一种沾化冬枣叶片愈伤组织的培养方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于植物组培领域，具体涉及一种沾化冬枣叶片愈伤组织的培养方法。
【背景技术】：
[0002] 率树（ZizyphusjujubaMill)是我国的特有果树，具有很高的生态和经济价值。 沾化冬枣是枣类中最优良的的品种之一，北京市营养源研究所分析化验表明：沾化冬枣富 含人体所需的19种氨基酸和多种维生素，其中维生素C的含量是苹果的70倍、梨的100 倍、金丝小枣的20倍，还含有钾、钠、铁、铜等多种微量元素，营养价值居"百果之冠"，被誉 为"活维生素丸"。但由于冬枣高度杂合、花小、人工去雄难、坐果率低、胚败育等方面的缘 故，杂交育种工作难以开展，极大地限制了良种繁育和推广，冬枣产量远远满足不了现实的 需要。因此，优良冬枣繁育和推广有着广阔的发展空间。
[0003] 生产中多采用选择自然芽变与根蘖苗分株、扦插和嫁接等方法进行繁育，利用根 孽分苗繁殖，需与嫁接繁殖相结合，不仅费工费时，成苗率较低，且易侵染各种植物病毒，如 枣疯病类菌原体（M0L)等。而愈伤组织是进行植株再生、细胞培养、原生质体培养及融合、 细胞生理生化研究和遗传改良等研究工作的基础材料，在植物组织培养中具有重要的应用 价值。因此，开展枣树组培研究，对加速优良品种繁殖，培育无病毒苗，开展细胞融合和体细 胞杂交等生物工程技术育种有着极其重要的意义。
[0004] 由枣树茎尖、茎段进行组培快繁国内外已进行了不同程度的研究，但诱导率差强 人意。而叶片取材方便，来源广泛，操作容易，从理论上讲是进行枣树组织培养育种快繁的 很好的外植体材料。枣树叶片培养的研究也有一些报道。但其愈伤组织培养再生植株的系 统研究报道极少。在组织培养过程中，常会遇到污染、褐变和玻璃化等问题使试验失败，给 科研和生产造成损失，并且出愈率低。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的是提供一种最适的沾化冬枣叶片愈伤组织的培养方法，利用该方法 能够高效的获得沾化冬枣叶片愈伤组织，其出愈率高达85%以上。
[0006] 本发明的沾化冬枣叶片愈伤组织的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007] 选择沾化冬枣水培苗20天叶龄，取自叶基部向上第3-4叶作为外植体，消毒后，接 种于诱导培养基上，然后置于温度28土 1°C，暗培养或弱光培养，得到冬枣叶片愈伤组织；
[0008] 所述的诱导培养基，每升含有TDZ(苯基噻二唑基脲）1~1. 5mg、麦芽糖20g、琼脂 l〇g，余量为3/4MS培养基，pH5. 8。
[0009] 优选，所述的诱导培养基，每升含有TDZ1.5mg、麦芽糖20g、琼脂10g，余量为 3/4MS培养基，pH5. 8,然后置于温度28± 1°C，暗培养，得到冬枣叶片愈伤组织。
[0010] 所述的消毒为将外植体用无菌水浸泡lOmin，于超净工作台内用体积分数70%的 酒精进行表面消毒30-60S，无菌水冲洗2-3次，再用体积分数20 %次氯酸钠溶液进行消毒 5min，无菌水冲洗3-5次。
[0011] 优选，所述的弱光培养是在5001UX光照下进行培养。
[0012] MS培养基为国际通用的培养基，其成份和配置方法见MurashigeT,Skoog F(1962)(Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassaywithtobaccotissue cultures.PhysiolPlant15:473 - 497)。3/4MS培养基是指将MS培养基中大量元素用量 为原来的3/4,其余成份不变。
[0013] 按照本发明的方法能够高效的获得沾化冬枣叶片愈伤组织，其出愈率高达85%以 上，并且无褐变和玻璃化等问题，从而为获得组培苗，实现优良株系的无性快繁，建立一个 高效稳定的叶片再生体系，同时也为基因工程操作提供优良的实验材料和遗传转化体系的 建立奠定基础。
