ynthesis product (Biomics Biotech)或 Epicenter ASF3257 体外转录试剂盒。
[0051 ] sgRNA识别序列的方向没有任何限制。各sgRNA对可识别dsDNA的同一条链或分 别识别两条链。因此，sgRNA的PAM序列可位于靶序列的任一末端。就一对sgRNA而言，各 PAM序列可位于所述靶序列的同一侧或相反侧。
[0052] 本发明的方法可利用一对sgRNA，识别目标DNA中的两个独立的靶序列，使得含 有核酸酶缺陷型Cas9结构域的第一融合蛋白和第二融合蛋白与sgRNA对和目标DNA形 成复合物，从而导致拆分式信号发生蛋白的N端片段和C端片段空间上邻近，自发组装为 有功能的信号发生蛋白。优选地，为能够有足够的空间形成各核酸酶缺陷型Cas9结构 域-sgRNA-目标DNA复合物，sgRNA对中的第一 sgRNA和第二sgRNA所识别的目标DNA中的 靶序列对之间可具有一段间距（interval)。本发明所使用的"间距"是指在不考虑sgRNA 识别序列方向的情况下，一对靶序列彼此最接近的末端之间的最短距离，以bp表示。例如， 当sgRNA对中各sgRNA识别目标DNA的同一条链，且在目标DNA上各靶序列首尾相接时，或 者，当sgRNA对中各sgRNA识别目标DNA的不同链，且一条靶序列的反向互补序列与另一条 靶序列首尾在目标DNA上相接时，识别序列（靶序列）间的间距均为Obp。当sgRNA的识 别位点有重叠时，间距小于〇bp，此时第一融合蛋白和第二融合蛋白与DNA的结合可能产生 竞争。当间距大于Obp时，两个核酸酶缺陷型Cas9结构域与目标DNA上靶序列对结合的空 间阻力较小。当间距大于IOObp时，第一融合蛋白和第二融合蛋白的空间距离较远，信号较 弱。优选的间距为5bp-100bp、更优选17-34bp。当至少一个PAM序列在目标DNA上的位置 位于靶序列对的两条靶序列之间时，所述间距不包含PAM序列。
[0053] SgRNA识别序列的长度一般是19_21bp，为提高特异性，可采用多对SgRNA，识别目 标DNA的多对祀位置的序列，例如识别2个位置、4个位置、6个位置、8个位置等。目标DNA 上各靶位置对之间的间距没有特别的限制。需要指出的是，由于核酸酶缺陷型Cas9对DNA 的识别完全取决于sgRNA的引导，在针对2个以上靶位置时，并不需要另外提供含有核酸酶 缺陷型Cas9结构域的融合蛋白。
[0054] 本发明的拆分式信号发生蛋白的N端片段和C端片段可分别为拆分式蛋白系统的 N端片段和C端片段。拆分式蛋白（split protein)系统又称为蛋白片段互补（protein fragment complementation，PCA)系统，多用于研究蛋白-蛋白相互作用、定位和修饰。例 如，在用于蛋白相互作用检测的PCA系统中，感兴趣的蛋白（即，"诱饵"和"猎物"）分别与 作为报告子的第三蛋白的不完整片段共价连接。如果"诱饵"蛋白和"猎物"蛋白之间存在 相互作用，报告子蛋白的两个片段将彼此足够接近，从而形成其活性能够被测量的有功能 的报告子。通过这样的方法检测"诱饵"和"猎物"是否存在相互作用。
[0055] 拆分式信号发生蛋白的特征在于，拆分后的各片段单独存在时不表现出任何活 性，而当存在与其相互作用的另一片段时，各片段将自发组装成具有活性的拆分式信号发 生蛋白整体，且重新组装后的拆分式信号发生蛋白能够提供易于读取的测量信号。虽然对 某一蛋白而言有多种拆分方式，然而需要保证重新组装后的蛋白具有功能。目前已知的 拆分式蛋白系统例如核糖核酸酶、萤光素酶（萤火虫萤光素酶或海肾（Renilla)萤光素 酶）、β-半乳糖苷酶（lacZ)、β-内酰胺酶、泛素、荧光蛋白例如GFP和EGFP、二氢叶酸 还原酶、拆分式烟草花叶病毒蛋白酶（TEV蛋白酶）、分支酸岐化酶、胸苷激酶、酵母Gal4 蛋白（即酵母双杂交系统）、黏着斑激酶等（例如参见Split-protein systems:beyond binary protein-protein interactions，Sujan S Shekhawat 和 Indraneel Ghosh，Current Opinion in Chemical Biology 2011，15 :789-797 ;Protein fragment complementation strategies for biochemical network mapping，Stephen W Michnick，Current Opinion in Biotechnology 2003,14:610-617)。优选用于本发明的拆分式信号发生蛋白包括焚光 蛋白（例如GFP、EGFP、RFP或其它结构相似的荧光蛋白）、β -半乳糖苷酶、β -内酰胺酶、 萤光素酶（萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶）和二氢叶酸还原酶。本领域已知上述蛋白的 最佳拆分方式、作用方式和检测方法。
