最高，可达 90. 00%，愈伤组织生长量最好，颜色和质地最佳（图2)。分析得出此培养基为：3/4MS+TDZ 1. 5mg/L+麦芽糖2% +琼脂1%，PH调为5. 8,置于温度28±1°C的温室培养箱中弱光培养14d。求出每个组合出愈率的平均值，分析同时得出最佳组合为：3/4MS+TDZ1.5mg/L+麦芽 糖2% +琼脂1%，pH5. 8,温度28±1°C，黑暗条件培养。四种因素对冬枣叶片愈伤组织影 响的主次顺序为B>D>C>A，即激素TDZ的影响最大，光照条件次之，碳源麦芽糖再次，培养基 3/4MS最小。
[0095] 2. 4优化冬枣叶片愈伤组织诱导条件
[0096] 根据正交实验得出的最优组合：3/4MS+TDZ1. 5mg/L+麦芽糖2%+琼脂1%，黑 暗条件培养，设置TDZ浓度lmg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2. 5mg/L四个梯度处理，pH5.8,温度 28±1°C，暗培养14天，具体方法是：
[0097] 将20天叶龄，取自叶基部向上第3-4叶作为外植体，用无菌水浸泡lOmin，于超净 工作台内用70%的酒精进行表面消毒30-60s，无菌水冲洗2-3次，再用20%次氯酸钠溶液 进行消毒5min，无菌水冲洗3-5次，然后将消毒后的外植体用经高压蒸汽灭菌的手术刀将 材料进行切割，将切割好的材料转接到锥形瓶，轻轻插入或放在培养基的表面。锥形瓶中的 培养基分别为：
[0098]A、3/4MS+TDZlmg/L+麦芽糖 2% + 琼脂l%，pH5.8。即每升含有TDZlmg、麦芽糖 20g、琼脂10g、余量为3/4MS培养基，配制方法是将TDZlmg、麦芽糖20g、琼脂10g溶解于 1L3/4MS培养基中，灭菌备用，以下培养基按照此方法配制。
[0099]B、3/4MS+TDZ1. 5mg/L+ 麦芽糖 2% + 琼脂1%，pH5. 8。
[0100] C、3/4MS+TDZ 2. 0mg/L+麦芽糖 2 % + 琼脂 1 %，pH5. 8。
[0101]D、3/4MS+TDZ2. 5mg/L+麦芽糖 2%+ 琼脂1%，pH5. 8。
[0102] 每个锥形瓶中接种4-5个，保证其有充分的空间生长。然后置于温度28±1°C，暗 培养14d，愈伤组织无褐变和玻璃化等问题。统计愈伤组织诱导情况如表2. 3
[0103] 表2. 3冬枣叶片愈伤组织优化组合
[0104]
[0105]
[0106] 注：?以上外植体材料均接种于3/4MS培养基麦芽糖2% +琼脂1%，pH调为5. 8 的培养基上，黑暗培养14d后统计愈伤组织的增殖
[0107] 由表2. 3可知，TDZ为1.5mg/L时出愈率最高达到92. 00%，愈伤组织生长量最 大，颜色和质地最佳，验证了正交实验中得出的最优组合。当TDZ浓度为2mg/L时出愈率为 84. 00%，当浓度增加至2. 5mg/L时出愈率降为78. 00%，因此可以看出随着TDZ浓度增加， 冬枣叶片出愈率不断提高；当达到一定值后，出愈率随着TDZ浓度的增加反而降低，TDZ起 抑制作用。继续使用3/4MS+TDZ1. 5mg/L+麦芽糖2 % +琼脂1 %，pH5. 8,温度28 ± 1°C，光 照下培养，得到不定芽（见图3)。
[0108] 外植体方面，以培养20天左右的自基部向上第3-4片幼嫩叶片作为材料，可以有 效提高愈伤组织诱导率。研究发现，以冬枣叶片作为外植体进行愈伤组织诱导，形成的愈伤 组织相对有些致密，出愈率明显要高；而用顶芽、茎段作为外植体出愈率相对较低，愈伤组 织疏松、膨胀且易行成水渍状。这些结果说明，与茎段相比，以叶片为外植体时，愈伤组织的 诱导和生长情况要好。
[0109] 植物激素对愈伤组织的诱导具有重要的调控作用。TDZ是诱导冬枣叶片愈伤组织 的重要激素。研究表明，随着TDZ浓度的提高，冬枣叶片对愈伤组织的诱导能力逐渐增强， 但超过一定浓度时，反而对愈伤组织的诱导起抑制作用。实验结果显示，冬枣叶片愈伤组织 诱导最适的TDZ浓度为1. 5mg/L，这时冬率叶片脱分化的能力最强，细胞分裂最为旺盛。同 时，研究还发现，2, 4-D可以有效的诱导冬枣叶片形成愈伤织，如果用2, 4-D代替TDZ，也能 使冬枣叶片诱导出愈伤组织，但诱导率不如TDZ高。这表明，不同种类的植物，同一种植物 不同器官对不同类型的生长激素或细胞分裂素敏感程度是不一致的，因此具有一定的选择 性。由于上述原因，最终确定TDZ为1. 5mg/L时，冬枣叶片的出愈率最高而且愈伤组织生长 状况最好。