【附图说明】：
[0014] 图1是不同光照条件下冬枣叶片愈伤组织。A、外植体在强光条件下培养14d后愈 伤组织的生长情况。B、外植体在弱光条件下培养14d后愈伤组织的生长情况。C、外植体在 黑暗条件下培养14d后愈伤组织的生长情况。
[0015] 图2是第8组冬枣叶片愈伤组织。外植体在3/4MS+1. 5mg/LTDZ+2%麦芽糖+1 % 琼脂，PH调为5. 8,弱光培养14天后愈伤组织生长情况。
[0016] 图3是愈伤组织的增殖生芽。外植体在3/4MS+1. 5mg/LTDZ+2%麦芽糖+1 %琼脂， PH调为5. 8,黑暗培养14天后转入光下培养，诱导出不定芽。
【具体实施方式】：
[0017] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0018] 实施例1:
[0019] 第一章材料与方法
[0020] 1. 1材料与仪器
[0021] LL1实验材料和生长条件
[0022] 剪取山东省沾化县优良冬枣品种-沾化冬枣的一年生休眠树枝，将休眠树枝浸泡 在蒸馏水，并放置在28°C下，冷白色荧光灯照明，保持14h/10h的（光/暗）的温室培养箱 中培养，5-10d内使其长出幼叶。取幼叶作为外植体，进行愈伤组织的诱导。
[0023] 1. 1. 2 仪器
[0024]YT-CJ-2ND型超净工作台（北京亚泰克隆实验科技开发中心）
[0025] G154D型自动全高压灭菌锅（rybioscientific)
[0026]B⑶-272WBCS海尔冷冻冷藏冰箱（青岛海尔股份有限公司）
[0027] FA1004N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）
[0028] SL502电子天平（上海民侨精密科技仪器有限公司）
[0029] GBC-1000光照植物生长箱（宁波江南仪器厂）
[0030] 可调万用电炉（龙口市电炉制造厂）
[0031] 1.1. 3实验用具
[0032] 剪刀、研钵、镊子、解剖针、移液管、量筒、移液枪、容量瓶、试剂瓶、烧杯、玻璃棒、滤 纸片、牛皮纸等。
[0033] 1. 1. 4 培养基
[0034] 本实验选取MS培养基、WPM培养基、3/4MS培养基作为实验培养基。
[0035] 1. 1. 5激素类母液的配制
[0036] (1)lg/L2, 4-D的配制
[0037] 称取0.以的2,4-0粉末，用70%酒精溶解，然后用1001^蒸馏水定容，浓度均为 lg/L的母液，4°C保存备用。每次使用取lmL稀释至1L。
[0038] (2)lg/L6-BA的配制
[0039] 称取0.lg的6-BA粉末，用70%酒精溶解，然后用100mL蒸馏水定容，浓度均为lg/ L的母液，4°C保存备用。每次使用取lmL稀释至1L。
[0040] (3)lg/LTDZ的配制
[0041] 称取0.lg的TDZ粉末，用70%酒精溶解，然后用100mL蒸馏水定容，浓度均为lg/ L的母液，4°C保存备用。每次使用取lmL稀释至1L。
[0042] 1. 1. 6缓冲液的配制
[0043] (1)lmol/L盐酸溶液配制
[0044] 用滴定管量取密度为1. 19g/mL的浓盐酸8. 25mL，加蒸馏水至100mL
[0045] (2)lmol/L氢氧化钠溶液配制
[0046] 用托盘天平称出4g氢氧化钠固体，加蒸馏水至100mL
[0047] 1. 2实验方法
[0048] 1. 2. 1材料的消毒
[0049] 取步骤1. 1. 1中的生长健壮且全部展开的冬枣叶片用无菌水浸泡10min，于超净 工作台内用70%的酒精进行表面消毒30-60s，无菌水冲洗2-3次，再用20%次氯酸钠溶液 进行消毒5min，无菌水冲洗3-5次。
[0050] 1. 2. 2影响冬枣愈伤组织因素的研究
[0051] 1. 2. 2. 1外植体特性对愈伤组织诱导的影响<