[0056] 在一些实施方式中，拆分式信号发生蛋白为萤火虫萤光素酶（SEQ. ID. NO :6)。萤 火虫萤光素酶的拆分方式例如可为：N端片段具有第2-398位氨基酸残基，且C端片段具 有第394-550位氨基酸残基；或者N端片段具有第2-416位氨基酸残基，且C端片段具有 第398-550位氨基酸残基。需要指出的是，在各种情况下，第一个氨基酸为起始密码子对应 的甲硫氨酸，一般不具功能。因此，完整序列可包含或不包含第1位氨基酸。拆分后的萤 火虫萤光素酶N端片段和C端片段在彼此靠近时能够重新组装成为完整的萤火虫萤光素 酶，在 〇2、ATP、Mg2+的存在下催化 D-萤光素发光（550_570nm)。（Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals)。在一些实施方式中，拆分式信号发生蛋白 为海肾萤光素酶（SEQ.ID.N0 :7)。海肾萤光素酶的拆分方式例如可为：N端片段具有第 1-229位氨基酸残基，且C端片段具有第230-311位氨基酸残基。拆分后的海肾萤光素酶 N端片段和C端片段在彼此靠近时能够重新组装成为完整的海肾萤光素酶，在O2的存在 下催化腔肠素（coelenterazine)发光（480nm) (TECHNICAL ADVANCE:Split Iuciferase complementation assay to study protein-protein interactions in Arabidopsis protoplasts， Yukichi Fujikawa 和 Naohiro Kato， The Plant Journal(2007)52， 185-195 !Monitoring Protein-Protein Interactions Using Split Synthetic Renilla Luciferase Protein-Fragment-Assisted Complementation，R. Paulmurugan 等（2003)， Anal. Chem. 75(7)，1584-1589)。能够使用液闪仪、生物发光测定仪、CCD等对上述发光 信号进行分析。在一些实施方式中，拆分式信号发生蛋白为半乳糖苷酶。半乳 糖苷酶的N端片段和C端片段分别称为LacZ α和LacZco。本领域也常用由Δ ω (SEQ. ID. NO :8)和 Δ a (SEQ.ID.N0 :9)重组的 IacZ(Gene expression and cell fusion analyzed by IacZ complementation in mammalian cells， PNAS，1996 !Monitoring protein-protein interactions in intact eukaryotic cells by β -galactosidase complementation，PNAS，1997)。取决于所加入的底物，β-半乳糖苷酶既可催化能够产 生光信号的反应，也可催化产生电信号的反应。β -半乳糖苷酶催化5-溴-4-氯-3-吲 哚基-β -D-吡喃半乳糖苷（X-Gal)水解生成半乳糖和乙酸-5-溴-4-氯-3-羟基吲哚， 后者会自发二聚化并氧化成蓝色产物5, 5' -二溴-4, 4' -二氯-靛蓝。β -半乳糖苷酶 还催化邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG)水解生成半乳糖和黄色产物邻硝基苯酚。 可检测吸光度的变化来检测β-半乳糖苷酶的活性。