214] 本实施例采用PCR作为预处理，采用与实施例1相同的融合蛋白，检测对象的设置 与实施例2相同。在扩增阴性对照中，采用相同浓度的PSB1C3质粒作为扩增模板。
[0215] 在预处理步骤中，利用能够对枯草芽孢杆菌yraO基因片段进行特异性扩增的引 物对（正向引物：aacgaacagctgaaatggaagtgc ;反向引物：gcgcattcttggaggtgtaatatg)，实 施常规PCR并对扩增产物（大小为2k)进行回收。初始样品中枯草芽孢杆菌基因组DNA的 浓度为318. 4ng/ μ L(与实施例2相同）。以回收后的产物作为样品（其中DNA的终浓度为 3ηΜ)，按与实施例2相同的步骤，加入融合蛋白和sgRNA对，实施本发明的检测方法。
[0216] 如图6所示，与实施例2相比，采用PCR作为预处理将检测信号的相对强度提高了 将近8倍。采用阴性扩增模板（PSB1C3质粒）所获得的信号也远小于阳性模板。此外，采 用不同SgRNA对能够获得的信号强度有所差别。如图7所示，在所采用的三对SgRNA对中， 采用sgRNA Pair 8的灵敏度最高，特异性最弱。特别地，增加 SgRNA对的数量可增加本发 明方法的特异性。
[0217] 为了排除PCR体系对荧光值测定的影响，采用pSBlC3质粒作为扩增模板。由于不 能产生任何扩增产物，从而对由PCR体系本身造成的荧光进行检测。另外，为了证明SgRNA 的特异性，还采用了不能识别目标DNA的对照SgRNA对（3L、3R)(图6和图8的灰色棒）。 这些对照的结果表明，只有sgRNA对与待检测的DNA匹配时才能获得更高的检测信号。
[0218] 为了测定本实施例方法的灵敏度，对PCR产物进行稀释，采集各浓度下的相对信 号。在PCR产物浓度低至0.024nM(对应于枯草芽孢杆菌基因组的浓度为2. 55ng/yL)时， 仍能获得高于空白对照和阴性对照的信号（图7)。利用PCR进行预处理显著提高了本发明 方法的灵敏度。
[0219] 实施例4
[0220] 本实施例采用等温扩增作为预处理，采用与实施例1相同的融合蛋白，检测对象 为Target 20 (即实施例1和图3中间距为20bp的目标序列）。作为扩增阴性对照，采用相 同浓度的PSB1C3质粒作为扩增模板。本实施例使用的sgRNA对与实施例1相同，为3L和 3R〇
[0221] 使用三对不同的引物实施Bst等温扩增。其中，扩增228bp片段使用的引物对为 ggccgcccttgcccttttttgccgga 和 gcggccgcgtcgatggagcaagtgga。扩增 524bp 片段的弓丨物 对为 ggccgcccttgcccttttttgccgga 和 gcggcccccagatttcgggaggttgg。扩增 1060bp 片段的 引物对为 ggccgcccttgcccttttttgccgga 和 gcggccggccatggtaactcaagcgac 〇
[0222] 利用Loopamp朗报DNA扩增试剂盒（SLP204)实施等温扩增。扩增体系为
[0223] 2X 反应液（RM) 12.5μ1 蒸馏水（DW) 9.5μ1 BstDNA聚介酚 ΙμL 上游引物（40μΜ) Ipl 下游引物（40μΜ) Ipl DNA 2μ1
[0224] 反应温度为63°C或60°C、60min，随后在80°C加热IOmin灭活Bst DNA聚合酶； 参见 Two Methods for Increased Specificity and Sensitivity in Loop-Mediated Isothermal Amplificatioru扩增产物的电泳检测结果如图9(a)所示D
