实施方式中，第一保护基团是酸不稳定的，例如三芳基甲基例如三苯甲基(三苯甲基)、单甲氧基三苯甲基(MMT)、或二甲氧基三苯甲基(DMT)。
另一个用作第一保护基团的基团是9-芴甲氧羰基(Fmoc)，其通过碱性胺的非水解性裂解是可以被去除的，所述碱性胺例如为DBU、吗啉、或哌啶。氢氧化物碱(例如NaOH)不适用于这个目的，因为该试剂通常也去除了分子中的其他保护基团。也可以使用通过相似的机制可以被去除的Fmoc的衍生物。这些衍生物包括那些其中Fmoc的芴基(通常是2和/或7位点上的芴基)通常被基团例如低级烷基取代(这不会影响裂解机制)的、或者被吸电子基团例如卤素取代(其增加了保护基团的碱不稳定性)的衍生物(Carpino et al.，1980)。也包括在Carpino et al.，1989中所述的硫杂蒽二氧化物类似物。
图1显示了能用于制备目标单体的合成策略的示例性排列。这些方法特别适用于A(腺嘌呤核苷)和C(胞嘧啶核苷)核苷单体。如下面所述的那样，该方法也可以适用于G(鸟嘌呤核苷)单体，优选地方法要进行一些修饰。在图1和2A-B举例说明的策略中，采用了对5’-羟基的保护。下面进一步讨论的图2C例举了其中没有采用5’-羟基保护的策略。
如上所述，优选的第一保护基团(用于保护3’-氨基)是酸不稳定的基团，例如三苯甲基、MMT或DMT，或是对碱性胺试剂例如DBU不稳定的基团例如Fmoc。在一个实施方式中，优选的第二和第三保护基团都是芳香酰基例如苯甲酰基。在这种情况中，在不会使核苷碱基或3’-氨基脱保护的条件下能有效地使5’-羟基脱保护的条件优选地包括弱碱处理，例如用氢氧化物例如氢氧化铵处理。这些处理能有效地去除5’-羟基中的酰基，以及将二酰基化碱基转化成单酰基化碱基。图1图解了这种方案，其中中间物3被转化成了产物6。
在另一个实施方式中，用于保护5’-羟基的第二保护基团是碱不稳定的三烷基硅醚，优选地是TMS，以及第三保护基团(用于保护核苷碱基)是酰基，例如烷酰基，优选地是异丁酰基或苯甲酰基。在这种情况中，在不会使核苷碱基或3’-氨基脱保护的条件下能有效地使5’-羟基脱保护的条件也优选地包括弱碱处理，例如用氢氧化物例如氢氧化铵处理。该处理能有效地裂解三甲基硅醚，以及如果存在，可以将二酰基化碱基转化成单酰基化碱基。图1也图解了该方案的实例，其中中间物2被转化成了产物6。
另一种特别适用于腺嘌呤核苷和鸟嘌呤核苷单体的优选形式的核苷碱基保护基团是甲脒基保护基团，例如二烷基-、二(环烷基)-、或二(芳烷基)-甲脒基，其中“烷基”优选地是C1-C4以及“环烷基”优选地是C5-C6。具体的实例包括二甲基甲脒基和二苄基甲脒基。在能去除苯甲酰基或异丁酰基保护基团的更弱的条件下一般都可以从核苷碱基(例如在合成结束时)中去除这些保护基团。见，例如Vu et al.，1990、Vincent et al.，1999、和/或每个专利No.5,281,701。如在此所述的，伯胺与二烷基甲酰胺二甲基缩醛的反应例如提供了二烷基甲脒基保护基团。通过用水的或醇的氢氧化铵在室温到约55℃下的处理一般都可以实现脱保护。