同时，β-半乳糖苷酶可催化对氨 基苯基-β -D-吡喃半乳糖苷生成电活性产物对氨基苯酚，可利用电化学工作站来检测 对氨基苯酸的氧化反应（On-chip electrochemical measurement of b-galactosidase expression using a microbial chip，Chem. Commun.，2004, 248-249) 〇 在一些实施方 式中，拆分式信号发生蛋白为无信号肽的内酰胺酶（SEQ.ID.N0:10)。β-内酰胺酶 的第2-25位氨基酸为信号肽。β -内酰胺酶的拆分方式例如可为：N端片段可为1-171 位氨基酸残基，且C端片段为172-264位氨基酸残基。为增加稳定性，还可对序列进行 Μ157Τ 的突变(Beta-lactamase protein fragment complementation assays as in vivo and in vitro sensors of protein protein interactions, Nat Biotechnol.， 2002,20(6) :619-22)。β-内酰胺酶催化盘尼西林水解为penicillinoic acid并引 起pH改变，该pH的改变可通过电化学方法测量（Penicillinase-based amperometric biosensor for penicillin G，dx. doi. org/10. 1016/j. elecom. 2013. IL 022) 〇 在一些 实施方式中，拆分式信号发生蛋白为二氢叶酸还原酶（SEQ.ID.N0 :11)。二氢叶酸还原 酶的拆分方式例如可为：N端片段为1-86位氨基酸残基，且C端片段为87-159位氨基 酸残基（C. V. Gegg，K. E. Bowers, and C. R. Matthews, Protein Sci. 6, 1885 (1997))。二 氢叶酸还原酶催化二氢叶酸还原为四氢叶酸的反应，该反应中NADPH为电子供体。可利 用本领域已知的多种方法对NADPH的量进行检测，例如SIGMA-ALDRICH Dihydrofolate Reductase Assay Kit(CS0340-1KT)(Construction and evaluation of the kinetic scheme associated with dihydrofolate reductase from Escherichia coli)〇 在一 些实施方式中，拆分式信号发生蛋白为荧光蛋白，例如GFP(SEQ. ID. NO :12)及其各种变 体、RFP等。EGFP为具有F64L和S65T突变的GFP。拆分式信号发生蛋白为GFP或EGFP 时，拆分方式例如可为：N端片段为1-157位氨基酸残基，且C端片段为158-238位氨基酸 残基(Indraneel Ghosh, Andrew D. Hamilton, Antiparallel Leucine Zipper-Directed Protein Reassembly !Application to the Green Fluorescent Protein) 〇 完整的 GFP 在 488nm附近被激发时，将在509nm附近发射焚光（Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo, Mol. BioSyst. , 2012, 8, 2036-2040 ；Split-EGFP Screens for the Detection and Localisation of Protein - Protein Interactions in Living Yeast Cells, Emma Barnard and David J. Timson,Amir Sharon(ed.), Molecular and Cell Biology Methods for Fungi, Methods in Molecular Biology, vol. 638)。不需要添加另外的反应物或催化 剂而直接对荧光蛋白进行激发，并检测发生光。本领域技术人员知晓能够利用酶标仪、激光 器和光电倍增管、显微镜系统等实施上述检测。需要指出的是，上述信号发生蛋白的其他拆 分方式也在本发明的范围内。
