皮皂苷基质佐剂 (ASMA)，用生理盐水倍比稀释制成皂苷浓度0. 98~1000yg/ml的稀释液。在96孔微量板中， 每孔加入05%红细胞悬液100y1及不同浓度的样品稀释液100y1，每个浓度重复3孔， 重复3次。另设生理盐水及蒸馏水分别作为最小和最大的溶血性对照。将微量板置于微量 震荡器上，混匀，37°C孵育30min，1800r/min离心5min，取各孔中上清液100yl，用酶标 仪在405nm处读取0D值。各组的吸收值减去生理盐水对照组的吸收值表示溶血性，计算引 起50%溶血的浓度（HDJ。
[0047] 实验结果：合欢皮皂苷基质佐剂（ASMA)对兔红细胞的溶血性结果见表4。从表4 可见，合欢皮皂苷基质佐剂（ASMA)对0. 5%兔红细胞悬液的HD5。值均显著高于合欢皮皂苷 (AJS)，说明AJS制成ASMA，可显著降低溶血性，尤其是脂类混合物与合欢皮皂苷1:5制备的 ASMA，其HD5。值大于500yg/ml，溶血性降低100倍以上。
[0048] 表4欢皮皂苷基席佑剂（ASMA)对龟红细朐的滚rfn忡
实施例5:欢皮皂苷基质佐剂（ASMA)对卵清白蛋白（0VA)的佐剂作用 实验方法：清洁级ICR小鼠35只，随机分成7组，每组5只。PBS对照组：每只注射磷 酸缓冲液（PBS) 0. 2ml;0VA低剂量免疫组：每只注射含0VA2. 5yg的PBS0. 2ml;0VA 高剂量免疫组：每只注射含OVA25yg的PBS0. 2ml;合欢皮皂苷（AJS)对照组：每只注 射含1〇〇ygAJS和2. 5yg0VA的PBS0. 2ml;合欢皮皂苷基质佐剂（ASMA):每只注射含 2. 5、5、10yg皂苷的ASMA和2.5yg0VA的PBS0.2ml。各组皮下注射免疫2次，第一次 免疫和第二次免疫间隔14天。动物分组及免疫程序详见表5。二免后14天，采血，分离血 清，采用ELISA方法检测血清中0VA特异性抗体效价。
[0049] 表5分组及给药处理
实验结果：合欢皮皂苷基质佐剂（ASMA)对卵清蛋白（0VA)免疫小鼠血清抗原特异性IgG抗体及其亚类效价的影响见图2~5。从图2~5可见，⑴与0VA低剂量（2.5yg) 单独免疫组比较，合欢皮皂苷基质佐剂（ASMA)可显著提高免疫小鼠血清中OVA特异性IgG、 IgGl、IgG2a和IgG2b抗体效价，说明ASMA对模式抗原OVA具有显著的佐剂作用，可诱导 免疫小鼠对0VA产生平衡的Thl/Th2免疫应答反应；⑵0VA低剂量（2. 5yg)联合10yg ASMA免疫小鼠血清中IgG、IgGl、IgG2a和IgG2b抗体效价显著高于OVA高剂量（25yg)单 独免疫组，说明ASMA可显著降低0VA抗原用量；(3) 0VA低剂量（2.5yg)联合10ygASMA 与联合100ygAJS免疫小鼠血清中IgG、IgGl、IgG2a和IgG2b抗体效价无显著差异，说明 ASM可降低AJS佐剂使用剂量。
[0050] 实施例6:合欢皮皂苷基质佐剂（ASMA)对猪口蹄疫灭活疫苗（FMDV)的佐剂作用 实验方法：清洁级ICR小鼠54,随机分成9组，每组6只。PBS对照组：每只注射磷酸缓 冲液（PBS) 0. 25ml;FMDV单独免疫组：每只注射含0. 1头份FMDV的PBS0. 25ml;Quil A对照组：每只注射含25ygQuilA和0.1头份的FMDV的PBS0.25ml;合欢皮皂苷（AJS) 对照组：每只注射含50ygAJS和0. 1头份的FMDV的PBS0. 25ml;合欢皮皂苷基质佐剂 (ASMA)试验组：每只注射含皂苷（5、10、25、50yg)和0.1头份FMDV的PBS0.25ml。动物 分组及免疫程序详见表6。分别于第1和15天皮下注射免疫小鼠，二免后14天，采血，分离 血清，进行猪口蹄疫病毒特异性抗体效价检测。