在另一个实施方式中，第二保护基团(用于保护5’-羟基)是氟化物不稳定的硅醚，以及第三保护基团(用于保护核苷碱基)是酰基，例如苯甲酰基、或如上所述的甲脒基。在这种情况中，在不会使核苷碱基或3’-氨基脱保护的条件下能有效地使5’-羟基脱保护的条件优选地包括氟离子例如氟化四丁铵(tetrabutylammonium fluoride，TBAF)的处理。该处理能有效地裂解硅醚，以及如果存在，可以将二酰基化碱基转化成单酰基化碱基。图1也图解了该方案的实例，其中中间物5被转化成了产物6。示例性的氟化物不稳定的硅醚包括例如叔丁基二甲基硅醚、叔丁基二苯基硅醚、二苯甲基硅醚、三(异丙基)硅醚、和其他本领域已知的硅醚。
经过一些主要与溶解度相关的修饰，上面的方法也可以用于鸟嘌呤核苷(G)单体。在一个实施方式中，如图2A图解的那样，在方法的早期阶段，用亲脂性基团例如TBDMS保护起始单体7的5’-羟基，以便提高在常用溶剂吡啶中的溶解度。
如上所述，优选的第一保护基团(用于保护3’-氨基)是酸不稳定的基团例如三苯甲基、DMT、或MMT、或者是对碱性胺试剂例如DBU不稳定的基团例如Fmoc。在图2A的实施方式中采用了三苯甲基。根据反应条件，除了所需的3’-单三苯甲基化的化合物8外，可以观察到少量(例如约5％)双三苯甲基化的化合物9。因此，“选择性保护”在此表示具有所需保护状态的分子比其中非靶官能团(或者排它的或者除了靶官能团外的基团)受到保护的分子形成的更多，即比例大于1∶1。优选地，比例大于2∶1，更优选地大于3∶1，以及最优选地大于9∶1。
在一个实施方式中，第二保护基团(用于保护5’-羟基)是氟化物不稳定的硅醚，以及更优选地是增加中间物的溶解度的基团。如图2A所示的，发现TBDMS醚能增加在溶剂吡啶中的溶解度。
第三保护基团优选地是酰基，例如异丁酰基、或如上所述的甲脒基。在这种情况中，在不会使核苷碱基或3’-氨基脱保护的条件下能有效地脱保护5’-羟基的条件优选地包括氟离子例如氟化四丁铵(TBAF)的处理。如图2A所示，该处理能有效地裂解化合物10中的硅醚，而不影响异丁酰基或三苯甲基。
在另一个实施方式中，如在图2B所示的，用更极性的溶剂例如DMF溶解初始单体7，反应方案在其他方面都与图1所示的用于保护腺嘌呤核苷单体1的“临时保护”方案(用TMS醚作为5’羟基保护基团)相似。
图2C图解了特别适用于胞嘧啶单体的合成策略的实施方式，其中没有采用5’-羟基保护。在这个反应方案中，在例如用三苯甲基选择性保护单体12中的3’-氨基之后，碱基的环外氨基与酰酐例如苯甲酰酐反应。溶剂优选地含有醇，相信其竞争并抑制了与5’-羟基的反应。实例包括甲醇、乙醇、以及这些溶剂与例如乙腈、DMF、或吡啶的混和物。在利用如实施例4所述的乙醇中的或9∶1乙腈∶甲醇中的苯甲酰酐的反应中，观察到了很少量的(＜5％)5’-苯甲酰化的产物。然后可以用标准方法将主要的5’-羟基单体14磷脂酰化。
在另一个特别适用于腺嘌呤核苷或鸟嘌呤核苷单体的实施方式中，在利用三苯甲基选择性保护单体的3’-氨基之后，用二烷基甲脒基、二(环烷基)甲脒基、或二苄基甲脒基(优选地用二甲基甲脒基)保护碱基的环外氨基。然后可以用标准方法将预期在这些步骤中仍为基本上或完全未反应的5’-羟基磷脂酰化。
B3.保护策略T单体在另一个方面，本发明提供了制备具有游离的5’-羟基和被保护的3’-氨基的胸腺嘧啶核苷单体的方法。合成策略不同于上面所述的方法，其中在寡核苷酸合成的条件下一般都不需要保护胸腺嘧啶碱基。这种情况中的起始材料是3’-氨基-3’-脱氧胸腺嘧啶核苷单体，所述单体的5’-羟基和3’-氨基是未被保护的，且该方法包括将所述3’-氨基与第一保护基团选择性反应，使得5’-羟基仍然是基本上未被保护的。