[0225] CN 105177110 A 说明书 24/24 页
[0226] 其中，泳道19加入高浓度的Target 20质粒。泳道20为加入pSBlC3质粒。泳道 M为Marker (BM5000DNA Marker，DM0203)。由于未对等温扩增产物进行纯化，未检测浓度。 I X表示20 μ L孵育体系中加入2 μ L等温扩增产物，5 X表示先将等温扩增产物稀释5倍 后，再进行后续操作。结果如图9(b)所示。采用不同的等温扩增条件对不同的片段扩增获 得的信号强度有所差别，但均显著高于扩增阴性对照。
[0227] 上述结果表明，本发明的方法具有优异的灵敏度和特异性。利用PCR或等温扩增 作为预处理可进一步提高灵敏度。
【主权项】
1. 一种对样品中是否存在目标核酸进行检测的方法，所述目标核酸为目标DNA，所述 方法包含如下步骤： (1) 提供第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中，所述第一融合蛋白为拆分式信号发生蛋 白N端片段与核酸酶缺陷型Cas9蛋白的融合蛋白，所述第二融合蛋白为拆分式信号发生蛋 白C端片段与核酸酶缺陷型Cas9蛋白的融合蛋白，由所述N端片段和所述C端片段构成的 所述信号发生蛋白能够参与产生可检测信号的化学反应； (2) 针对所述目标DNA中的一对或多对的靶序列，设计并合成SgRNA对； (3) 将所述样品、步骤（1)提供的所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白、步骤（2)获 得的各sgRNA对以及参与产生可检测信号的化学反应的其它反应物和/或催化剂共同孵 育，生成可检测信号；以及 (4) 对所述可检测信号进行测量。2. -种对样品中是否存在目标核酸进行检测的方法，所述目标核酸为目标RNA，所述 方法包含如下步骤： (I')提供第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中，所述第一融合蛋白为拆分式信号发 生蛋白N端片段与核酸酶缺陷型Cas9蛋白的融合蛋白，所述第二融合蛋白为拆分式信号发 生蛋白C端片段与核酸酶缺陷型Cas9蛋白的融合蛋白，由所述N端片段和所述C端片段构 成的所述信号发生蛋白能够参与产生可检测信号的化学反应； (2')针对所述目标RNA所对应的目标DNA中的一对或多对的靶序列，设计并合成sgRNA对； (3')针对所述样品中的所述目标RNA，实施逆转录并获得所对应的目标DNA; (4')将步骤（3')获得的目标DNA、步骤（I')提供的所述第一融合蛋白和所述第 二融合蛋白、步骤（2')获得的各sgRNA对以及参与产生可检测信号的化学反应的其它反 应物和/或催化剂共同孵育，生成可检测信号；以及 (5')对所述可检测信号进行测量。3. 如权利要求1或2所述的方法，其中，所述样品为环境样品，例如为地下水、中水、 海水、采矿废料的样品；或者，所述样品为生物样品，特别是来自受试者的样品，例如为选自 于如下样品中的一种或多种：面颊拭子、血液、血清、血浆、痰、脑脊液流体、尿液、泪液、肺泡 分离物、胸膜液、心包液、囊液、肿瘤组织、组织、活组织切片、唾液；或者，所述样品来自于食 品、饮用水或饲料；和/或 其中，所述目标核酸为天然存在或人工合成的核酸，例如来自于动物、植物或微生物的 遗传物质或转录产物，优选地，所述核酸为来自于微生物，特别是工业微生物或病原体的遗 传物质或转录产物；和/或 其中，所述靶序列为所述目标核酸的特征序列，例如为转基因片段序列、在疾病中最常 发生改变的分子的特征序列或种属特征序列，特别地，所述靶序列为结核杆菌的种属特征 序列。