乳铁蛋白肽溶液中的固形物质量含量范围为15~40%，真空度达 到-0. 01~-0. 06MPa，进风温度为95~145°C，物料温度控制在30~60°C。其它步骤及参 数与一至九之一相同。
【具体实施方式】 [0040] 十一：本实施方式将一制备得到的具有促进成骨细胞 增殖活性的乳铁蛋白肽作为功能性组分应用于保健食品或功能性食品中。
[0041] 实施例一：本实施例具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法按以下 步骤实现：
[0042] -、将乳铁蛋白与去离子水混合，制备成质量浓度为5% (w/v)的乳铁蛋白水溶 液，然后用HCl调节体系的pH至2. 0,得到乳铁蛋白溶液；
[0043] 二、将26. Img胃蛋白酶添加到步骤一得到的乳铁蛋白溶液中，使酶活力与乳铁蛋 白的比值为238U/g，在37°C水浴5min后冰浴冷却，加入NaHOV^液调节体系的pH = 6. 5 终止反应，然后以1000 Orpm的速度离心处理获取上清液，透析除盐后得到乳铁蛋白活性肽 的酶解液；
[0044] 三、调整乳铁蛋白活性肽的酶解液中的蛋白质浓度为2mg/mL，经0. 22 μπι膜过滤， 然后通过SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱分离纯化，离子交换柱预先用pH =7. 4 的PBS溶液（缓冲溶液A)平衡，采用线性梯度洗脱，结合到树脂上的蛋白利用50mmol/LPBS 缓冲溶液A洗脱5个柱体积（CV)，再用含有lmol/L NaCl的缓冲溶液B洗脱5个柱体积， 洗脱流速为5mL/min，检测波长为215nm和280nm，收集第5个峰（图1中的峰5)的洗脱组 分，再经过透析除盐后冻干，得到初步分离纯化的乳铁蛋白活性肽；
[0045] 四、用去离子水将初步分离纯化的乳铁蛋白活性肽配制成浓度为2mg/mL的乳铁 蛋白活性肽溶液，经〇. 22 μ m滤膜过滤后采用Superdex Peptide 10/300GL凝胶过滤层析 柱进行纯化，凝胶柱预先用PH = 7. 6的缓冲溶液A进行平衡，待基线平稳后进样，然后再利 用pH = 7. 6的缓冲溶液A洗脱2个柱体积，洗脱流速为0. 5mL/min，检测波长为215nm和 280nm，收集第1个峰（图2中的峰5-1)的洗脱组分，采用截留分子量为500D的再生纤维 素膜进行浓缩后得到乳铁蛋白肽溶液；
[0046] 五、通过真空冷冻干燥对乳铁蛋白肽溶液进行干燥处理，控制冷阱温度_60°C，真 空度0.0 lmbar，时间16h，得到具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽。
[0047] 本实施例步骤一使用的乳铁蛋白的纯度大于95%。
[0048] 本实施例制备出的乳铁蛋白肽产品的活性检测如附图3中的峰5-1所示，说明其 具有良好的促成骨细胞增殖活性。
[0049] 本实施例对于制备得到的具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的测试方式 如下：
[0050] (1)胃蛋白酶活力测定：
[0051] 采用福林酚法测定胃蛋白酶活力，按照GB/T 28715-2012进行。
[0052] (2)蛋白质含量的测定：
[0053] 采用考马斯亮蓝法（Bradford)测定蛋白浓度。
[0054] (3)游离氨基含量的测定：
[0055] 采用邻苯二甲醛OPA法测定游离氨基的含量。
[0056] (4)蛋白质水解度计算
[0057] 蛋白质水解度
[0058] 式中：水解后样品的游离氨基含量（mmol/g);
[0059] Y2+水解前样品的游离氨基含量（mmol/g);
[0060] 8. 658-乳铁蛋白中所含肽键含量（mmol/g)。
[0061] (5)乳铁蛋白肽分子量测定：
[0062] 采用SDS-PAGE电泳和Tricine SDS PAGE凝胶电泳测定乳铁蛋白肽分子量。
[0063] (6)样品活性测定：
[0064] MTT法测定乳铁蛋白肽活性：
[0065] 实验分组如下：将冻干粉分别配制为低剂量浓度组（20 μ g/mL)、中剂量浓度组 (100 μ g/mL)和高剂量浓度组（500 μ g/mL)的乳铁蛋白肽溶液，以水作为空白对照。每组6 孔，将成骨细胞消化计数，将细胞浓度调整为每孔IX 105个/mL，然后将细胞接种于96孔培 养板。在培养24h、48h和72h后分别进行检测。
[0066] 检测指标如下：每隔24h、48h和72h，测定细胞增殖能力。吸除培养液，用PBS反 复清洗除去死细胞；每孔加入含有0.5% MTT的a-MEM 100 μ L，于37°C，5% 0)2培养箱中 孵育4h ;观察出现黑色网状物后终止孵育，弃去培养液；每孔加入150 μ L DMS0,振荡IOmin 后用酶联免疫检测仪在波长490nm处测定其吸光值，用OD值表示。
[0067] 本实施实例中LF产品作用于成骨细胞24h、48h和72h对应的OD值分别是0. 31、 0.37和0.41，产品纯度（蛋白质含量）大于97%。
[0068] 实施例二：本实施例与实施例一不同的是步骤五通过低温喷雾干燥对乳铁蛋白肽 溶液进行干燥处理，活性多肽溶液中的固形物含量为30%，真空度达为-0.0 IMPa，进风温 度为120°C，进料速度根据机器情况进行调整，物料温度控制在40°C，得到具有促进成骨细 胞增殖活性的乳铁蛋白肽。
[0069] 本实施例得到的具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的OD值分别是0. 31、 0. 38和0. 42,表明其具有良好的促成骨细胞增殖活性。
