液中沉积14天后，材料表面出现球形粒子。将球形粒子放大后发现，这些粒子是由针状的HA组成，同时通过EDXS能谱分析发现Si含量减少，Ca、P含量(Ca/P?1.65)增加，进一步证明了 HA的形成。这些结果与前面的XRD结果一致。
[0044]2生物学评价:
[0045]2.1.细胞毒性试验:
[0046]将I %的生物活性矿物质材料粉末直接与10 %的DMEM/F12培养液共混，将其加入96孔板中，再将成骨前细胞(MC3T3)以I X 14个/mL接种于96孔板内，DMEM/F12培养液作为对照组，CO2培养箱内分别培养1，6天(d)后，进行MTT试验，加入MTT后加入DMS0，震荡，酶联免疫法测量在570nm波长测定吸光度(Absorbance)，测定结果如图4 (a)所示。结果表明生物活性矿物质材料不具有细胞毒性。在培养Id时，材料的吸光度稍微低于空白样品(约为其92% )，说明生物活性矿物质材料不具有细胞毒性，在培养6d时，材料的吸光度值与空白样品相同，说明生物活性矿物质材料无细胞毒性。
[0047]类似的，将生物活性矿物质材料以5mg/ml的比例浸入含10 %的DMEM/F12培养液中，浸提不同时间后(l，2，3d)离心取上清液，24孔板浸提液作为空白对照组，均保存于4°C条件下，将成骨前细胞(MC3T3)以I X 14个/mL接种于96孔板，CO 2培养箱内培养后，加入不同条件的浸提液，24小时(h)后行MTT实验，加入MTT后加入DMS0，震荡，酶联免疫法测量在570nm波长测定吸光度，测定结果如图4(b)所示。结果表明生物活性矿物质材料不同时间的浸提液与空白样品的吸光度值基本相同，表明生物活性矿物质材料浸提液仍然没有细胞毒性。
[0048]2.2.细胞粘附性试验:
[0049]将生物活性矿物质材料研磨成粉末后，压片(直径13_，厚度2_)。将生物活性矿物质材料片进行灭菌、消毒处理，放入24孔板内，再将成骨前细胞(MC3T3)以IXlOM^/mL接种于24孔板内，培养Id和3d。然后用2.5%的戊二醛在4°C下固定24h，用PBS清洗3次，乙醇梯度脱洗(50%，75%，95%和100% )，经自然干燥后，喷金，进行SEM观察，如图5所示。结果表明，生物玻璃表面成骨细胞附着良好，培养Id时，细胞变长，有丝状伪足出现。培养3d时，细胞开始进一步延展，变大，伪足变得更为明显。这些证明生物活性矿物质材料具有良好的细胞相容性，有利于细胞在生物活性矿物质材料表面附着。
[0050]3降解实验:
[0051]将生物活性矿物质材料片(PSC、45S5和S70C30)放入SBF溶液中测定其pH值变化，结果如图6所示。从图中可以看出，45S5和S70C30(均为已报道产品)的样品pH值在初始的168h均升高，而PSC样品(本课题组新发展产品)的pH值在这段时间内一直保持不变(7.4，生理pH值))，如图6所示。通过前期研究表明，pH值升高不利于细胞的生长，一般对于45S5和S70C30样品的细胞相容性测试，均需将样品放入磷酸盐缓冲溶液中浸泡24h，除去样品表面的一些离子，以防止其杀死细胞。而PSC样品由于其稳定的pH值变化，一般不需要前处理，可直接进行细胞相容性实验，而且通过上面实验结果表明PSC具有很好的细胞相容性，有利于细胞的粘附、增殖及分化。这些结果表明PSC经消毒、灭菌后，可直接应用于体内。
[0052]将生物活性矿物质材料片放入去离子水中(5片/50ml)进行降解实验，在每个间隔时间点完全替换其中的去离子水，取出5片样品，用纸吸去其表面的水分，放入真空干燥器中烘干，称量，取平均值，结果如图7所示。结果表明:材料在6d开始降解，9d降解加快，70天降解能够达到原来的40%，且降解速率变缓。
[0053]生物活性矿物质材料在SBF溶液中进行降解试验，随着材料中离子的释放，在材料表面形成HA。在开始I月会降解为原来的?80%，但在I月后，材料表面完全覆盖成HA，导致其重量变化不大，所以生物活性矿物质材料的降解应以其体内新陈代谢下的降解速率为准。目前报道的45S5生物玻璃其降解主要是通过植入体内考察的，完全降解约需1-2年。
[0054]以上本发明的生物活性矿物质对Hacat及A375细胞增殖的影响
[0055]材料和试剂:
[0056]生物活性矿物质(样本I为不经过模拟体液处理的样品，样本2为经过模拟体液处理的样品)，DMEM/F12培养基，HDMEM培养基，FBS, CCK-8试剂。
[0057]步骤:
[0058]PSC称量，尚温尚压灭囷。
