核酸的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，涉及利用拆分式信号发生蛋白与核酸酶缺陷型Cas9 蛋白的融合蛋白对样品中是否存在目标核酸进行检测的体外（in vitro)方法、试剂盒和设 备。
【背景技术】
[0002] 核酸检测方法在现代医疗、食品安全和公共卫生领域具有广泛的应用。特别是在 对食物、饮用水以及患者体液样品中的传染性病原菌进行检测时，为更快地制定有针对性 的治疗或解决方案，需要在尽可能短的时间内获得病原菌的种类、浓度和抗性等方面的信 息。然而，由于传统的检测方法在灵敏度方面的限制，需要先将可能含有待测病原菌的样品 孵育数小时至数天，才能实施逆转录、PCR或测序等常规检测方法。这样长的延迟将错过给 予有针对性的治疗或处理的最佳时机。由于涉及液体或固体培养、RNA或DNA提取、离心等 操作，此类方法需要在临床实验室内由专业技术人员手动实施，常出现交叉污染或结果不 一致的问题。另外，需要借助专用的台式仪器也导致此类检测方法成本较高且难以实现便 携性。
[0003] 针对上述问题，研究人员开发了两类改进的核酸检测方法。第一类为利用等温扩 增（isothermal amplification)技术替代传统PCR。对于DNA样品而言，借助具有链置换 活性的DNA聚合酶（例如Bst、Φ29等），在恒定的温度下催化单链DNA的扩增（Angelika Niemz 等，Trends in Biotechnology，2011，29 (5) :240-250)。对于 RNA 样品而言，可利用 有RNA聚合酶参与的等温扩增方法（例如NASBA、Ribo-SPIA等）直接由RNA模板获得DNA 扩增产物，或者首先实施一步逆转录，再进行常规的针对DNA的等温扩增。等温扩增操作简 单且效果稳定，不需要使用昂贵的热循环仪。由于对传统PCR的抑制剂不敏感，对样品的 预处理得以进一步简化（Development of Rapid Isothermal Amplification Assays for Detection of Phytophthora spp. in Plant Tissue,Miles TD 等，Phytopathology，2015， 105(2) :265-278 ；Rapid detection of HIV-Iby Reverse-Transcription, Loop-Mediat ed Isothermal Amplification(RT-LAMP)，Curtis KA 等，2008,J. Virol. Methods 151(2): 264-270)。这些特性使得等温扩增方法更适合用于结核病、疟疾、霍乱等传染病大范围流行 的中低收入国家的临床实践。
[0004] 第二类改进的检测方法为利用核酸探针的分子信标（molecular beacon)技术。 分子信标设计为特异性识别待检测序列且具有茎环结构的单链寡核苷酸，该茎环结构的 末端分别标记有焚光基团和淬灭基团。分子信标未与目标核酸结合时，焚光基团与淬灭基 团在空间上邻近，由于发生能量转移，荧光基团发出的荧光被淬灭。而当分子信标与目标 核酸互补结合时，荧光基团和淬灭基团之间距离超出能量转移范围，荧光得以被检测。待 检测序列可以是RNA和DNA。分子信标技术能够实现针对活体样品的原位（in situ)检 测（Molecular Beacon:Probes that Fluoresce upon Hybridization, Sanjay Tyagi 等， Nature Biotechnology，1996,14 (3) :303-308)。在分子信标技术中，信标与目标DNA 以 I: I 的比例结合，难以将信号放大。作为改进，有报道将滚环扩增（一种等温扩增技术）与分 子信标技术结合，或利用DNA切口酶催化，使得信号进一步放大（Jianwei Li等，Nucleic Acids Res·，2008 ;36 (6))。
[0005] 现有技术中几乎没有利用核酸-蛋白相互作用对核酸进行检测的方法。然而，最 近发现的针对任意DNA序列都具有可编程式结合能力的蛋白（例如ZFN、TALEN或CRISPR/ Cas9系统）为核酸的检测提供了新的思路。现有技术主要将上述蛋白作为基因编辑工具， 还没有将其用于检测样品中的核酸的报道。
【发明内容】
[0006] 在第一方面，本发明提供了一种对样品中是否存在目标核酸进行检测的方法，所 述目标核酸为目标DNA，所述方法包含如下步骤：
