变、诱变或基因重 组获得的链霉菌；优选地，所述链霉菌为阿维链霉菌Streptomyces avermitilis MA4680。
[0029] 本发明的再一个方面，提供一种发酵生产番茄红素的方法，利用以上任一所述的 重组菌进行发酵。
[0030] 本发明替换了目的基因（番茄红素基因簇）原有调控元件，利用人工合成启动子， 绕开菌体自身严密调控，在启动子区和核糖体结合位点（RBS)区之间加入绝缘元件，该绝 缘元件在转录后形成RNA后具有5'端剪切的核酶功能，通过切除该序列前的序列，减弱核 糖体结合序列所受干扰，序列转录后形成RNA发卡结构，更好暴露核糖体结合序列，很好的 消除了启动子与RBS等表达元件之间的干扰，组建可预测的表达系统，使得无法表达的目 的基因或基因簇得到表达，获得对应产物，并通过使用人工合成的强启动子达到高产目的 化合物的效果。
[0031] 在宿主选择上，本发明选择了链霉菌，因其具备大量的次级代谢基因簇，是一种表 达次级代谢产物的优选宿主，而番茄红素的烯烃结构，决定其在微生物发酵生产时嵌入细 胞膜中，而优于常规宿主大肠杆菌和酿酒酵母的是，阿维链霉菌的丝状形态赋予了其充裕 的细胞膜空间，为产物的累积提供更多的空间，通过对阿维链霉菌基因组的分析，发现其基 因组中编码了番茄红素的合成基因簇。但是这一基因簇是沉默存在的，申请人通过采用上 述激活方法，利用人工启动元件和绝缘子元件，成功激活这一基因簇，并获得了高产量的番 茄红素。
[0032] 根据本发明的实验证明，以阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis MA46 80)为 出发菌株，得到的重组阿维链霉菌SAV-SP44-Rib〇J-crtEIB，在摇瓶培养120小时后，番茄 红素素产量可达到82. 02±8. 69mg/g DCW，是已报道的大肠杆菌产量（50. 6mg/g DCW)(Tao S，Miao L, Li Q, et al. (2014)Production of lycopene by metabolically-engineered Escherichia coli. Bi otech Letters. 36 (7) :1515-1522.)的 I. 62 倍。
[0033] 本发明所构建的重组阿维链霉菌基因工程菌可直接用于番茄红素的发酵生产，提 高番前红素的产量，降低生产成本。
【附图说明】
[0034] 图1为本发明实施例提供的高产番茄红素的重组菌的含有番茄红素基因簇的表 达载体结构示意图；
[0035] 图2为本发明实施例提供的pIJ8660-crtEIB质粒的结构示意图；
[0036] 图3为本发明实施例提供的pIJ8660-Rib〇J-crtEIB质粒的结构示意图；
[0037] 图4为本发明实施例提供的含不同启动子和绝缘元件的阿维链霉菌重组菌株中 过表达番茄红素的产量图。
[0038] 其中，图2和图3中aac (3) IV为安普霉素抗性基因；oriT为来自质粒RK2的复制 起始区；int为菌体<i>C31编码的整合酶；attP为int整合酶对应的附着序列；tfd为· 菌体fd的转录终止子Tfd ;to为·菌体λ的转录终止子。
【具体实施方式】
[0039] 以下结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】进行更加详细的说明，以便能 够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的【具体实施方式】和实 施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。
[0040] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0041] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0042] 实施例 1、pIJ866〇-Promoters-RiboJ_crtEIB 表达质粒载体的构建
[0043] 1、crtE、crtl 和 crtB 基因的克隆
[0044] 因质粒在后期的多片段插入需要，需在crtl和crtB基因内部同义突变三 个BsaI限制性酶切位点序列，设计引物突变这三个位点，并用于扩增位于阿维链霉菌 Streptomyces avermitilis MA4680(ATCC31267),可通过ATCC获得。染色体上的 crtE(SEQ ID NO: 1)[ΒΑ000030· 3 (1289024 …1290265)]、crtl (SEQ ID NO :2)[ΒΑ000030· 3 (1290262 … 1291803)]和 crtB (SEQ ID NO :3)[ΒΑ000030· 3 (1291800…1292828)]基因。