[0110] 此外，在实验中，培养基中加入的糖类最好是麦芽糖，而加入蔗糖和葡萄糖的效果 并不太理想。原因可能有多个方面，可能是不同的植物对不同的糖类利用的能力不同，也可 能是麦芽糖更有利于维持拟叶片细胞的渗透压，从而有利于细胞的生长和分裂。
[0111] 而在实验的过程中，发现用三角瓶培养外植体时，愈伤组织的生长状况比较好，并 且出愈率高，很可能是因为与培养皿相比，三角瓶的通气效果更好，有利于提高培养基中〇 2 的含量；另一方面，也可能是由于三角瓶的保湿能力要强于培养皿，有利于维持培养基中水 分的含量。由于这些原因，三角瓶中的外植体诱导愈伤的效果要好于培养皿。
[0112] 冬枣作为滨州地区的特有果树树种，具有巨大的经济价值和开发潜力。虽然在微 观代谢及其分子机制的研究和其扩繁、育种、脱毒等众多领域依然存在不少的理论和技术 难题，但无疑，对冬枣的叶片外植体进行组织培养，得其脱毒组培苗定然是解决上述诸多问 题的有效方法和途径。相信随着冬枣叶片愈伤组织体外诱导、增殖及分化技术和培养体系 的改进和完善，辅之以基因工程及细胞工程等现代生物学手段，我们定能攻克一个个理论 及技术难题，充分发掘及利用冬枣的种质潜力，从而创造巨大的经济及社会价值！这对于 今后植物细胞的遗传转化，相关基因功能的研究，植物性状的改良，细胞的大规模培养以及 次生代谢产物的生产都具有相当重要的价值和意义。
【主权项】
1. 一种沾化冬枣叶片愈伤组织的培养方法，其特征在于，包括以下步骤： 选择沾化冬枣水培苗20天叶龄，取自叶基部向上第3-4叶作为外植体，消毒后，接种于 诱导培养基上，然后置于温度28 土rc，暗培养或弱光培养，得到冬枣叶片愈伤组织； 所述的诱导培养基，每升含有TDZI. 0~I. 5mg、麦芽糖20g、琼脂10g，余量为3/4MS培 养基，pH5. 8。2. 根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述的诱导培养基，每升含有IDZ I. 5mg、麦芽糖20g、琼脂10g，余量为3/4MS培养基，pH5. 8,然后置于温度28± 1°C，暗培养， 得到冬枣叶片愈伤组织。3. 根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述的消毒为将外植体用无菌水浸 泡lOmin，于超净工作台内用体积分数70%的酒精进行表面消毒30-60S，无菌水冲洗2-3 次，再用体积分数20%次氯酸钠溶液进行消毒5min，无菌水冲洗3-5次。4. 根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述的弱光培养是在5001UX光照下 进行培养。
【专利摘要】本发明公开了一种沾化冬枣叶片愈伤组织的培养方法。选择沾化冬枣20天叶龄，取自叶基部向上第3-4叶作为外植体，消毒后，接种于诱导培养基上，然后置于温度28±1℃，暗培养或弱光培养，得到冬枣叶片愈伤组织；所述的诱导培养基，每升含有TDZ？1～1.5mg、麦芽糖20g、琼脂10g，余量为3/4MS培养基，pH5.8。按照本发明的方法能够高效的获得沾化冬枣叶片愈伤组织，其出愈率高达85％以上，并且无褐变和玻璃化等问题，从而为获得组培苗，实现优良株系的无性快繁，建立一个高效稳定的叶片再生体系，同时也为基因工程操作提供优良的实验材料和遗传转化体系的建立奠定基础。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105165613
【申请号】
【发明人】刘雪红, 姚志刚, 刘京涛, 王宝琴
【申请人】滨州学院
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月24日