[0007] (1)提供第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中，所述第一融合蛋白为拆分式信号发 生蛋白N端片段与核酸酶缺陷型Cas9蛋白的融合蛋白，所述第二融合蛋白为拆分式信号发 生蛋白C端片段与核酸酶缺陷型Cas9蛋白的融合蛋白，由所述N端片段和所述C端片段构 成的所述信号发生蛋白能够参与产生可检测信号的化学反应；
[0008] (2)针对所述目标DNA中的一对或多对的靶序列，设计并合成SgRNA对；
[0009] (3)将所述样品、步骤（1)提供的所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白、步骤 (2)获得的各SgRNA对以及参与产生可检测信号的化学反应的其它反应物和/或催化剂共 同孵育，生成可检测信号；以及
[0010] ⑷对所述可检测信号进行测量。
[0011] 在第二方面，本发明提供了一种对样品中是否存在目标核酸进行检测的方法，所 述目标核酸为目标RNA，所述方法包含如下步骤：
[0012] 0-)提供第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中，所述第一融合蛋白为拆分式信号 发生蛋白N端片段与核酸酶缺陷型Cas9蛋白的融合蛋白，所述第二融合蛋白为拆分式信号 发生蛋白C端片段与核酸酶缺陷型Cas9蛋白的融合蛋白，由所述N端片段和所述C端片段 构成的所述信号发生蛋白能够参与产生可检测信号的化学反应；
[0013] (2'）针对所述目标RNA所对应的目标DNA中的一对或多对的靶序列，设计并合成 SgRNA 对；
[0014] (3'）针对所述样品中的所述目标RNA，实施逆转录并获得所对应的目标DNA ;
[0015] (4'）将步骤（3'）获得的目标DNA、步骤（Γ )提供的所述第一融合蛋白和所述第 二融合蛋白、步骤（2'）获得的各SgRNA对以及参与产生可检测信号的化学反应的其它反应 物和/或催化剂共同孵育，生成可检测信号；以及
[0016] (5'）对所述可检测信号进行测量。
[0017] 在第三方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含：第一融合蛋白和第二融 合蛋白，所述第一融合蛋白为拆分式信号发生蛋白N端片段与核酸酶缺陷型Cas9蛋白的融 合蛋白，所述第二融合蛋白为拆分式信号发生蛋白C端片段与核酸酶缺陷型Cas9蛋白的融 合蛋白，由所述N端片段和所述C端片段构成的所述信号发生蛋白能够参与产生可检测信 号的化学反应。
[0018] 在第四方面，本发明提供了一种设备，所述设备包含孵育模块及检测模块，所述孵 育模块用于对本发明步骤（3)或（4'）的反应混合物进行孵育，所述检测模块用于实施本发 明的步骤⑷或（5'）。
[0019] 有益效果
[0020] 本发明的检测方法主要利用CRISPR/Cas9系统能够识别任意DNA序列的性质。由 于Cas9蛋白的作用位点完全取决于所设计的SgRNA序列，可针对任意的靶序列，设计并合 成相应的SgRNA。利用核酸酶缺陷型Cas9实现了定位而不切割目标DNA。当样品中存在包 含靶序列的目标DNA时，SgRNA对中的各SgRNA的识别序列能够与目标DNA互补结合，使得 第一融合蛋白和第二融合蛋白的核酸酶缺陷型Cas9结构域均定位于目标DNA上的一对或 多对靶序列，形成各核酸酶缺陷型Cas9-sgRNA-目标DNA复合体，从而拆分式信号发生蛋白 N端片段与C端片段在空间上彼此邻近而重新组装，因此能够实现完整的信号发生蛋白的 功能。该信号发生蛋白能够作为酶或底物参与诸如发光、荧光、发电等能够产生可检测信号 的反应，从而将目标DNA与SgRNA对互补结合的信息转化为光信号或电信号，通过这样的方 式获得DNA序列信息。这是首次将对任意核酸序列都具有可编程式结合能力的蛋白系统用 于对样品中核酸的体外检测。由于针对两个以上靶位置，本发明的方法具有较高的特异性。
[0021] 重新组装后的信号发生蛋白可为催化产生可检测信号的化学反应的酶，或者为信 号级联放大反应的一个反应物。当信号发生蛋白为具有催化作用的酶时，极少量的信号发 生蛋白即可将大量的底物转化为产物，从而实现信号的放大。或者，当信号发生蛋白为信号 级联放大反应的一个反应物时，可利用类似于酶联免疫吸附（ELISA)的原理，借助具有放 大效应的抗原-抗体反应，实现信号的二次或多次放大。两种方式均能够大幅度提高检测 的灵敏度。