4. 如权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述样品为经过预处理的样品或未经 预处理的样品；优选地，使用选自于如下的方法对所述样品进行预处理：离心、过滤、超 声、匀浆化、加热、冷冻、解冻、机械处理和/或PCR;特别地，通过选自于由如下方法所 组成的组中的等温扩增方法实施所述预处理：连接酶链反应、自持序列复制、链置换扩 增、切口酶扩增反应、滚环扩增、环介导等温扩增、交叉引物恒温扩增、Q-P扩增系统和 OneCutEventAmplificatioN〇5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述核酸酶缺陷型Cas9为酿脓链球菌、 嗜热链球菌、脑膜炎奈瑟菌或齿垢密螺旋体的核酸酶缺陷型Cas9,优选具有SEQ.ID.NO: 1-SEQ.ID.NO:5的氨基酸序列的核酸酶缺陷型Cas9,优选dCas9 ;和/或 其中，利用连接肽连接所述核酸酶缺陷型Cas9结构域和所述拆分式信号发生蛋白的N端片段或C端片段，所述连接肽优选由甘氨酸和/或丝氨酸组成，具有6-12个氨基酸残基， 例如具有SEQ.ID.NO: 13的氨基酸序列；和/或 其中，所述融合蛋白还可包含方便其表达纯化的标签，例如由6个组氨酸组成的标签； 和/或 其中，所述拆分式信号发生蛋白选自于由如下蛋白所组成的组中的任一种：核糖核酸 酶、萤光素酶、(6-半乳糖苷酶、(6-内酰胺酶、泛素、荧光蛋白、二氢叶酸还原酶、TEV蛋白 酶、分支酸岐化酶、胸苷激酶、酵母Gal4蛋白和黏着斑激酶；当所述拆分式信号发生蛋白为 萤火虫萤光素酶，所述参与产生可检测信号的化学反应的其它反应物包含ATP、D-萤光素 和Mg2+，所述可检测信号为发光信号，优选地，所述萤火虫萤光素酶具有SEQ.ID.NO:6的氨 基酸序列，优选地，所述N端片段具有第2-398位氨基酸残基，且C端片段具有第394-550 位氨基酸残基；或者，所述N端片段具有第2-416位氨基酸残基，且所述C端片段具有第 398-550位氨基酸残基；当所述拆分式信号发生蛋白为海肾萤光素酶，所述参与产生可检 测信号的化学反应的其它反应物包含腔肠素，所述可检测信号为发光信号，优选地，所述海 肾萤光素酶具有SEQ.ID.NO:7的氨基酸序列，优选地，所述N端片段具有第1-229位氨基酸 残基，且所述C端片段具有第230-311位氨基酸残基；当所述拆分式信号发生蛋白为(6-半 乳糖苷酶，所述参与产生可检测信号的化学反应的其它反应物包含5-溴-4-氯-3-吲哚 基-P-D-吡喃半乳糖苷或邻硝基苯-P-D-吡喃半乳糖苷，所述可检测信号为吸光值，或 者所述参与产生可检测信号的化学反应的其它反应物包含对氨基苯基-D-吡喃半乳糖 苷，所述可检测信号为电信号，优选地，所述P_半乳糖苷酶的N端片段和C端片段分别为 LacZa和LacZ?或上述片段的突变体，优选地，所述N端片段和C端片段分别具有SEQ. ID.NO:8和SEQ.ID.NO:9的氨基酸序列；当所述拆分式信号发生蛋白为P-内酰胺酶，所述 参与产生可检测信号的化学反应的其它反应物包含盘尼西林，所述可检测信号为电信号， 优选地，所述P-内酰胺酶具有SEQ.ID.NO:10的氨基酸序列，优选地，所述N端片段具有 第1-171位氨基酸残基，且所述C端片段具有第172-264位氨基酸残基，或者所述P-内酰 胺酶具有SEQ.ID.NO: 10的氨基酸序列，并具有M157T突变；当所述拆分式信号发生蛋白为 二氢叶酸还原酶，所述参与产生可检测信号的化学反应的其它反应物包含NADPH，所述可检 