[0051] 表6分组及给药处理
铦呆铦呆：甘欢反皂甘佐刑（ASM)酡者提咼KMUV兜投小鼠皿凊中裙U蹄投病 毒特异性IgG、IgGl、IgG2a和IgG2b抗体滴度（图6~9)。说明合欢皮皂苷基质佐剂（ASMA) 对猪口蹄疫疫苗具有显著的佐剂作用，可同时诱导免疫小鼠对FMDV产生Thl型和Th2型免 疫反应。
[0052] 实施例7:合欢皮皂苷基质佐剂（ASMA)对猪口蹄疫灭活疫苗免疫小鼠迟发性超敏 反应的影响 实验方法：清洁级ICR小鼠40只，随机分成8组，每组5只。PBS对照组：每只注射磷 酸缓冲液（PBS)O. 25ml;猪口蹄疫灭活水相疫苗（FMDV-W)免疫组：每只注射含猪口蹄疫灭 活水相疫苗〇. 1头份的PBS0. 25ml;猪口蹄疫灭活商品疫苗（FMDV-0)免疫组：每只注射含 猪口蹄疫灭活商品疫苗〇. 1头份的PBS0. 25ml;QuilA对照组：每只注射含25ygQuil A和0. 1头份猪口蹄疫灭活水相疫苗的PBS0. 25ml;合欢皮皂苷（AJS)对照组：每只注射 含50yg合欢皮皂苷和0. 1头份猪口蹄疫灭活水相疫苗的PBS0. 25ml;合欢皮皂苷基质 佐剂（ASMA)试验组：每只注射含皂苷（5、10、25、50yg)和0. 1头份猪口蹄疫灭活水相疫 苗的PBS0.25ml。皮下注射致敏5天后，小鼠左后足垫皮下注射猪口蹄疫病毒抗原0.05 ml进行激发，右后足垫皮下注射等体积PBS作为对照。12小时后，用游标卡尺测量后足垫 的厚度（精确到〇. 01mm)，以左、右后足垫厚度差作为肿胀度T)，评定迟发性超敏反应 的强弱。
[0053] 实验结果：合欢皮皂苷基质佐剂（ASMA)、QuilA和合欢皮皂苷（AJS)均能显著促 进免疫小鼠对猪口蹄疫灭活水相疫苗诱导的迟发性超敏反应，而油佐剂对猪口蹄疫灭活水 相疫苗免疫小鼠的迟发性超敏反应无显著影响（图10)。说明合欢皮皂苷基质佐剂（ASMA)、QuilA和合欢皮皂苷（AJS)均能显著诱导猪口蹄疫灭活水相疫苗免疫小鼠T细胞介导的免 疫反应，对猪口蹄疫灭活水相疫苗免疫小鼠细胞免疫应答具有显著的佐剂作用，而油佐剂 对细胞介导的免疫应答反应没有佐剂作用。
[0054]综上所述，本发明的合欢皮皂苷基质佐剂具有显著的佐剂作用，能增强疫苗免疫 机体的细胞免疫和体液免疫反应，诱导产生平衡的Thl型和Th2型免疫应答。合欢皮皂苷 基质佐剂可降低疫苗的抗原剂量，是抗原量有限或造价昂贵疫苗的理想佐剂。与现有技术 中已知的合欢皮皂苷佐剂相比，合欢皮皂苷基质佐剂用量少、溶血性低，安全性好。合欢皮 皂苷基质佐剂与各种抗原均具有良好的亲和性，是一种新型、通用型疫苗佐剂，适用于传统 疫苗及DNA疫苗、重组疫苗和合成肽疫苗等新型疫苗。合欢皮皂苷基质佐剂生产工艺简单， 易于大规模生产。因此，本发明的合欢皮皂苷基质佐剂是一种理想的疫苗佐剂。
【主权项】