如在上面所述的合成中，用于保护3’-氨基的优选的保护基团是酸不稳定的基团，例如三芳基甲基，或者是对碱性胺试剂例如DBU不稳定的基团例如Fmoc。在图3的实施方式中采用了三苯甲基。
如在下面的实施例5中所述的那样，然后将5’-羟基磷酯酰化。要注意，该磷脂酰化过程也适用于上面所述的任一5’-羟基、3’-氨基被保护的以及碱基被保护的单体。
实施例下面的实施例举例说明了本发明，其并不打算限制本发明。例如，根据本领域熟练人员的知识，利用常规试验，反应条件例如溶剂选择、催化剂(例如三乙胺或二异丙乙胺)、反应时间、和反应温度通常都可以不同于下面所例举的条件。在一些情况中，添加试剂的次序可以有所不同。除非有其他的说明，适用于这些反应中的绝大多数反应的溶剂通常包括极性的疏质子溶剂(aprotic solvent)例如吡啶、DMF、乙腈、或其混和物。合适的温度一般是-10℃到室温到约55℃的范围内。
实施例1由3’氨基-2’，3’-双脱氧腺嘌呤核苷合成N6-苯甲酰基-3’-氨基三苯甲基-2’，3’-双脱氧腺嘌呤核苷A.方法1过苯甲酰化途径(如图1所示，1→2→3→6)用干吡啶共蒸发初始单体3’-氨基-2’，3’-双脱氧腺嘌呤核苷(1，10mmol)，然后重悬于100ml含有6eq.三乙胺的干吡啶中，搅拌下将混和物加热到50℃。加入三苯甲基氯化物(1.1 eq.)，继续在50℃下搅拌2个小时。将所得到的含有3’-三苯甲基化单体2的清澈溶液冷却到0℃，一滴一滴地加入5eq.苯甲酰氯，并搅拌反应混和物1个小时，然后将其倾倒到100ml冷5％碳酸氢钠内。用乙酸乙酯提取出沉淀出来的黄色粘性物(yellow gum)，以及蒸发乙酸乙酯溶液。将所形成的油(3，在5’-羟基上具有一个苯甲酰基以及在碱基的N6上具有两个苯甲酰基)溶解于50ml吡啶∶甲醇∶水(65∶35∶5v/v/v)内，将溶液冷却到0℃，并且加入50ml 2M氢氧化钠。在0℃下搅拌25分钟之后，用吡啶盐酸中和反应混和物，以及用蒸发减少混和物的体积。在用乙酸乙酯稀释之后，分离出有机层，用饱和碳酸氢钠洗涤，并在真空中蒸发。用利用二氯甲烷∶甲醇95∶5v/v溶剂系统的硅胶闪光柱色谱法纯化产物。加有游离的5’-羟基和单苯甲酰基化的碱基的产物(6)的分离产率是2.0g(33.6％)。
B.方法2临时保护途径(如图1所示，1→2→6)将初始单体3’-氨基-2’，3’-双脱氧腺嘌呤核苷(1，10mmol)转化成如上所述的3’-氨基被保护的单体，即通过1.1eq.含有6eq.三乙胺的干吡啶的三苯甲基氯化物在50℃下的处理。
将清澈溶液2冷却到0℃，逐滴地加入5eq.三甲基氯硅烷，之后搅拌30分钟，生成了5’-OTMS中间物。然后逐滴加入苯甲酰氯(5eq)，之后在室温下搅拌2个小时，生成了单苯甲酰化和/或双苯甲酰化的碱基被保护的中间物。将反应混和物冷却到0℃，加入20ml冷水，之后搅拌20分钟以及加入20ml浓缩的氢氧化铵。继续搅拌30分钟，真空下浓缩溶液。用乙酸乙酯收集油状残余物，用饱和的碳酸氢钠洗涤，干燥溶液并在真空下蒸发。用硅胶色谱法如上纯化产物。产物的分离产率是3.6g(60.2％)。
在随后的方法中，DMF或DMF/吡啶、以及所加入的三乙胺被用作为初始三苯甲基化反应的溶液，用方法A或方法B进一步反应中间物2，以生成产物6(产率约为70％)。发现在苯甲酰化之前去除三乙胺(例如用水洗涤)可以使产率有所提高，特别是用方法A时。观察到该处理阻止了相信是腺嘌呤碱基的环开放所生成的副产物的形成。通过在进一步反应之前分离出三苯甲基化产物2也消除了该副产物的形成。