测信号为荧光信号，优选地，其中，所述二氢叶酸还原酶具有SEQ.ID.N0 :11的氨基酸序列， 优选地，所述N端片段具有第1-86位氨基酸残基，且所述C端片段具有第87-159位氨基 酸残基；当所述拆分式信号发生蛋白为荧光蛋白，不需要添加其它反应物或催化剂，所述可 检测信号为荧光信号，优选地，所述荧光蛋白为GFP(SEQ.ID.N0 :12)或EGFP，优选地，所述 N端片段具有SEQ.ID.NO: 12第1-157位氨基酸残基，且所述C端片段具有SEQ.ID.NO: 12 第158-238位氨基酸残基；当所述拆分式信号发生蛋白的各片段分别为抗原蛋白和一抗蛋 白，所述参与产生可检测信号的化学反应的其它反应物包含辣根过氧化物酶标记的二抗、 过氧化氢和显色底物，所述检测信号为吸光度或荧光信号，优选地，所述显色底物为选自于 由如下底物所组成的组中的一种：邻联茴香胺、邻甲苯胺蓝、碘化钾、3, 3'，5, 5'-四甲基 联苯胺和丁香醛连氮、二磷酸伯氨喹、噻唑黄G和无水金胺0。6. 如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，通过如下方法设计并通过体外转录合 成SgRNA:首先在所述目标DNA序列中搜寻"NGG"序列，其中N表示任意核苷酸，设计针对 该位点的sgRNA;随后通过重叠PCR获得所述SgRNA的体外转录模板；利用T7RNA聚合酶 进行体外转录，获得所述sgRNA;特别地，所述SgRNA的体外转录模板包含T7启动子、crRNA 以及tracrRNA序列。7. 如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述目标DNA的各靶序列位置间具有间 距，所述间距>〇bp，例如为5bp_100bp、更优选17bp_34bp。8. 如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，在步骤（3)或（4')中，所述第一融合 蛋白和所述第二融合蛋白为等浓度混合，各sgRNA对为等浓度混合，优选地，所提供的融合 蛋白总浓度、sgRNA对和目标DNA的摩尔比优选5-30:80-150:1、更优选10:100:1 ;优选地， 在步骤（3)或（4')中，将各sgRNA对中的一条sgRNA与第一融合蛋白共同孵育，并将另一 sgRNA与第二融合蛋白共同孵育，随后再将二者混合并加入样品或步骤（3')获得的目标 DNA09. 一种试剂盒，所述试剂盒包含：第一融合蛋白和第二融合蛋白，所述第一融合蛋白 为拆分式信号发生蛋白N端片段与核酸酶缺陷型Cas9蛋白的融合蛋白，所述第二融合蛋白 为拆分式信号发生蛋白C端片段与核酸酶缺陷型Cas9蛋白的融合蛋白，由所述N端片段和 所述C端片段构成的所述信号发生蛋白能够参与产生可检测信号的化学反应， 优选地，所述试剂盒还包含参与产生可检测信号的化学反应的反应物和/或催化剂； 优选地，所述核酸酶缺陷型Cas9为酿脓链球菌、嗜热链球菌、脑膜炎奈瑟菌或齿垢密 螺旋体的核酸酶缺陷型Cas9,优选具有SEQ.ID.NO: 1-SEQ.ID.NO:5的氨基酸序列的核酸酶 缺陷型Cas9,优选dCas9 ; 优选地，利用连接肽连接所述核酸酶缺陷型Cas9结构域和所述拆分式信号发生蛋白 的N端片段或C端片段，所述连接肽优选由甘氨酸和/或丝氨酸组成，具有6-12个氨基酸 残基，例如具有SEQ.ID.NO: 13的氨基酸序列； 优选地，所述融合蛋白还可包含方便其表达纯化的标签，例如由6个组氨酸组成的标 签； 优选地，所述拆分式信号发生蛋白选自于由如下蛋白所组成的组中的任一种：核糖核 