自于由如下底物所组成的组 中的一种：
[0149] 邻联茴香胺、邻甲苯胺蓝、碘化钾、3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺和丁香醛连氮、二磷 酸伯氨喹、噻唑黄G和无水金胺0。
[0150] 56. -种设备，所述设备包含孵育模块及检测模块，所述孵育模块用于对如段落 1-34中任一项所述的步骤（3)或（4'）的反应混合物进行孵育，所述检测模块用于实施段落 1-34中任一项所述的步骤（4)或（5'）。
[0151] 57.段落1-34中任一项所述的方法、段落35-55中任一项所述的试剂盒或段落56 所述的设备在疾病诊断、污染检测或转基因检测方面的用途。
[0152] 下列实施例阐明了本发明的一些实施方式和方面。对相关领域技术人员来说显而 易见的是，可以在不改变本发明的精神或范围的情况下进行各种修改、增加、替换等，这些 修改和变化都涵盖于所附权利要求书所限定的本发明的范围之内。下述实施例仅用于说明 目的，不以任何方式对本发明进行限制。
[0153] 实施例
[0154] 实施例1
[0155] 实施例1采用拆分式萤火虫萤光素酶（核苷酸序列如SEQ. ID. NO : 14所示）作为信 号发生蛋白，其N端片段（Nf Iuc)具有由第1位-第1248位的核苷酸编码的氨基酸序列，C 端片段（Cfluc)具有由第1194位-第1650位的核苷酸编码的氨基酸序列。采用dCas9(核 苷酸序列如SEQ. ID. NO :15所示）作为核酸酶缺陷型Cas9。所述第一融合蛋白为具有连接 肽和组氨酸标签并在N端融合有萤火虫萤光素酶N端片段的dCas9蛋白（Nf luc-dCaS9)，第 二融合蛋白为具有连接肽和组氨酸标签并在N端融合有萤火虫萤光素酶C端片段的dCas9 蛋白（Cfluc-dCas9)。其中，编码连接肽的核苷酸序列为GGTGGCGGTGGCtctGGTGGCGGTGGCTC T(SEQ. ID. NO :16)。
[0156] 本实施例采用的目标DNA为SEQ. ID. NO :17、对照DNA为pSBlC3质粒（其序列参 J^http://parts.igem.org/cgi/partsdb/puttext.cgi)^PpET 28a质粒（Genbank Access NO :KJ782405. 1)。靶序列对为目标DNA的第1189-1208位和第1236-1255位序列，针对 上述祀序列对设计SgRNA对，称为3L和3R(识别序列分别为tcttcagggaaaagctgggt和 ttaggcccgtttcatcaggaa) 〇
[0157] 实施例中所使用的培养基和试剂：
[0158] LB培养基：
[0159] 在IL的蒸馏水中加入
[0160] 蛋白胨：10g(0X0ID LP0042);
[0161] NaCl :10g(北京化工厂，纯度彡 99. 5%，pH :5.0 ~8.0);
[0162] 酵母粉：5g(0X0ID LP0021)，
[0163] 121°C 高压灭菌 20min。
[0164] PBS 缓冲液：
[0165] 恥(：1:7.98(北京化工厂，纯度彡99.5%，？!1:5.0~8.0);
[0166] 此1:0.28(北京化工厂，纯度彡99.5%，？!1:5.0~8.0) ;
[0167] 腿2卩04:0 . 248(北京化工厂，纯度彡99.5%，？!1:4.2~4.5);
[0168] 1(2即04:1.88(北京化工厂，纯度彡99.0%，？!1 :8.9~9.4)，
[0169] 溶于800ml蒸馏水中，最后加蒸馏水定容至1L，用HCl (分析纯，国药集团化学试剂 有限公司）调节溶液的pH值至7. 4。
[0170] 融合蛋白的制备和保存
[0171] L 构建 pET21a-6XHis-Nfluc-dCas9 表达载体