C.方法3TBDMS保护途径(如图1所示，1→2→4→5→6)将初始单体3’-氨基-2’，3’-双脱氧腺嘌呤核苷(1，10mmol)转化成如上所述的3’-氨基被保护的单体2，即通过1.1eq.含有6 eq.三乙胺的干吡啶的三苯甲基氯化物在50℃下的处理。
往清澈溶液中加入2 eq.叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMS Cl)，继续在室温下搅拌过夜。将该溶液(3’-三苯甲基氨基-5’-TBDM硅烷氧基中间物4)冷却到-5℃，逐滴加入3eq苯甲酰氯，之后在室温下搅拌两个小时，提供了N6-二苯甲酰化中间物5。真空下浓缩溶液，用乙酸乙酯收集油状残余物，用饱和的碳酸氢钠洗涤，干燥溶液并在真空下蒸发。
将所得到的油状残余物溶解于100ml THF，并加入2 eq.TBAF(氟化四丁铵)。室温下搅拌混和物过夜。往反应混和物中加入乙酸乙酯，用碳酸氢钠、0.5M柠檬酸钠(pH值4)和盐卤洗涤溶液。用硅胶色谱法如上纯化产物，生成了3.3g(55.5％)纯化合物6。
实施例2N4-苯甲酰-3’-氨基三苯甲基-2’，3’-双脱氧胞嘧啶核苷的合成利用任一上面的方法或根据实施例4的方法，可以用相似的方式实现由3’-氨基-2’，3’-双脱氧胞嘧啶核苷合成N4-苯甲酰-3’-氨基三苯甲基-2’，3’-双脱氧胞嘧啶核苷。
实施例3由3’-氨基-2’，3’-双脱氧鸟嘌呤核苷合成N2-异丁酰基-3’-氨基三苯甲基-2’，3’-双脱氧鸟嘌呤核苷(图2A)用干吡啶共蒸发起始材料3’-氨基-2’，3’-双脱氧鸟嘌呤核苷(7，2g)，然后重悬于100ml干吡啶内，加入6eq.二异丙基乙胺。加入叔丁基二甲基氯硅烷(2eq.)，生成了5’-TBDM硅烷氧中间物。在搅拌30分钟之后，分两部分加入1.1eq.三苯甲基氯化物，继续在室温下搅拌过夜。用TLC检测到两种化合物，更慢流动的、更丰富的产物8是所需的5’-TBDMS-3’-氨基三苯甲基-2’，3’-双脱氧鸟嘌呤核苷。更快流动的、更少量的化合物9是碱基被附加地三苯甲基化的产物。用利用甲撑氯∶甲醇∶三乙胺94∶5∶1(v/v/v)溶剂系统的硅胶色谱法分离出单三苯甲基化合物8。
用干吡啶共蒸发该产物，并将其溶解于100ml吡啶内。溶液被冷却到0℃，并加入1.1eq.异丁酰氯，之后搅拌30分钟。在甲醇淬火反应以及在真空中蒸发之后，用甲撑氯-碳酸氢钠进行反应。用硫酸钠干燥有机相，并在真空中将其蒸发。将油状残余物(完全被保护的单体10)溶解于100ml丁撑氧内，加入5eq.氟化四丁铵。室温下搅拌反应混和物过夜，然后用乙酸乙酯稀释，用碳酸氢钠洗涤。在用硫酸钠干燥之后，真空内蒸发溶剂以生成2g 5’-羟基产物11(46.1％)。
在之后的方法中，在DMF/吡啶中、50℃下进行对7的三苯甲基化，通过从二氯甲烷或水中沉淀出主要产物8可以去除副产物9(＜5％)。用图2B的临时保护方案或过酰化反应(与实施例1A类似)保护核苷碱基。在用CH3CN结晶之后，分离出产物11，产率分别是约60％和53％。当小心地避免酰基氯试剂的水解时，也观察到提高了产率。
实施例4由3’-氨基-2’，3’-双脱氧胞嘧啶核苷合成N4-苯甲酰-3’-氨基三苯甲基-2’，3’-双脱氧胞嘧啶核苷(如图2C所示)在存在三乙胺时，用1∶4吡啶∶DMF中的三苯甲基氯化物与起始材料12的3’氨基进行反应。用9∶1 CH3CN∶MeOH中的苯甲酰酐在50℃下与中间物13进行反应。用硅胶色谱法分离出所需的产物14，产率为70％。
