PCR中，采用预变性之后加 dNTP 的方法，可以有效防止低温下未经修饰的Taq酶的非特异扩增；然而热启动Taq酶在低温下 活性位点被封闭，手工热启动与否并不影响其产物特异性。根据这一原理，设置以下表征方 法。
[0052] 该验证方法设置以下4种反应体系，如表3所示。
[0053] 表3手工热启动法的4中反应体系
[0055] 反应程序：
[0056] 室温25 °C静置30min ;预变性95 °C 15min ;在体系3和体系4中分别加入 I. 5uldNTP ;热循环 92°C 15s, 57. 4°C lmin, 72°C lmin, 35cycles ;补平 72°C lOmin。反应在 MyCycler? thermal cycler (Bio-Rad)上进行，每个体系设置 3 重复。
[0057] 结果如图2所示，图中" + "表示进行手工热启动或者化学修饰；表示不进行手 工热启动或者化学修饰。箭头所示为普通Taq酶不做手工热启动时产生的非特异性产物。
[0058] 无论手工热启动与否，经过修饰的热启动Taq酶室温放置后都不会有非特异性产 物生成；而未经修饰的Taq酶，不进行手工热启动时有非特异性产物生成。
[0059] 实施例3
[0060] 热变性时间法。
[0061] 由于经化学修饰的Taq酶，在常温下，带负电荷的化学基团结合带正电荷的氨基 酸残基，酶的活性位点被封闭，不能发挥其DNA聚合酶的活性。在合适的pH条件下，升高温 度，可以使化学基团与被其修饰的氨基酸的氨基解离，恢复其活性。根据这一原理，设置以 下实验，依次增加95°C预变性时间，表征经过化学修饰热启动Taq酶。
[0062] 该验证方法设置以下反应体系，如表4所示。
[0063] 表4热变性时间法采用的反应体系
[0065] 反应程序：
[0066] 设置预变性时间梯度 95°C 0_20min ;热循环92°C 15s，57. 4°C lmin, 72°C lmin, 35cy cles ;补平 72°C lOmin。反应在 MyCycler? thermal cycler (Bio-Rad)上进行，每个体系设 置2重复。
[0067] 结果如图3所示，A中使用普通Taq酶，B中使用修饰程度较低的Taq酶和C中使 用修饰程度较高的Taq酶，分别在95°C 0_20min的热变性时间梯度下进行PCR反应。图中 每条泳道分别加入7. 5ul相应的PCR产物。各泳道所代表的PCR反应的预变性时间不同： 1-2泳道热变性Omin, 3-4泳道热变性2min，5-6泳道热变性5min，7-8泳道热变性lOmin， 9-10泳道热变性15min，11-12泳道热变性20min。随着预变性时间的增加，经修饰的Taq 酶被封闭的DNA聚合酶活性被逐步释放，经过相同的热循环过程，等量PCR反应终体系中积 累的目的产物的量依次增加。比较B，C两图可以发现修饰程度高的酶需要经过更长的热启 动时间，才能释放出DNA聚合酶活性；并且达到最大产物浓度所需要的热启动时间，修饰程 度高的Taq酶也比修饰程度低的要长。但是，如图3中的A所示，普通Taq酶的活性并不受 热启动时间的影响。
[0068] 实施例4
[0069] 最低循环数法。
[0070] 在PCR的热循环阶段，随着循环数的增加，目的产物呈指数倍增长，直到反应进入 平台期。同时，受琼脂糖凝胶电泳检测灵敏度的限制，产物浓度较低时无法检测到产物；产 物浓度过高时，双链DNA与荧光染料的结合达到饱和程度，无法进一步指示产物量的差异。 因此在起始反应条件一样的条件下，活性位点被封闭的热启动Taq酶，其修饰基团的解离 程度成为PCR扩增效率的决定因素；并且，当热启动条件一样时，Taq酶修饰基团的解离程 度与其被修饰的程度负相关。然而，普通的Taq酶则不具备这一特性。根据化学修饰Taq 酶的这一特性，设计以下实验，设定热启动时间，依次增加循环数，对其修饰程度进行半定 量表征。
[0071 ] 该验证方法设置以下反应体系，如表5所示。
[0072] 表5最低循环数法中采用的反应体系
[0074] 反应程序：
[0075] 预变性 95°C 5min ;热循环 92°C 15s, 57. 4°C lmin, 72°C Imin,设置循环数梯度 20_35cycles。反应在 MyCycler? thermal cycler (Bio-Rad)上进行。
[0076] 结果如图4所示，A, B, C图依次为普通Taq酶，修饰程度较低的Taq酶和修饰程度 较高的Taq酶的经过20-35个热循环的循环数梯度PCR电泳结果。各图中数字20-35表示 热循环阶段的循环数。在相同的热启动条件下，相同活力单位的Taq酶，达到最大产物量的 循环数由修饰与否及修饰程度决定。A图中未修饰的Taq酶在30个循环时产物条带的荧 光强度达到最大；B图中修饰程度较低的Taq酶在34个循环时产物条带的荧光强度达到最 大；C图中修饰程度较高的Taq酶，在第32个循环才能检测到有目的产物生成，到35个循 环结束时目的条带的荧光强度远远低于普通Taq酶。
[0077] 实施例5
[0078] 多重 PCR 法。
[0079] 多重PCR是在同一反应体系中同时扩增多种目的产物。因此，PCR体系中存在多 对引物，引物之间更容易形成二聚体；甚至在低温下引物与模板非特异性结合导致非特异 性产物的生成。在低温时，热启动Taq酶活性被化学基团封闭，能有效地减少非特异性产物 的产生，因而在多重PCR扩增中，能表现出更多的优势。根据这一原理，设置以下实验，通过 比较普通Taq酶和热启动Taq酶在多重扩增中产物的差异，对修饰效果进行评估。