[0022] 可将本发明的方法用于针对目标RNA或目标DNA的检测、或目标RNA和目标DNA 的同时检测。当将本发明的方法单独用于对目标RNA或者对目标RNA和目标DNA进行检测 时，仅需用特定的引物对样品中的目标RNA实施逆转录，获得逆转录产物并进一步获得对 应的目标DNA。其他步骤均与以DNA作为检测目标的步骤相似。
[0023] 本发明的方法简便高效。由于无需使用复杂的变温设备和处理设备，本发明的方 法在便携性方面也是有利的，可有效地用在为控制污染、诊断、预防等多种目的而实施的实 地检测中。
[0024] 特别地，在优选的实施方式中，可对样品进行预处理，并与现有的等温扩增等技术 结合，进一步提高本发明的灵敏度。
【附图说明】
[0025] 图1为本发明核酸检测方法的原理图。（a)待检测的DNA不存在靶序列的情况下， 第一融合蛋白和第二融合蛋白随机分布。（b)待检测的DNA存在靶序列（即，样品中存在 目标DNA)的情况下，在SgRNA对的引导下，第一融合蛋白和第二融合蛋白的核酸酶缺陷型 Cas9结构域分别与靶序列结合，N端片段与C端片段在空间上邻近从而重组为具有功能的 信号发生蛋白，参与产生可检测信号的反应，生成可检测信号。
[0026] 图2示出根据本发明的实施例1，采取不同方向和相对位置的PAM序列以及融合 蛋白的构建方式获得的相对信号强度。相对信号强度以测得的荧光值与空白对照值之比示 出。空白对照值为由不含任何待检测的DNA的样品获得的荧光值（即信号发生蛋白的N端 片段和C端片段由于随机自发重新组装产生的假阳性信号）。误差棒表示三次平行实验的 标准差。
[0027] 图3示出根据本发明的实施例1测得的靶序列间距与相对信号强度的关系。相对 信号强度以测得的荧光值与空白对照值之比示出。空白对照值为由不含任何待检测的DNA 的样品获得的荧光值（即信号发生蛋白的N端片段和C端片段由于随机自发重新组装产生 的假阳性信号）。误差棒表示三次平行实验的标准差。
[0028] 图4示出根据本发明的实施例1测得的目标DNA浓度与相对信号强度的关系。该 相对信号强度反映检测系统的灵敏度。相对信号强度以测得的荧光值与阴性对照值之比示 出。阴性对照值为由加入无靶序列的待检测DNA的样品获得的荧光值（即由于SgRNA与无 靶序列的待检测DNA非特异性结合产生的假阳性信号）。误差棒表示三次平行实验的标准 差。
[0029] 图5示出根据本发明的实施例1，采用具有不同序列特征的待检测的DNA获得的相 对信号强度。该信号强度反映检测系统的特异性。相对信号强度以测得的荧光值与空白对 照值之比示出。空白对照值为由不含任何待检测的DNA的样品获得的荧光值（即信号发生 蛋白的N端片段和C端片段由于随机自发重新组装产生的假阳性信号）。误差棒表示三次 平行实验的标准差。
[0030] 图6示出根据本发明的实施例2和实施例3,对样品中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)基因组进行检测的结果。所述结果以测得的荧光值与空白对照值之比示出。空 白对照值为由不含任何待检测的DNA的样品获得的荧光值（即信号发生蛋白的N端片段和 C端片段由于随机自发重新组装产生的假阳性信号）。黑色柱表示检测采用与目标DNA匹 配的sgRNA。灰色柱表示检测采用与目标DNA不匹配的sgRNA (mismatch sgRNA)。误差棒 表示三次平行实验的标准差。
[0031] 图7示出根据本发明的实施例3,分别采用了针对不同靶位置的3对sgRNA对，对 样品中的枯草芽孢杆菌基因组进行检测的灵敏度和特异性。所述结果以测得的荧光值与空 白对照值之比示出。空白对照值为由不含任何待检测的DNA的样品获得的荧光值（即信号 发生蛋白的N端片段和C端片段由于随机自发重新组装产生的假阳性信号）。扩增阴性模 板为以PSB1C3质粒作为扩增模板。误差棒表示三次平行实验的标准差。
[0032] 图8示出根据本发明的实施例3,对样品中的枯草芽孢杆菌基因组PCR产物进行 检测的特异性。所述结果以测得的荧光值与空白对照值之比示出。空白对照值为由不含 任何待检测的DNA的样品获得的荧光值（即信号发生蛋白的N端片段和C端片段由于随 机自发重新组装产生的假阳性信号）。扩增阴性模板为以PSB1C3质粒作为扩增模板。黑 色柱表示检测采用与目标DNA匹配的sgRNA。灰色柱表示检测采用与目标DNA不匹配的 sgRNA (mismatch sgRNA)。误差棒表示三次平行实验的标准差。