实施例5由3’-氨基-3’-脱氧胸腺嘧啶核苷合成3’-氨基三苯甲基-3’-脱氧胸腺嘧啶核苷酸-5’-(2-氰乙基，N，N-二异丙基)亚磷酰胺，随后进行磷脂酰化(如图3所示)用干吡啶共蒸发起始材料3’-氨基-3’-脱氧胸腺嘧啶(15，1.3g)，然后溶解于30ml吡啶内。往该溶液中加入5eq.二异丙基乙胺或三乙胺，之后搅拌10分钟，以及加入1到1.1eq.三苯甲基氯化物。在室温下搅拌反应混和物过夜(或者在50℃下搅拌1个小时)。在TLC没有检测到起始材料之后，用甲醇淬火反应，并在真空内蒸发溶液。将所得到的油溶解于甲撑氯内，用饱和碳酸氢钠洗涤，硫酸钠干燥并浓缩。甲撑氯-己烷沉淀得到了2.2g(85％)白色粉末的产物16。
用干吡啶共蒸发产物16(1.7g)，并将其溶解于100ml干甲撑氯内。往该溶液中，加入4eq.二异丙基乙胺，之后加入1.2eq.2-氰乙基-N，N-二异丙基氯亚磷酰胺。用TLC监测反应，在起始材料消失之后，用饱和碳酸氢钠洗涤溶液，硫酸钠干燥并在真空中蒸发。用利用甲撑氯∶三乙胺10∶1(v/v)溶剂系统的硅胶闪光色谱法纯化产物，生成了2g(83.3％)固体泡沫的磷脂酰化保护的单体17。该方法的总产率为70.8％。
尽管参照具体的方法和实施方式已经描述了本发明，不过可以理解的是，可不脱离本发明而进行各种修饰。
权利要求
1.一种制备具有被保护的核苷碱基和被保护的3’-氨基的腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷或胞嘧啶核苷单体的方法，其中所述碱基和所述3’氨基是被正交保护的，所述方法包括(a)提供3’-氨基-3’-脱氧腺嘌呤核苷、3’-氨基-3’-脱氧胞嘧啶核苷、或3’-氨基-3’-脱氧鸟嘌呤核苷的单体，所述单体中的5’-羟基、核苷碱基、和3’-氨基是未被保护的；(b)选择性地将所述3’-氨基与第一保护基团反应；将所述5’-羟基与第二保护基团反应；以及将所述核苷碱基与第三保护基团反应；其中所述第一保护基团可以在不使所述核苷碱基脱保护的条件下从所述3’-氨基去除，且所述第二保护基团可以在不使所述核苷碱基或所述3’-氨基脱保护的条件下从所述5’-羟基去除。
2.权利要求
1的方法，还包括步骤(c)在不使所述核苷碱基或所述3’-氨基脱保护的条件下从所述5’-羟基去除所述第二保护基团。
3.权利要求
1的方法，其中所述第一保护基团是酸不稳定的。
4.权利要求
3的方法，其中所述第一保护基团是三芳基甲基。
5.权利要求
4的方法，其中所述第一保护基团是三苯甲基。
6.权利要求
1的方法，其中所述单体是腺嘌呤核苷或胞嘧啶核苷单体。
7.权利要求
1的方法，其中所述第二保护基团和第三保护基团都是酰基。
8.权利要求
7的方法，其中所述第二保护基团和第三保护基团都是苯甲酰基。
9.权利要求
1的方法，其中所述第二保护基团是碱不稳定的三烷基硅醚，且所述第三保护基团是酰基。
10.权利要求
1的方法，其中所述第二保护基团是氟化物不稳定的硅醚，且所述第三保护基团是酰基。
11.权利要求
11的方法，其中所述单体包括选自氢、羟基、低级烷氧基、低级烷基、和氟的2’基团。
12.权利要求
11的方法，其中所述单体是2’，3’-双脱氧单体，这样所述2’基团是氢。