[0057] 本发明的拆分式信号发生蛋白的N端片段和C端片段也可为具有特异性相互作用 的两个蛋白。该蛋白相互作用能够通过后续的信号放大反应被检测。例如，拆分式信号发 生蛋白的N端片段和C端片段可分别为荧光共振能量转移技术中的荧光供体蛋白和荧光受 体蛋白。荧光共振能量转移是指两个荧光分子间的能量转移机制。荧光供体在其激发波长 下被激发。随后该激发态非辐射地转移至第二分子（荧光受体）。或者，拆分式信号发生蛋 白的N端片段和C端片段可分别为抗原蛋白和抗体蛋白，从而能够以类似ELISA的方式，利 用第二抗体对信号进行放大。拆分式信号发生蛋白的N端片段和C端片段也可为受体及其 配体（激动剂或诘抗剂）。
[0058] 依赖于所采用的拆分式信号发生蛋白，拆分式信号发生蛋白的各片段可直接缀合 至核酸酶缺陷型Cas9的N末端或C末端，只要保证N端片段和C端片段重新组装后仍具有 活性即可。或者，可用连接肽（linker p印tide)将拆分式信号发生蛋白的一个片段与核酸 酶缺陷型Cas9缀合。连接肽不包含任何活性结构域，优选由甘氨酸和/或丝氨酸组成，优选 为6-12个氨基酸的肽。在一个实施方式中，连接肽的序列为GGGGSGGGGS(SEQ. ID. NO :13)。
[0059] 在不影响活性的情况下，可通过在融合蛋白的N端或C端添加标签以便于表达和 纯化。所述标签包括但不限于组氨酸标签、c-myc标签、Halo标签、Flag标签等。
[0060] 如上所述，产生可检测信号的反应及其检测方法取决于所采用的信号发生蛋白。 在本文的其他部分已经列举了拆分式信号发生蛋白及其反应机理和检测方法的情况下，本 领域能够知晓对于各拆分式信号发生蛋白而言所需要加入的底物和/或酶。可对各反应物 的浓度和反应条件进行调整，获得更强的信号以提高灵敏度。
[0061] 在本发明方法的步骤（3)和（4'）中，孵育条件的选择使得核酸酶缺陷型Cas9蛋 白能够被sgRNA导向至目标DNA。例如，可在37°C孵育20min至2h。
[0062] 考虑重新组装的效率，优选第一融合蛋白和第二融合蛋白为等浓度混合，各sgRNA 对等浓度混合。当针对目标DNA的两个位点时，所提供的融合蛋白总浓度、sgRNA对和目标 DNA的摩尔比优选5-30:80-150:1、更优选10:100:1。采用过高的融合蛋白浓度时非特异性 结合的可能性升高。考虑到所针对的位点增多后的稀释作用，为了得到更强的信号，可适当 提高融合蛋白的浓度。
[0063] 优选地，可首先将各sgRNA对中的一条sgRNA与第一融合蛋白共同孵育，并将另 一 sgRNA与第二融合蛋白共同孵育，随后再将二者混合并加入样品或步骤（3'）获得的目标 DNA，进一步提尚检测彳目号。
[0064] 需要指出的是，虽然在本发明的上下文中给出了分别对目标DNA和目标RNA进行 检测的方法。在实际应用中，可对上述两种方法进行整合，同时对多个目标DNA和目标RNA 进行检测。例如，可通过如下的步骤对目标DNA和目标RNA进行检测：
[0065] (1 "）提供第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中，所述第一融合蛋白为拆分式信号 发生蛋白N端片段与核酸酶缺陷型Cas9蛋白的融合蛋白，所述第二融合蛋白为拆分式信号 发生蛋白C端片段与核酸酶缺陷型Cas9蛋白的融合蛋白，由所述N端片段和所述C端片段 构成的所述信号发生蛋白能够参与产生可检测信号的化学反应；
[0066] (2"）针对与所述目标RNA逆转录产物对应的DNA序列和目标DNA中的多对的靶 序列，设计并合成sgRNA对；
[0067] (3"）针对所述样品中的目标RNA，实施逆转录并获得所对应的目标DNA。
[0068] (4"）将样品、步骤（3"）获得的目标DNA、步骤（1"）提供的所述第一融合蛋白和 所述第二融合蛋白、步骤（2"）获得的各sgRNA对以及参与产生可检测信号的化学反应的其 它反应物和/或催化剂共同孵育，生成可检测信号；以及
[0069] (5"）对所述可检测信号进行测量。
[0070] 该方法可有利地用于同时对多种不同类型的微生物病原体（例如RNA病毒和DNA 病毒）的检测中。本领域技术人员知晓上文描述的技术内容也可恰当地用于该方法中。 [0071 ] 对目标核酸进行检测的试剂盒
[0072] 本发明还提供了用于实施本发明方法的试剂盒。所述试剂盒包含第一融合蛋白和 第二融合蛋白，其中，所述第一融合蛋白为拆分式信号发生蛋白N端片段与核酸酶缺陷型 Cas9蛋白的融合蛋白，所述第二融合蛋白为拆分式信号发生蛋白C端片