[0033] 图9示出根据本发明的实施例4,先对样品实施等温扩增，再实施本发明的方法进 行检测。（a)等温扩增的片段的凝胶电泳图。（b)以等温扩增作为预处理时获得的结果。 所述结果以测得的荧光值与扩增阴性对照值之比示出。扩增阴性对照值为利用以PSB1C3 质粒作为扩增模板获得的等温扩增产物作为样品获得的荧光值（阴性扩增产物中应仅有 PSB1C3质粒模板，该对照值为由于dCas9结构域与阴性模板的随机相互作用使得信号发生 蛋白的N端片段和C端片段随机组装产生的假阳性信号）。误差棒表示三次平行实验的标 准差。
【具体实施方式】
[0034] 核酸检测方法
[0035] 本发明的方法用于对样品中是否存在目标核酸进行检测。在本发明的上下文中， 术语"待检测的DNA"、"待检测的RNA"分别指存在于样品中的DNA或RNA，该DNA或RNA可 为目标DNA或目标RNA，也可为不包含检测所针对的序列（靶序列）的DNA或RNA。样品也 可能不包含任何核酸。当将本发明的方法用于对RNA进行检测时，实质上首先将RNA逆转录 并获得相应的DNA，再对该DNA进行操作，因此，在上下文中，术语"靶序列"为检测所针对的 DNA序列。当检测对象为DNA时，所述靶序列存在于目标DNA中。当检测对象为RNA时，所 述靶序列所对应的RNA序列存在于目标RNA中。同理，术语"目标DNA"是指包含靶序列的 DNA。在以DNA作为检测目标时，"目标DNA"即为期望考察其是否存在于样品中的核酸；在 以RNA作为检测目标时，"目标RNA"为期望考察其是否存在于样品中的核酸，而"目标DNA" 指的是与目标RNA具有对应序列的DNA，该目标DNA同样具有革E序列。
[0036] 本发明所检测的样品可为从多种途径获取的液体或固体状态的样品。在一些实 施方式中，所述样品可为环境样品，例如但不限于来自于地下水、中水、海水、采矿废料的样 品。在一些实施方式中，所述样品可为生物样品，例如来自植物或动物及其加工产品的样 品。在一些实施方式中，所述样品可为从受试者获得的样品，例如面颊拭子、血液、血清、血 浆、痰、脑脊液流体、尿液、泪液、肺泡分离物、胸膜液、心包液、囊液、肿瘤组织、组织、活组织 切片、唾液，或上述物质的组合。在一些实施方式中，所述样品可为食品、饮用水或饲料样 品。
[0037] 作为本发明检测对象的目标核酸可为天然存在或人工合成的核酸，可为来自于动 物、植物或微生物的遗传物质或转录产物。优选地，所述核酸为来自于微生物，特别是工业 微生物或病原体的遗传物质或转录产物。
[0038] 在一些实施方式中，所述目标核酸为来自于如下微生物的核酸：韩瑟勒巴通 氏菌（Bartonella henselae)、伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi)、空肠弯曲杆菌 (Campylobacter jejuni)、胎儿弯曲杆菌（Campylobacterfetus)、沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae)、婴4 鹉热衣原体（Chylamydia psittaci)、大肠杆菌（Escherichia coli)(如 0157:H7 和 K88)、查菲埃立克体（Ehrlichia chafeensis)、肉毒梭菌（Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens)、破伤风梭菌（Clostridium tetani)、奠肠球菌（Enterococcus faecalis)、 流感嗜血杆菌（Haemophilius influenzae)、杜克氏嗜血杆菌（Haemophilius ducreyi)、 粗球抱子菌（Coccidioides immitis)、百日咳博德特氏菌（Bordetella pertussis)、 贝纳特氏立克次体（Coxiella burnetii)、解脲脲原体（Ureaplasma urealyticum)、生 殖支原体（Mycoplasma genitalium)、阴道毛滴虫（Trichomatis vaginalis)、幽门螺 旋杆菌（Helicobacter pylori)、肝螺旋杆菌（Helicobacter hepaticus)、嗜肺军团 菌(Legionella pneumophila)、结核分枝杆菌(My