数据统计方法:加药后24h开始，每组每天均匀抽取150 μ L培养液(平均含原头节约80-100个)，用0.1 %伊红染色15min，倒置显微镜下观察原头节的活力。活的原头节拒染、不着色，且有活动性；死亡或活力差的原头节红染着色，伴有结构破坏。计算每组每天平均死亡率，连续观察9d。每隔3d换液一次(每组体系和浓度同第一次加药时)，实验独立重复3次取平均值，并绘制活力曲线图。
[0030]实验2:NaAs02作用后原头节表面超微结构的变化
[0031]在测活力的同时，随机取相对应的原头节做扫描电镜，观察原头节超微结构的变化。PBS洗涤3次，每次5min;置4%戊二醛固定24h。将原头节放入浓度为50%、70%、80%、90%、100%的酒精内逐级梯度脱水，脱水时间分别为5min、10min、30min、lh至过夜，临界点干燥，真空喷金L00A，然后置LE01430VP扫描电子显微镜下观察原头节表面超微结构变化。
[0032]实验3:NaAs02对原头节内Caspase-3酶活性的影响
[0033]取他4如2作用24h后的各组细粒棘球蝴原头节，PBS清洗3次后，加液氮研磨，按试剂盒说明，每3mg头节中加入100 μ I裂解液，然后用细胞超声粉碎仪粉碎，在冰浴中放置10min，4°C、1600g离心15min后，吸取上清液。用Bradford蛋白浓度测定法测定蛋白浓度，将各组所提蛋白的浓度配平。按说明书反应体系加入酶标板，并设空白组，37°C恒温孵育箱孵育，用酶标仪检测吸光度(A4ffi值)。用样品中活化的caspase-3催化试剂中无色的四肽化合物Ac-DEVD-pNA产生黄色的对硝基苯胺pNA，根据标准曲线和样品的A405值，计算样品中生成的PNA浓度，由此推测caspase-3的活性。将实验独立重复3次。
[0034]实验结果:
[0035]参考图1，为NaAsO2体外培养细粒棘球蝴原头节的形态变化，0.1%伊红染色，倒置显微镜下观察，NaAsO2作用后的原头节多呈外翻型，原头节顶突上的小钩排列紊乱，部分脱落，吸盘突起，变形，活动性减弱或死亡。随着~&4如2作用时间的延长，对细粒棘球蝴原头节的杀伤作用越明显，光镜下可见被红染的原头节数量增多，虫体团缩、体积变小，边缘不规整，钙颗粒明显减少。而空白对照组的原头节拒染不着色，顶突凸出或凹入，活动性好(图1)。
[0036]参考图2，为他4802体外对细粒棘球蝴原头节的杀伤作用。不同浓度NaAsO2 (4 μ mol/L、8 μ mol/L、12 μ mol/L、16 μ mol/L、20 μ mol/L)体外培养 9d 的细粒棘球蝴原头节活力测定结果见图2，显示不同浓度NaAsO2对体外细粒棘球蝴原头节均有抑制作用。其中20 μ mol/LNaAs02作用6d原头节死亡率达100%。16 μ mol/L作用6d原头节死亡率为16.76%。从活力曲线图中可以看出，随着药物浓度的增加和用药时间的延长，原头节的抑制率增加，此作用具有剂量依赖性和时间依赖性。各实验组原头节死亡率与对照组相比差异均有统计学意义(P < 0.05)。
[0037]同时，申请人在扫描电子显微镜(SEM)下观察了 NaAsO2作用后的原头节表面超微结构变化，观察显示空白对照组原头节表面光滑，多呈内陷型，头节呈球形或椭圆形，顶突完整，微毛清晰可见；用8 μ mol/L NaAsO^t用细粒棘球蝴原头节3d后，在扫描电子显微镜下观察发现，原头节呈外翻型，体部轻微塌陷，顶突轻微变形，微毛排列较规整，未见明显脱落。16 μ mol/L NaAsO#用细粒棘球蝴原头节3d后，体表面出现指状突起，吸盘变形、凹陷，头钩缺损，顶突破坏，微毛排列紊乱或消失(图3)。
[0038]此外，采用Caspase-3试剂盒检测NaAsOJt体外细粒棘球蝴原头节内Caspase-3酶活性的影响见图4，他六802作用24h后，各组原头节内Caspase-3活性表达均增强(P
<0.05)，且随着作用浓度增高，Caspase-3活性表达也逐渐增强，20 μΜ组作用最强(P
<0.05) ο
[0039]综上可以看到，不同浓度NaAsO2体外对细粒棘球蝴原头节均有抑制作用，浓度为20 ymol/L的NaAs02对细粒棘球蝴原头节杀伤作用最明显，且随着时间的延长，抑制作用显著增加(P < 0.05)。在证实NaAsOJi原头节有抑制作用的基础上，探索不同浓度的NaAsOJt细粒棘球蝴原头节的形态学影响。研究结果显示，NaAsO2作用后，可导致体外细粒棘球蝴原头节的形态发生不同程度的改变。内陷型和外翻型原头节是虫体存在的不同形式。当条件适宜时，原头节顶突内凹，可保护头钩、吸盘、微毛不受损害；当加入~&六802后，光镜下可见外翻型的原头节增多，小沟排列紊乱，吸盘变形。正常培养的细粒棘球蝴原头节生发层的微毛发育良好，数量多，附着并延伸入角质层内，可增加生发层与角质层的接触面积，有利于营养物质的吸收，在棘球蝴无血液供应的情况下仍可较快生长并不断形成育囊。不同浓度NaAsO2作用后的细粒棘球蝴原头节，在扫描电镜下观察，微毛出现不同程度的缺损，体表出现指状突起，顶突破坏严重，使原头节的生长受到抑制而死亡。
[0040]总之，~&4如2体外对细粒棘球蝴原头节有杀伤作用。并且，不同浓度NaAsO2作用细粒棘球蝴原头节后，可使原头节内Caspase-3酶活性增强，显示细胞凋亡参与了 NaAsO2抑制细粒棘球蝴原头节生长的过程。
【主权项】
1.亚砷酸钠在制备治疗细粒棘球蝴病药物中的应用。2.根据权利要求1的应用，其特征在于亚砷酸钠的浓度不低于8ymol/L。3.根据权利要求2的应用，其特征在于亚砷酸钠的浓度为16-20ymol/L。4.亚砷酸钠在制备治疗囊性肝包虫病药物中的应用。5.亚砷酸钠作为细粒棘球蝴原头节抑制剂的应用。6.根据权利要求5的应用，其特征在于亚砷酸钠的浓度不低于8ymol/Lo7.根据权利要求6的应用，其特征在于亚砷酸钠的浓度为16-20ymol/L。
【专利摘要】本发明公开了亚砷酸钠在制备治疗细粒棘球蚴病药物中的应用，用亚砷酸钠杀灭细粒棘球蚴病的病原-细粒棘球蚴绦虫，具有显著的抑制和杀灭细粒棘球蚴原头节的效果，从而实现细粒棘球蚴病的治疗。
【IPC分类】A61P33/02, A61K33/36, A61P33/10
【公开号】CN105168248
【申请号】
【发明人】吕海龙, 姜玉峰, 赵东明
【申请人】吕海龙
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年7月27日