【主权项】
1. 一种具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法，其特征在于是按下列步 骤实现： 一、将乳铁蛋白与去离子水混合，制备成质量浓度为2 %~8 %的乳铁蛋白水溶液，然 后用HCl调节体系的pH至1. 2~2. 5,得到乳铁蛋白溶液； 二、 将胃蛋白酶添加到步骤一得到的乳铁蛋白溶液中，在35°C~40°C水浴3~IOmin 后冰浴冷却，加入碱性调节剂调节体系的pH至6~7终止反应，然后离心处理获取上清液， 除盐后得到乳铁蛋白活性肽的酶解液； 三、 将乳铁蛋白活性肽的酶解液进行膜过滤，然后通过SP Sepharose Fast Flow阳 离子交换柱分离纯化，采用缓冲溶液A和缓冲溶液B线性梯度洗脱，检测波长为215nm和 280nm，收集第5个峰的洗脱组分，再经过透析除盐后冻干，得到初步分离纯化的乳铁蛋白 活性肽； 四、 用去离子水将初步分离纯化的乳铁蛋白活性肽配制成浓度为1~3mg/mL的乳铁蛋 白活性肽溶液，经滤膜过滤后采用SuperdexPeptide10/300GL凝胶过滤层析柱进行纯化， 采用缓冲溶液A洗脱，检测波长为215nm和280nm，收集第1个峰的洗脱组分，超滤浓缩后得 到乳铁蛋白肽溶液； 五、 通过真空冷冻干燥或低温喷雾干燥对乳铁蛋白肽溶液进行干燥处理，得到具有促 进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽； 其中所述的缓冲溶液A为pH= 7. 0~7. 5的磷酸盐缓冲溶液，向缓冲溶液A中添加NaCl，得到含有0? 5~2mol/LNaCl的缓冲溶液B02. 根据权利要求1所述的一种具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法， 其特征在于步骤二将胃蛋白酶添加到步骤一得到的乳铁蛋白溶液中，使酶活力与乳铁蛋白 的比值为l〇〇U/g~250U/g。3. 根据权利要求1所述的一种具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法， 其特征在于步骤二以5000~1000 Orpm的速度离心处理获取上清液。4. 根据权利要求1所述的一种具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法， 其特征在于步骤三所述的膜过滤的孔径为0.Iym或者0. 22ym。5. 根据权利要求1所述的一种具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法， 其特征在于步骤三所述的阳离子交换柱分离纯化过程如下：先使用缓冲溶液A洗脱3~7 个柱体积，再用缓冲溶液B洗脱3~5个柱体积，洗脱流速控制为3~7mL/min。6. 根据权利要求1所述的一种具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法， 其特征在于步骤四所述的凝胶过滤层析进行纯化过程如下：先使用缓冲溶液A进行平衡， 然后再使用缓冲溶液A洗脱1~3个柱体积，洗脱流速为0. 2~lmL/min。7. 根据权利要求1所述的一种具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法， 其特征在于步骤四所述的超滤浓缩是采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩。8. 根据权利要求1所述的一种具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方 法，其特征在于步骤五所述的真空冷冻干燥过程中控制冷阱温度为-73~-40°C，真空度为 0? 01~0? 5mbar，干燥时间为3~24h〇9. 根据权利要求1所述的一种具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法， 其特征在于步骤五所述的低温喷雾干燥控制乳铁蛋白肽溶液中的固形物质量含量范围为 15~40%，真空度达到-0.0 l~-0. 06MPa，进风温度为95~145°C，物料温度控制在30~ 60 cC 〇10.具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的应用，其特征在于将该具有促进成骨 细胞增殖活性的乳铁蛋白肽作为功能性组分应用于保健食品或功能性食品中。
【专利摘要】一种具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法及应用，本发明涉及一种生物活性肽的制备方法，它为了解决现有缺少从乳铁蛋白中获取促进成骨细胞增殖活性的蛋白肽的方法。制备方法：一、乳铁蛋白与去离子水混合，调节pH；二、胃蛋白酶加入到乳铁蛋白溶液中，水浴反应；三、过滤后采用阳离子交换柱分离纯化，然后透析冻干；四、过滤后采用凝胶过滤层析柱进行纯化；五、最后进行干燥处理得到该乳铁蛋白肽。本发明以牛乳铁蛋白为原料，制备得到的乳铁蛋白肽对成骨细胞具有良好的促进其增殖的效果。制备得到的该乳铁蛋白肽可以应用于保健食品或功能性食品中。
【IPC分类】C07K1/34, A23L1/305, C12P21/06, C07K1/18, C07K1/14, C07K1/16
【公开号】CN105177097
【申请号】
【发明人】杜明, 樊凤娇, 刘猛, 石璞洁, 涂茂林
【申请人】哈尔滨工业大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月21日