[0045] 使用引物crtF(SEQ ID NO :4)与引物crtMlR(SEQ ID NO :5)扩增片段E，使用引 物 crtMlF(SEQ ID N0:6)与引物 crtM2R(SEQ ID N0:7)扩增片段 I，使用引物 crtM2F(SEQ ID N0:8)与引物 crtM3R(SEQ ID N0:9)扩增片段 B1，使用引物 crtM3F(SEQ ID N0:10) 与引物crtR(SEQ ID NO :11)扩增片段B2。均以阿维链霉菌Streptomyces avermitilis MA4680 总 DNA为模板，米用 New England Biolabs 公司的 Q5Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收和纯化片段。pIJ8660质粒使 用New England Biolabs公司的BamHI和NotI限制性内切酶消化，纯化回收，使用Gibson Assembly试剂盒（New England Biolabs公司）将pIJ8660片段、E片段、I片段、Bl片段 和B2片段连接一起，获得质粒pIJ8660-crtEIB，如图2所示。
[0046] 2、pIJ8660-RiboJ_crtEIB 质粒的获得
[0047] RiboJ (SEQ ID NO :30)序列通过合成两对引物 crt-RiobJ-Ls (SEQ ID NO : 12)与 crt-RiobJ-La(SEQ ID NO: 13)，crt-RiobJ-Rs(SEQ ID NO: 14)与 crt-RiobJ-Ra(SEQ ID NO :15)，经高温处理，再退火后形成寡核苷酸双链，经New England Biolabs公司的T4多聚 核苷酸激酶处理后，与经限制性内切酶BsaI处理的质粒pIJ8660-crtEIB连接，连接酶使用 New England Biolabs 公司的 T4 连接酶，构建得到质粒 pIJ866〇-RiboJ_crtEIB (见图 3)。
[0048] 3、pIJ866〇-Promoters_crtEIB 表达质粒载体的构建
[0049] 分别合成7种启动子的成对引物，SPL12(crt-SPL12-F/crt-SPL12-R)(SEQIDN0 :16/SEQ ID N0:17)、SPL18(crt-SPL18-F/crt-SPL18-R)(SEQ ID N0:18/SEQ ID N0:19)、 SPL23 (crt-SPL23-F/crt-SPL23-R)(SEQ ID NO ：20/SEQ ID NO ：21)^ SPL26 (crt-SPL26-F/ crt-SPL26-R)(SEQ ID N0:22/SEQ ID N0:23)、kas0p*(crt-kas0p*-F/crt-kas0p*-R)(SEQ ID NO :24/SEQ ID NO :25)、SPL43(crt-SPL43-F/crt-SPL43-R)(SEQ ID NO :26/SEQ ID NO : 27)、SPL44(crt-SPL44-F/crt-SPL44-R)(SEQ ID N0:28/SEQ ID N0:29)。每对引物经高温 处理，再退火后形成寡核苷酸链，经T4多聚核苷酸激酶处理后，与经限制性内切酶BsaI处 理的质粒pIJ8660-crtEIB连接，连接酶使用Τ4连接酶，构建得到七种强度启动子的质粒 pIJ866〇-Promoters-crtEIB，见表 2〇
[0050] 4、pIJ866〇-Promoters-RiboJ_crtEIB 表达质粒载体的构建
[0051] 分别合成7种启动子的成对引物，SPL12(crt-SPL12-F/crt-SPL12-R)、 SPL18 (crt-SPL18-F/crt-SPL18-R)、SPL23 (crt-SPL23-F/crt-SPL2 3-R)、 SPL26(crt-SPL26-F/crt-SPL26-R)、kasOp*(crt-kasOp*-F/crt-kasOp*-R)、 SPL43(crt-SPL43-F/crt-SPL43-R)、SPL44(crt-SPL44-F/crt-SPL44-R)。每对引物经高温 处理，再退火后形成寡核苷酸链，经T4多聚核苷酸激酶处理后，与经限制性内切酶BsaI处 理的质粒pi J8660-Rib〇J-crtEIB连接，连接酶使用Τ4连接酶，构建得到七种强度启动子的 质粒 pIJ866〇-Promoters-RiboJ-crtEIB，见表 2〇
[0052] 实施例2、重组质粒的转化
[0053] 由于阿维链霉菌中存在很强的限制修饰作用，用大肠杆菌Escherichia coli DH5a直接与阿维链霉菌进行结合转移，转化效率极低，有时候甚至得不到转化子。而 使用没有限制修饰作用的E. Co I i ET12567 (PUZ8002)进行结合转移，转化效率明显提 高。因此，将构建好的重组质粒转化到E. coli ET12567(PUZ8002)(Kieser T，Bibb M J, Buttner M J, et al. Practical Streptomyces Genetics, 2000, Norwich:The John Innes Foundation.)中以获得非甲基化的DNA，然后进行结合转移。
[0054] 本例中选用阿维链霉菌Streptomyces avermitilis MA4680作为出发菌株，该菌 在平板上产灰白色孢子。
[0055] 分别将实施例1中构建的阴性对照质粒pIJ8660-crtEIB，阴性对 照质粒pIJ8660-Rib〇J-crtEIB，七种不同强度启动子的番茄红素表达质 粒pIJ866〇-Promoters_crtEIB和七种不同强度启动子的番前红素表达质粒 pIJ8660-Promoters-RiboJ-crtEIB 的 E. coli ET12567(PUZ8002)与上述阿维链霉菌进行 结合转移，涂布于含有I