1. 一种合欢皮皂苷基质佐剂，其特征在于，该佐剂含有合欢皮皂苷、胆固醇和卵磷脂， 且三者的重量比为5~20:1:1。2. 根据权利要求1所述的合欢皮皂苷基质佐剂，其特征在于，所述的合欢皮皂苷是合 欢皮属植物中的皂苷，它是齐墩果烷型苷元、8~10个单糖分子以及1~4单萜烯酸分子结 合而成的三萜皂苷。3. 根据权利要求1所述的合欢皮皂苷基质佐剂，其特征在于，所述的卵磷脂为磷脂酰 胆碱、大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂。4. 根据权利要求1所述的合欢皮皂苷基质佐剂，其特征在于，所述的佐剂是由300~ 700nm片状和/或链状微粒构成，该片状或链状微粒由粒径10~12nm的正方体和/或球 形颗粒组成。5. 制备权利要求1所述的合欢皮皂苷基质佐剂的方法，其特征在于，包括以下步骤： a. 合欢皮皂苷溶液的配制：将合欢皮皂苷溶解于蒸馏水，制成50mg/ml的溶液，滤过 除菌，获得合欢皮皂苷溶液； b. 胆固醇/卵磷脂溶液的配制：取非离子型表面活性剂，以双蒸水溶解，制成质量浓 度为20%的溶液；再称取卵磷脂和胆固醇，溶于上述溶液中，使每ml溶液含卵磷脂和胆固醇 各10mg，滤过除菌，获得胆固醇/卵磷脂溶液； c. 按合欢皮皂苷、胆固醇和卵磷脂三者重量比5~20:1: 1，取步骤a的合欢皮皂苷溶 液与步骤b的胆固醇/卵磷脂溶液，加入pH6. 2的PBS缓冲液中，混勾，使合欢皮皂苷10~ 40mg/ml、胆固醇2mg/ml和卵磷脂2mg/ml，置于25~50°C恒温水浴1~3h，获得混合 溶液； d. 将上述混合溶液以pH6. 2的PBS缓冲液稀释4倍，获得溶液A，转移至截留分子量 为8000~12000的透析袋中，以pH6. 2的PBS缓冲液透析72h，期间每6h更换一次透析 液，透析完毕后，收集透析袋中的液体，获得合欢皮皂苷佐剂；或采用孔径0.Iym的超滤 膜，用体积为溶液A体积15倍的pH6. 2的PBS缓冲液进行超滤浓缩，待浓缩至体积与溶液 A体积相等时，收集剩余液体，获得合欢皮皂苷基质佐剂。6. 根据权利要求5所述的合欢皮皂苷基质佐剂的制备方法，其特征在于，所述的非离 子型表面活性剂为Mega-IO或辛基葡萄糖苷。7. 权利要求1-4任一项所述的合欢皮皂苷基质佐剂或权利要求5-6任一项所述的方法 获得的合欢皮皂苷基质佐剂在疫苗制剂制备中的用途。8. -种疫苗制剂，其特征在于，包含合欢皮皂苷基质佐剂，所述的合欢皮皂苷基质佐剂 含量为以合欢皮皂苷计〇.Olug~Ig/单剂量。9. 根据权利要求8所述的疫苗制剂，其特征在于，所述的合欢皮皂苷基质佐剂含量为 以合欢皮皂苷计〇. 1~1〇〇ug/单剂量。
【专利摘要】本发明涉及一种新型通用型基质疫苗佐剂及其制备方法和用途。该佐剂为合欢皮皂苷基质佐剂，包含合欢皮皂苷、胆固醇和卵磷脂，三者重量比为5～20∶1∶1，是由粒径10～12？nm的正方体和/或球形颗粒组成的300～700？nm片状和/或链状微粒构成。合欢皮皂苷基质佐剂具有显著的免疫佐剂作用，能增强疫苗免疫机体的细胞免疫和体液免疫反应，诱导产生平衡的Th1型和Th2型免疫应答；且可降低疫苗抗原剂量，是抗原量有限或造价昂贵疫苗的理想佐剂，较合欢皮皂苷用量少，溶血性低，安全性好。合欢皮皂苷基质佐剂与各种抗原均有良好的亲和性，是一种新型、通用型疫苗佐剂。生产工艺简单，易于大规模生产。
【IPC分类】A61K39/39, A61P31/14, A61K39/135, A61P37/04
【公开号】CN105169386
【申请号】
【发明人】孙红祥, 王巧文
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年7月29日