[0059]将PSC浸泡在相应体积的培养基中，质量体积比是I %。37 °C浸泡24小时。
[0060]24小时后浸提液取上清，用0.22 μ m滤头过滤除菌。4°C保存备用。
[0061 ] 各浸提液分别加入10 % FBS0
[0062]按照CCK-8测试步骤进行测试。
[0063]测试结果:
[0064]如图8和图9所示，图8结果显示经过模拟体液处理和未经处理的样本I (PSCl)对Hacat细胞都没有细胞毒性。但对细胞的增殖有明显的促进作用。而图9结果显示经过模拟体液处理和未经处理的样本2 (PSC2)对A375细胞都没有细胞毒性。对A375细胞的增殖有一定的醋精作用，且经过模拟体液处理后的样本2的促进作用更加明显。其中，图8与图9的观察周期和时间，为交叉进行。例如图8是以第2天、第4天、第6天为观察时间，图9是以第I天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天一个完整的周期观察。
[0065]本发明的上述凝胶用于剖腹产、医学美容等床上无痕修复，一般面部美容术后持续使用该凝胶产品3-8个星期绝大多数患者可实现完全无手术痕迹。同时该产品还可用于临床各种溃疡、糜烂修复。
[0066]患者李某，男，58岁，脚部糖尿病溃疡一年，脚面至脚踝处大部分溃烂，持续使用本发明产品36天，溃疡全部结痂，中心部分30%的面积仍易反复，2年后，溃疡全部治愈，颜色恢复正常肤色。
[0067]患者王某，男，37岁，左腿肌腱手术，术后持续使用本发明产品三个月，疤痕全部消失，恢复术前肤色，踝关节功能正常。
[0068]如上述使用本发明产品的试验病历有很多，均存在非常令人满意的效果，无毒副作用，反响非常好。
【主权项】
1.一种用于创伤和溃疡无疤痕修复和细胞再生的生物活性矿物质材料，其特征在于，所述生物活性矿物质材料的化学组成的质量百分比为36% S12,5% Na20,20% Ca0U5%P205、5%医用羧甲基壳聚糖、5%医用透明质酸钠、10% PEG、2%尿囊素、和2%生育酚乙酸酯。2.根据权利要求1所述的生物活性矿物质材料，其特征在于，所述生物活性矿物质材料是通过溶胶-凝胶方法制备成粉体，并用医用甘油融化形成凝胶而成。3.根据权利要求2所述的生物活性矿物质材料，其特征在于，所述生物活性矿物质材料的具体制备方法为:将生物活性矿物质材料的原料Si02、Na2O, CaO、P2O5按比例称重与乙醇在搅拌过程中形成溶胶溶液，经凝胶、陈化、煅烧、粉碎、过筛而制得颗粒度小于10微米的生物活性矿物质材料粉体；在粉体中再加医用羧甲基壳聚糖、医用透明质酸钠、PEG、尿囊素和生育酚乙酸酯，用医用甘油融化形成凝胶。4.根据权利要求1或2所述的生物活性矿物质材料在创伤和溃疡无疤痕修复和细胞再生中的应用，其中，将颗粒尺寸小于10微米的所述生物活性矿物质材料粉体用医用甘油融化形成的凝胶涂覆在伤口处。5.权利要求4所述的生物活性矿物质材料在创伤和溃疡无疤痕修复和细胞再生的应用，其特征在于，该材料适用于治疗软组织溃疡、创伤，如，创伤修复、细胞增殖、口腔溃疡、宫颈糜烂、脂肪液化性伤口、褥疮、窦道、性病溃疡、或痔疮。6.根据权利要求1或2所述的生物活性矿物质材料在抑制黑素瘤中的应用，其中，将颗粒尺寸小于10微米的所述生物活性矿物质材料粉体用医用甘油融化形成的凝胶涂覆在伤口处。
【专利摘要】本发明涉及一种生物活性矿物质材料及其在软组织溃疡及长期糜烂伤口的细胞再生中、以及抑制黑色素瘤的应用。该应用主要通过将颗粒小于10微米的生物活性矿物质材料粉体用医用甘油包裹成凝胶状涂覆在创口处表面实现。所述生物活性矿物质材料粉体化学组成的质量比为36％SiO2，5％Na2O，20％CaO、15％P2O5、5％医用羧甲基壳聚糖、5％医用透明质酸钠、10％PEG、2％尿囊素、和2％生育酚乙酸酯。本发明特别适用于如糖尿病溃疡、口腔溃疡、宫颈糜烂、脂肪液化性伤口、褥疮、窦道、性病溃疡、痔疮，创伤等软组织溃疡的治疗。
【IPC分类】A61L15/44, A61P17/02, A61K33/00, A61K33/08, A61K47/34, A61L15/20, A61L15/18, A61P35/00, A61L15/26, A61L15/28, A61K31/375, A61K31/4166, A61K33/42, A61K47/36
【公开号】CN105169458
【申请号】
【发明人】胡方
【申请人】胡方
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月25日