构建生产或高产目的基因产物重组菌的方法及构建的重组菌与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种构建生产或高产目的基因产物重组菌的 方法及构建的重组菌与应用。
【背景技术】
[0002] 自然界中的动植物、微生物可以合成许多具有结构和功能多样性的有机小分子化 合物。与蛋白质、核酸、脂类等生物大分子相比，它们并不直接参与生物体的生长和发育，但 却具有重要的生物活性及生理功能。人们把这样的活性小分子化合物称为天然产物。许多 天然产物在医学上或工农业生产中有重要用途。
[0003] 传统的开发和挖掘活性天然产物方法，如高通量筛选和OSMAC("one strain many compounds"）手段都已很难发现新颖药物先导化合物（Zhu H，Sandiford SK, van Wezel GP (2014)Triggers and cues that activate antibiotic production by actinomycetes. J Ind Microbiol Biotechnol 41 (2):371 - 386.)，与已发掘的化合物分子数相比，已测序 的微生物基因组中，仍然存在大量的次级代谢基因未表达，而且这些相关基因在基因组中 成簇存在，称为基因簇。这些未表达的基因簇称为"沉默"或"潜在"基因簇，这些沉默基 因簇提示着我们，微生物中仍然蕴含着一个等待开发的天然产物宝库（Rebets Y，Br^Z Ej Tokovenko Bj Luzhetskyy A(2014)Actinomycetes biosynthetic potential:How to bridge in silico and in vivo ? J Ind Microbiol Biotechnol.41 (2):387 - 402.)〇
[0004] 造成这些基因簇沉默的重要原因之一是：在微生物的基因组中，蕴含大量转 录和翻译的调控基因，这些调控基因构成了一个负调控网络，抑制了基因簇的表达。而 如何解除这些严密的调控，或利用调控激活沉默基因簇，正是挖掘活性天然产物所遇 到的难点。为了激活这些沉默的基因簇，获得活性的天然产物，研究者开发了很多挖 掘的方法，大致分为针对菌体细胞的生理刺激和合成或遗传生物学的操作，以及两者 兼备(Aigle Bj Corre C(2012)Waking up Streptomyces secondary metabolism by constitutive expression of activators or genetic disruption of repressors. Methods Enzymol. 517:343 - 366. Luo Yjet al. (2013)Activation and characterization of a cryptic polycyclic tetramate macrolactam biosynthetic gene cluster. Nat Commun. 4(4):2894. Zhuo Y，et al. (2010)Reverse biological engineering of hrdB to enhance the production of avermectins in an industrial strain of Streptomyces avermitilis. Proc Natl Acad Sci USA. 107(25) :11250 - 11254·)。合成或遗传生物学的 操作则针对目的基因采用外源表达元件绕开菌体自身负调控网络，促使目的基因表达。而 使用外源表达元件过表达目的基因的工作中，表达元件之间会产生部件交互干扰，特别在 强表达元件之间，或各元件在转录和翻译过程中，均会出现一些干扰，从而使得过表达的 效果大大降低（Lou C，Stanton B，Chen Y_J，Munsky B，Voigt CA(2012)Ribozyme_based insulator parts buffer synthetic circuits from genetic context. Nat Biotechnol 30(11) :1137 - 1142.) ο
[0005] 链霉菌属革兰氏阳性放线菌，在系统生物学上归于链霉菌属（Str印tomyces)， 具有复杂生活周期和次生代谢途径。该属的许多成员都能产生丰富的具有生物活性的 次级代谢产物。目前已知的上万种抗生素中，有70%以上是由链霉菌产生的。除此之 外，它还能产生免疫抑制剂、抗肿瘤剂、杀虫剂和多种胞外水解酶，如纤维素酶、淀粉酶、果 胶酶和蛋白酶等。（Zhu F，et al. (2011)Clustered patterns of species origins of nature-derived drugs and clues for future bioprospecting. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (31) : 12943 - 12948.)这些特性提示我们，链霉菌具有这些类别天然产物的前体 代谢途径，是天然产物异源合成的理想宿主之一。目前某些链霉菌已经完成全基因组测 序并建立起了标准的遗传操作规程，为天然产物的异源合成提供了便利，如阿维链霉菌 Streptomyces avermitilis。