[0080] 该验证方法设置以下反应体系，如表6所示。
[0081] 表6多重PCR法中采用的反应体系
[0083] 反应程序：
[0084] 设置25°C放置Omin和25min对照组；预变性95°C 2min和15min对照组；热循环 92°C 15s，60. 1°C lmin，72°C lmin，35cycles ;补平 72°C lOmin。反应在 MyCycler? thermal cycler (Bio-Rad)上进行，每个体系设置2重复。
[0085] 结果如图5所示，图中" + "表示进行相应的操作，表示不进行该项操作；线标 示的是引物二聚体。室温25°C放置和热启动时间长短，都不会导致经过修饰的Taq酶生成 引物二聚体；而不经修饰的Taq酶，却会大量生成引物二聚体。
[0086] 实施例6
[0087] 热变性时间和多重PCR法结合。
[0088] Taq DNA聚合酶在扩增目的片段的时候具有一定的偏好性，片段短的产物更有利 于扩增。在酶活力单位低时，这一现象更为明显。而对于活性位点被封闭的热启动Taq酶， 随着热变性时间的增加，DNA聚合酶活性逐渐恢复，PCR体系扩增目的片段的能力也随之增 强。根据这一原理，设计以下实验对热启动Taq酶进行表征。
[0089] 该验证方法设置以下反应体系，如表7所示。
[0090] 表7热变性时间和多重PCR法结合采用的反应体系
[0092] 反应程序：
[0093] 设置预变性时间梯度 95°C 5-20min ;热循环92°C 15s, 60. 1°C lmin, 72°C lmin, 35cy cles ;补平 72°C lOmin。反应在 MyCycler? thermal cycler (Bio-Rad)上进行，每个体系设 置3重复。
[0094]结果如图 6 所不，A, B, C, D, E, F 是依次经过 2min, 5min, IOmim, 15min, 20min, 25min 95°C热启动后的PCR扩增结果。各图中泳道1-3使用普通Taq酶；4-6使用修饰程度较低的 Taq酶；7-9使用修饰程度较高的Taq酶。随着热变性时间的增加，经化学修饰的Taq酶，无 论其修饰程度高低，其DNA聚合酶活性都逐步被释放，扩增目的产物的能力恢复，三种产物 依次出现。尤其是修饰程度高的Taq酶，其扩增能力恢复情况与热启动时间显著相关。修 饰程度低的Taq酶，仅在扩增812bp的长片段时表现出酶活与热变性时间的相关性。然而， 普通Taq酶的活性不受热启动时间的影响。
【主权项】
1. 一种热启动Taq酶的热启动效率表征方法，包括： (1) 在配制完成的PCR体系中，不加入dNTP，将该反应体系在PCR仪上完成热变性以 后，加入dNTP作为对照；在另一加入修饰后热启动Taq酶的扩增体系中直接加入dNTP，进 行同时扩增，反应结束后，用琼脂糖电泳检测PCR产物，比较两种操作中引物二聚体和非特 异性扩增产物产生的情况，对热启动效率进行评估； (2) 通过不同的热变性时间对活性的影响，对修饰得到的热启动Taq酶的效果进行半 定量的评估； (3) 经修饰得到的热启动Taq酶，在热变性的过程中释放活性，通过设定相同的热变性 时间，检测不同的PCR体系中，累积相同的可被检测到的产物量所需要的循环数，对修饰的 效果进行半定量的评估； (4) 通过比较普通Taq酶和热启动Taq酶在多重扩增中产物的差异，对修饰效果进行定 量评估； (5) 通过设置不同的热变性时间的关系，比较普通Taq酶与热启动Taq酶的扩增能力恢 复情况与热启动时间，对修饰效果进行评估。2. 根据权利要求1所述的一种热启动Taq酶的热启动效率表征方法，其特征在于，所述 步骤（1)中热变性的条件为95°C，15分钟。3. 根据权利要求1所述的一种热启动Taq酶的热启动效率表征方法，其特征在于，所述 步骤（1)中扩增为热循环 92°C15s, 57. 4°Clmin, 72°CImin, 35 个循环；补平 72°ClOmin。4. 根据权利要求1所述的一种热启动Taq酶的热启动效率表征方法，其特征在于，所述 步骤（2)中热变性时间梯度为95°C，0_20min。5. 根据权利要求1所述的一种热启动Taq酶的热启动效率表征方法，其特 征在于，所述步骤⑷中多重扩增为预变性95°C2min和15min对照组；热循环 92。(： 15s, 60.IcCImin, 72。(：lmin，35 个循环；补平 72。(：lOmin。
【专利摘要】本发明涉及一种热启动Taq酶的热启动效率表征方法，所述表征方法为手工热启动法、热变性时间法、最低循环数法、多重PCR法以及热变性时间与多重PCR法结合。本发明的热启动Taq酶，解决了使PCR反应发生引物二聚体以及非特异性的扩增，影响产物的特异性的问题。本发明的热启动Taq酶热启动效率表征方法从多个角度进行验证，及对热启动效率进行半定量的评估，可以保证结果的可靠性。
【IPC分类】C12Q1/48
【公开号】CN105177111
【申请号】
【发明人】周宇荀, 李晓宁, 林天音, 王斯佳, 李文文, 肖君华, 李凯
【申请人】东华大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月15日