酸酶、萤光素酶、P-半乳糖苷酶、P-内酰胺酶、泛素、焚光蛋白、二氢叶酸还原酶、TEV蛋白 酶、分支酸岐化酶、胸苷激酶、酵母Gal4蛋白和黏着斑激酶；当所述拆分式信号发生蛋白为 萤火虫萤光素酶，所述参与产生可检测信号的化学反应的其它反应物包含ATP、D-萤光素 和Mg2+，优选地，所述萤火虫萤光素酶具有SEQ.ID.NO:6的氨基酸序列，优选地，所述N端片 段具有第2-398位氨基酸残基，且所述C端片段具有第394-550位氨基酸残基；或者，所述 N端片段具有第2-416位氨基酸残基，且所述C端片段具有第398-550位氨基酸残基；当所 述拆分式信号发生蛋白为海肾萤光素酶，所述参与产生可检测信号的化学反应的其它反应 物包含腔肠素，优选地，所述海肾萤光素酶具有SEQ.ID.NO:7的氨基酸序列，优选地，所述N 端片段具有第1-229位氨基酸残基，且所述C端片段具有第230-311位氨基酸残基；当所述 拆分式信号发生蛋白为P-半乳糖苷酶，所述参与产生可检测信号的化学反应的其它反应 物包含5-溴-4-氯-3-吲哚基-0 -D-吡喃半乳糖苷、邻硝基苯-0 -D-吡喃半乳糖苷或对 氨基苯基-0 -D-吡喃半乳糖苷，优选地，所述0 -半乳糖苷酶的N端片段和C端片段分别 为LacZ a和LacZ ?或上述片段的突变体，优选地，所述N端片段和C端片段分别具有SEQ. ID. NO :8和SEQ. ID. NO :9的氨基酸序列；当所述拆分式信号发生蛋白为P -内酰胺酶，所述 参与产生可检测信号的化学反应的其它反应物包含盘尼西林，优选地，所述(6-内酰胺酶 具有SEQ. ID. NO : 10的氨基酸序列，优选地，所述N端片段具有第1-171位氨基酸残基，且 所述C端片段具有第172-264位氨基酸残基，优选地，所述P -内酰胺酶具有SEQ. ID. NO : 10的氨基酸序列，并具有M157T突变；当所述拆分式信号发生蛋白为二氢叶酸还原酶，所 述参与产生可检测信号的化学反应的其它反应物包含NADPH，优选地，所述二氢叶酸还原 酶具有SEQ. ID. NO : 11的氨基酸序列，优选地，所述N端片段具有第1-86位氨基酸残基，且 所述C端片段具有第87-159位氨基酸残基；当所述拆分式信号发生蛋白为荧光蛋白，优选 地，所述荧光蛋白为GFP(SEQ. ID.N0 :12)或EGFP，优选地，所述N端片段具有SEQ. ID.N0 : 12第1-157位氨基酸残基，且所述C端片段具有SEQ. ID. NO : 12第158-238位氨基酸残基； 当所述拆分式信号发生蛋白的各片段分别为抗原蛋白和一抗蛋白，所述参与产生可检测信 号的化学反应的其它反应物包含辣根过氧化物酶标记的二抗、过氧化氢和显色底物，所述 显色底物优选选自于由如下底物所组成的组中的一种：邻联茴香胺、邻甲苯胺蓝、碘化钾、 3,3'，5,5'-四甲基联苯胺和丁香醛连氮、二磷酸伯氨喹、噻唑黄G和无水金胺0。10.权利要求1-8中任一项所述的方法或权利要求9所述的试剂盒在污染检测或转基 因检测方面的用途。
【专利摘要】本发明涉及利用拆分式信号发生蛋白与核酸酶缺陷型Cas9蛋白的融合蛋白对样品中是否存在目标核酸进行检测的体外方法、试剂盒和设备。
【IPC分类】C12Q1/44, G01N21/64, C12Q1/26, C12Q1/25, C12Q1/66, C12Q1/48
【公开号】CN105177110
【申请号】
【发明人】娄春波, 欧阳颀, 张益豪, 魏伟佳
【申请人】中国科学院微生物研究所, 北京大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月11日