[0006] 番茄红素是一类具有抗氧化能力的二萜化合物，广泛应用于医药保健、食品 化工和化妆品产业中（Namitha KK, Negi PS(2010)Chemistry and biotechnology of carotenoids. Crit Rev Food Sci 50:728-760)，商用的番前红素多以番前或番前产 物为原料，采用多级化学合成和化学萃取获得（Lin Y，Jain R，Yan Y(2014)Microbial production of antioxidant food ingredients via metabolic engineering. Curr Opin Biotechnol. 26:71-78)。但是，原料受季节和地缘的影响，化学合成的复杂度、有机废物的 污染都限制了番茄红素的工业应用。而近年来，随着代谢工程和合成生物学的兴起，研究者 们希望利用微生物来发酵生产番茄红素。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种构建生产或高产目的基因产物重组菌的方法及构建的重组菌 与应用，本发明的重组菌替换了目的基因原有调控元件，并且消除了启动子与RBS等表达 元件之间的干扰，提高了目的基因的表达，从而增加了目的基因产物的产量。
[0008] 本发明的一个方面，提供一种构建生产或高产目的基因产物重组菌的方法，包括 如下步骤：
[0009] (1)选择出发菌株和目的基因；
[0010] (2)构建包含所述目的基因的表达载体；
[0011] (3)在步骤（2)中所述目的基因的核糖体结合位点之前插入有绝缘子功能的序 列，并且在所述有绝缘子功能的序列之前插入有异源或人工合成启动子序列；
[0012] (4)将步骤（3)中构建的表达载体导入出发菌。
[0013] 以上所述的构建方法中，所述出发菌包括野生型或经基因工程改造的原核微生 物；优选地，包括大肠杆菌、链霉菌和放线菌。
[0014] 以上所述的构建方法中，所述链霉菌包括野生型链霉菌或经修饰、突变、诱变或基 因重组获得的链霉菌；优选地，所述链霉菌为Streptomyces avermitilis MA4680。
[0015] 以上所述的构建方法中，所述目的基因包括原核生物基因组编码的基因，真核生 物cDNA中编码的基因。
[0016] 以上所述的构建方法中，所述原核生物基因组编码的基因包括在链霉菌中编 码的基因；优选地，包括 Geranylgeranyl diphosphate synthase (crtE)、Phytoene desaturase (crtl)和 Phytoene synthase (crtB)基因。
[0017] 以上所述的构建方法中，所述异源或人工合成启动子包括经修饰改造的原启动子 序列、所述出发菌中其他基因启动子序列、异源菌株中的启动子序列或经人工合成的启动 子序列；优选地，包括 SP12、SP18、SP23、SP26、kasOp*、SP43 或 SP44 启动子。
[0018] 以上所述的构建方法中，所述有绝缘子功能的序列是在转录形成RNA后具有5'端 剪切的核酶功能，并通过切除所述有绝缘子功能的序列前的序列，减弱核糖体结合序列所 受干扰并且转录后形成RNA发卡结构的序列；优选地，包括LtsvJ、SCCJ Rib〇J、SarJ、PlmJ、 VtmoJ、ChmJ、ScvmJ、SltJ 或 PlmvJ 序列。
[0019] 以上所述的构建方法中，步骤（2)中采用整合型质粒载体表达所述目的基因。
[0020] 以上所述的构建方法中，所述整合型表达载体为大肠杆菌-链霉菌穿梭载体 PIJ8660。
[0021] 本发明的另一个方面，提供一种高产目的基因的重组菌，所述重组菌中具有包含 目的基因的表达载体，所述目的基因的核糖体结合位点之前插入有绝缘子功能的序列，并 且在所述有绝缘子功能的序列之前插入有异源或人工合成启动子。
[0022] 以上所述的重组菌，所述目的基因为包含crtE基因、crtl基因和crtB基因的基 因簇。
[0023] 以上所述的重组菌，所述异源或人工合成启动子包括经修饰改造的原启动子序 列、出发菌株中其他基因启动子序列、异源菌株中的启动子序列或经人工合成的启动子序 列；优选地，包括 SP12、SP18、SP23、SP26、kasOp*、SP43 或 SP44 启动子。
[0024] 以上所述的重组菌，所述有绝缘子功能的序列是在转录形成RNA后具有5'端剪 切的核酶功能，并通过切除所述有绝缘子功能的序列前的序列，减弱核糖体结合序列所受 干扰并且转录后形成RNA发卡结构的序列；优选地，包括LtsvJ、SccJ RiboJ、SarJ、PlmJ、 VtmoJ、ChmJ、ScvmJ、SltJ 或 PlmvJ 序列。
[0025] 以上所述的重组菌，所述包含目的基因的表达为整合型质粒载体表达载体。
[0026] 以上所述的重组菌，所述整合型质粒表达载体为大肠杆菌-链霉菌穿梭载体 PIJ8660。
[0027] 以上所述的重组菌，构建所述重组菌使用的出发菌包括野生型或经基因工程改造 的原核微生物；优选地，包括大肠杆菌、放线菌和链霉菌。
[0028] 以上所述的重组菌，所述链霉菌包括野生型链霉菌或经修饰、突