13.一种制备具有游离的5’-羟基和被保护的3’-氨基的胸腺嘧啶核苷单体的方法，所述方法包括(a)提供3’-氨基-3’-脱氧胸腺嘧啶核苷单体，其5’-羟基和3’-氨基是未被保护的；以及(b)选择性地将所述3’-氨基与第一保护基团反应。
14.权利要求
13的方法，其中所述第一保护基团是酸不稳定的。
15.权利要求
14的方法，其中所述第一保护基团是三芳基甲基。
16.权利要求
14的方法，其中所述第一保护基团是三苯甲基。
17.具有一被保护的3’-氨基以及一核苷碱基的腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷或胞嘧啶核苷单体，所述核苷碱基(i)是未被保护的或(ii)是被保护的，使得可以在不使所述核苷碱基脱保护的条件下使所述被保护的3’-氨基脱保护。
18.权利要求
17的单体，其中所述核苷碱基是未被保护的。
19.权利要求
17的单体，其中所述3’-氨基是以酸不稳定的保护基团进行保护的。
20.权利要求
19的单体，其中所述酸不稳定的保护基团是三芳基甲基。
21.权利要求
17的单体，其中所述核苷碱基是以酰基进行保护的。
22.权利要求
17的单体，其中所述核苷碱基是以二烷基甲脒基进行保护。
23.权利要求
17的单体，其具有未被保护的5’-羟基。
24.权利要求
17的单体，其具有被保护的5’-羟基，其中可以在不使所述核苷碱基或所述3’-氨基脱保护的条件下使所述5’-羟基脱保护。
25.权利要求
17的单体，其中所述单体包括选自氢、羟基、低级烷氧基、低级烷基、和氟的2’基团。
26.权利要求
25的单体，其中所述单体是2’，3’-双脱氧单体，这样所述2’基团是氢。
27.一种制备具有游离的5’-羟基、被保护的核苷碱基和被保护的3’-氨基的腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷或胞嘧啶核苷单体的方法，其中所述碱基和所述3’-氨基是被正交保护的，所述方法包括(a)提供3’-氨基-3’-脱氧腺嘌呤核苷、3’-氨基-3’-脱氧胞嘧啶核苷、或3’-氨基-3’-脱氧鸟嘌呤核苷的单体，所述单体的5’-羟基、核苷碱基、和3’-氨基是未被保护的。(b)选择性地将所述3’-氨基与第一保护基团反应；和(c)选择性地将所述核苷碱基与其他的保护基团反应；其中可以在不使所述核苷碱基脱保护的条件下从所述3’-氨基去除所述第一保护基团。
28.权利要求
27的方法，其中所述单体是胞嘧啶核苷单体。
29.权利要求
28的方法，其中所述与另一保护基团反应包括与酰酐反应。
30.权利要求
27的方法，其中所述单体是腺嘌呤核苷或鸟嘌呤核苷单体，且所述另一保护基团是二烷基甲脒基、二(环烷基)甲脒基、或二苄基甲脒基。
31.权利要求
27的方法，其中所述第一保护基团是酸不稳定的。
32.权利要求
31的方法，其中所述第一保护基团是三芳基甲基。
专利摘要
本发明涉及被正交保护的3′－氨基核苷单体以及用于其合成的有效方法。本方法采用了在存在未被保护的碱基核苷时对3′－氨基进行选择性保护。
文档编号C07H19/16GK1997658SQ20058002267
公开日2007年7月11日 申请日期2005年6月30日
发明者谢尔盖·M·格里亚兹诺夫, 克里兹蒂娜·蓬格拉茨, 达里娅·杰琳斯卡 申请人:杰龙公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan