一种具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物活性肽的制备方法，具体涉及一种以牛乳铁蛋白为原料制备 具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 骨质疏松症在我国是一种常见的多发疾病，它对中老年人，尤其是绝经后妇女的 身体健康造成了十分严重的影响。骨质疏松可以引起骨折胸廓畸形等多种并发症，不仅使 患者本人饱受病痛折磨，还会使患者及家庭承受沉重的生活和经济压力。据预计，到2020 年我国骨质疏松和低骨量患者人数将增加至2. 8亿。全国性大规模流行病学调查也显示， 国内骨质疏松症总患病率为12. 4%，老年人患病比例超过50%。骨质疏松症已严重威胁中 老年人健康，因此，有关骨质疏松防治的功能性食品开发已经成为当今食品界的热点问题。
[0003] 乳铁蛋白（Lactoferrin，LF)是一种具有转铁功能的糖蛋白，分子量大小约为 78kDa，主要存在于乳清蛋白中，是乳中重要的功能性成分。目前研究表明，乳铁蛋白在生理 浓度下可以促进骨的合成代谢，LF可以诱导原代成骨细胞体外分化，也可促进成骨细胞系 的增殖，而且还可以作为存活因子，防止由于血清剥夺导致的成骨细胞凋亡，通过抑制破骨 细胞的发育和活性从而抑制骨吸收，因此LF可以作为一种潜在的骨质疏松治疗剂和骨修 复因子。
[0004] 乳铁蛋白在被人体摄入后，必须要经过胃肠道消化吸收。现代生物代谢研究表明， 人体摄取的蛋白质经消化道多种酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶、肠蛋白酶 等水解后，不是仅以氨基酸的形式吸收，更多的是以小肽的形式直接吸收，且乳铁蛋白小肽 的生物活性可能要远高于整个乳铁蛋白分子。而且目前对乳铁蛋白生物活性肽的研究，主 要集中在乳铁蛋白肽的抗菌活性、抗病毒活性以及降血压功能，但对促进成骨细胞增殖活 性的乳铁蛋白肽却未有报道。所以，研究开发一种具有更高促进成骨细胞增殖活性的乳铁 蛋白肽具有良好的开发和应用潜力。
[0005] 乳铁蛋白作为牛乳中重要的功能性成分，对其生物活性肽的研究较多，目前，骨质 疏松症的治疗方法较多，但仍以药物治疗为主。常用的药物有骨吸收抑制剂、骨形成促进剂 和骨矿化物。骨吸收抑制剂是主要针对破骨细胞的药物，通过抑制破骨细胞的活动而减少 骨的重吸收；骨形成促进剂则是主要针对成骨细胞的药物，能够增强成骨细胞的活性，促进 新骨的合成；矿化物是治疗骨质疏松的基础用药，包括钙剂和维生素 D，可以起到补充骨基 质成分的作用。但当前治疗骨质疏松的药物绝大多数为骨吸收抑制剂（如雌激素、双膦酸 盐、降钙素等），而骨形成促进剂的种类却非常少。而具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋 白肽可作为一种潜在的骨形成促进剂用于治疗和预防骨质疏松剂。所以，对乳铁蛋白促进 成骨细胞增殖活性肽的研究开发具有广泛的应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了解决现有缺少从乳铁蛋白中获取促进成骨细胞增殖活性的 蛋白肽的方法，从而提供一种具有促进成骨细胞增殖分化活性的乳铁蛋白肽及其制备方 法。
[0007] 本发明具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法按以下步骤实现：
[0008] -、将乳铁蛋白与去离子水混合，制备成质量浓度为2%~8%的乳铁蛋白水溶 液，然后用HCl调节体系的pH至1. 2~2. 5,得到乳铁蛋白溶液；
[0009] 二、将胃蛋白酶添加到步骤一得到的乳铁蛋白溶液中，在35 °C~40 °C水浴3~ IOmin后冰浴冷却，加入碱性调节剂调节体系的pH至6~7终止反应，然后离心处理获取上 清液，除盐后得到乳铁蛋白活性肽的酶解液；
[0010] 三、将乳铁蛋白活性肽的酶解液进行膜过滤，然后通过SP Sepharose Fast Flow 阳离子交换柱分离纯化，采用缓冲溶液A和缓冲溶液B线性梯度洗脱，检测波长为215nm和 280nm，收集第5个峰的洗脱组分，再经过透析除盐后冻干，得到初步分离纯化的乳铁蛋白 活性肽；
[0011] 四、用去离子水将初步分离纯化的乳铁蛋白活性肽配制成浓度为1~3mg/mL的乳 铁蛋白活性肽溶液，经滤膜过滤后采用Superdex Peptide 10/300GL凝胶过滤层析柱进行 纯化，采用缓冲溶液A洗脱，检测波长为215nm和280nm，收集第1个峰的洗脱组分，超滤浓 缩后得到乳铁蛋白肽溶液；
[0012] 五、通过真空冷冻干燥或低温喷雾干燥对乳铁蛋白肽溶液进行干燥处理，得到具 有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽；
[0013] 其中所述的缓冲溶液A为pH = 7. 0~7. 5的磷酸盐缓冲溶液（PBS)，向缓冲溶液 A中添加 NaCl，得到含有0. 5~2mol/L NaCl的缓冲溶液B。
[0014] 本发明制备得到的具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的应用是将该具有 促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽作为功能性组分应用于保健食品或功能性食品中。
[0015] 本发明具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法，是以牛乳铁蛋白为 原料，利用胃蛋白酶对牛乳铁蛋白进行一定时间的消化处理，制成具有促进成骨细胞增殖 活性的乳铁蛋白肽粗产品，再经阳离子交换层析和凝胶层析对乳铁蛋白肽进行分离纯化， 并采用真空冷冻干燥或低温喷雾干燥法进行最终产品的制备。本发明对乳铁蛋白肽在功能 性食品或者预防骨质疏松药品中的开发利用具有重要的意义。
[0016] 与现有技术相比，本发明具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法包 含以下有益效果：
[0017] 1、本发明中所述的制备牛乳铁蛋白肽的方法简单、安全，可大规模生产，且所产生 的乳铁蛋白肽具有比完整乳铁蛋白分子更高的促进成骨细胞增殖的活性。
[0018] 2、本发明采用阳离子交换层析梯度洗脱的方法，结合超滤浓缩、凝胶过滤层析等 方法分离出高活性的乳铁蛋白肽。
[0019] 3、本发明所涉及的牛乳铁蛋白为天然可食用成分，对人体无害，对成骨细胞具有 良好的促进其增殖的效果，可作为一种骨质疏松症治疗剂，具备实际开发的应用前景。
【附图说明】
[0020] 图1为实施例一阳离子交换层析的洗脱曲线图，1 一吸光度，2-电导率；
[0021] 图2为实施例一凝胶过滤层析的洗脱曲线图；
[0022] 图3为不同浓度的乳铁蛋白肽对成骨细胞增殖活性的柱状图。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0023] 一：本实施方式具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方 法按以下步骤实现：
[0024] -、将乳铁蛋白与去离子水混合，制备成质量浓度为2%~8%的乳铁蛋白水溶 液，然后用HCl调节体系的pH至1. 2~2. 5,得到乳铁蛋白溶液；
[0025] 二、将胃蛋白酶添加到步骤一得到的乳铁蛋白溶液中，在35°C~40°C水浴3~ IOmin后冰浴冷却，加入碱性调节剂调节体系的pH至6~7终止反应，然后离心处理获取上 清液，除盐后得到乳铁蛋白活性肽的酶解液；
[0026] 三、将乳铁蛋白活性肽的酶解液进行膜过滤，然后通过SP Sepharose Fast Flow 阳离子交换柱分离纯化，采用缓冲溶液A和缓冲溶液B线性梯度洗脱，检测波长为215nm和 280nm，收集第5个峰的洗脱组分，再经过透析除盐后冻干，得到初步分离纯化的乳铁蛋白 活性肽；
[0027] 四、用去离子水将初步分离纯化的乳铁蛋白活性肽配制成浓度为1~3mg/mL的乳 铁蛋白活性肽溶液，经滤膜过滤后采用Superdex Peptide 10/300GL凝胶过滤层析柱进行 纯化，采用缓冲溶液A洗脱，检测波长为215nm和280nm，收集第1个峰的洗脱组分，超滤浓 缩后得到乳铁蛋白肽溶液；
[0028] 五、通过真空冷冻干燥或低温喷雾干燥对乳铁蛋白肽溶液进行干燥处理，得到具 有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽；
[0029] 其中所述的缓冲溶液A为pH = 7. 0~7. 5的磷酸盐缓冲溶液（PBS)，向缓冲溶液 A中添加 NaCl，得到含有0. 5~2mol/L NaCl的缓冲溶液B。
[0030] 本实施方式所述的碱性调节剂为NaOH溶液、碳酸氢钠溶液或碳酸氢钾溶液。
【具体实施方式】 [0031] 二：本实施方式与一不同的是步骤二将胃蛋白酶添加 到步骤一得到的乳铁蛋白溶液中，使酶活力与乳铁蛋白的比值为lOOU/g~250U/g。其它步 骤及参数与一相同。
【具体实施方式】 [0032] 三：本实施方式与一或二不同的是步骤二在37°C水 浴5min。其它步骤及参数与一或二相同。
【具体实施方式】 [0033] 四：本实施方式与一至三之一不同的是步骤二以 5000~1000 Orpm的速度离心处理获取上清液。其它步骤及参数与一至三之 一相同。
【具体实施方式】 [0034] 五：本实施方式与一至四之一不同的是步骤三所述的 膜过滤的孔径为〇. 1 μπι或者0. 22 μπι。其它步骤及参数与一至四之一相同。
【具体实施方式】 [0035] 六：本实施方式与一至五之一不同的是步骤三所述的 阳离子交换柱分离纯化过程如下：先使用缓冲溶液A洗脱3~7个柱体积（CV)，再用缓冲 溶液B洗脱3~5个柱体积，洗脱流速控制为3~7mL/min。其它步骤及参数与具体实施方 式一至五之一相同。
[0036]
【具体实施方式】七：本实施方式与【具体实施方式】一至六之一不同的是步骤四所述的 凝胶过滤层析进行纯化过程如下：先使用缓冲溶液A进行平衡，然后再使用缓冲溶液A洗脱 1~3个柱体积，洗脱流速为0. 2~lmL/min。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至六之一 相同。
【具体实施方式】 [0037] 八：本实施方式与一至七之一不同的是步骤四所述的 超滤浓缩是采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩。其它步骤及参数与具体实 施方式一至七之一相同。
【具体实施方式】 [0038] 九：本实施方式与一至八之一不同的是步骤五所述的 真空冷冻干燥过程中控制冷阱温度为-73~-40°C，真空度为0. 01~0. 5mbar，干燥时间为 3~24h。其它步骤及参数与一至八之一相同。
【具体实施方式】 [0039] 十：本实施方式与一至九之一不同的是步骤五所述 的低温喷雾干燥控制