[0172] 米用 pET2 Ia 质粒（序列参见 https ://www. addgene. org/ vector-database/2549/)作为出发质粒，在T7_tag ATG起始密码子后插入编码6组氨酸标 签的DNA序列、编码萤火虫萤光素酶的N端或C端片段的DNA序列、编码连接肽和dCas9的 DNA序列，构建重组质粒。重组质粒表达Nfluc-dCas9或Cfluc-dCas9。
[0173] 用连接产物转化DH5 α感受态细胞，挑取克隆，扩增质粒。
[0174] 2.融合蛋白的表达和纯化
[0175] 将提取的阳性克隆的质粒转化大肠杆菌BL21感受态，挑取单克隆菌落接种于 50mL LB(Amp抗性）培养基中，37°C过夜培养。第二天，将过夜培养物以1:100的比例接种 到含有Amp抗性的2L LB培养基的大瓶中，37°C摇床培养至0D600约为0. 6~0. 8时，加入 终浓度为〇· 2mM的IPTG，16°C继续培养16h。随后，在4°C、6, OOOrpm离心15min，收集菌体。 每21^菌体用约5〇11^预冷的？85(?!17.4)悬浮。将悬浮液置于冰上，超声裂解菌体（5(：此犯'2 JY 92-IID超声波细胞粉碎机，超声6s，间歇12s，300W，99次）。将裂解液15, 000rpm、4°C 离心30min，去除沉淀，收集上清液。将上清利用0. 22 μ m的滤膜进行过滤。
[0176] 在4°C，利用蠕动栗以l_2ml/min的速度将含有融合蛋白的上清液注入至5ml His Trap预装柱（GE)，从而使得带组氨酸标签（6XHis tag)的蛋白与His-Beads结合。利用 AKTA(Ge Healthcare Life Sciences)进行蛋白质的分离纯化。其中，A液为20mM Tris， 500mM NaCl，pH8.0。B 液为 20mM Tris，500mM NaCl，300mM 咪唑，ρΗ8·0。进行梯度洗脱，咪 唑浓度梯度为：20mM，50mM，lOOmM，200mM，300mM。
[0177] 对不同梯度下洗脱的蛋白进行10% SDS-PAGE电泳检测，确定合适的咪唑洗脱浓 度为200mM。可利用5mM咪唑洗脱杂质后，利用200mM咪唑洗脱目的蛋白。
[0178] 然后用分子筛凝胶层析对洗脱后的蛋白进行纯化。
[0179] 具体如下：用截留分子量为30kD(MWC0)的浓缩管实施换液和浓缩至体积为 3_5mL。使用凝胶层析柱Hiload 16/60,设定系统，用分子筛缓冲液（分子筛缓冲液（20mM !fepes，150mM KC1，PH:7. 5)平衡柱子约1个柱体积。用分子筛缓冲液洗上样环，吸取上一 步洗脱的蛋白样品，进行上样，观察280nM的紫外吸收值，当吸收值到达30mAU以上，收集样 品。利用SDS-PAGE蛋白电泳鉴定收集的样品。判断蛋白纯化效果。最后将收集到的蛋白 用浓缩管浓缩至5mg/ml以上。
[0180] 3.融合蛋白的浓度的测定
[0181] 利用 BCA protein assay 试剂盒（全式金，Easy II Protein Quantitative Kit (BCA)DQ111-01)，依照制造商的说明实施蛋白浓度的测定：
[0182] 取A液980.4ml和B液19. 6ml，混匀。取蛋白稀释到50μ1，加入混合的A液和B 液，混匀。37度水浴将混合物孵育30min。待温度恢复至室温后，0D562测吸光度值，然后 计算蛋白浓度mg/ml。计算方法为：蛋白浓度=OD值X蛋白稀释倍数X标准曲线斜率。
[0183] 4.融合蛋白的保存
[0184] 利用50v/v%的甘油，在-20°C下对蛋白进行保存。长期保存时加入ImM DTT， 在-80°C保存。
[0185] SgRNA的设计和制备
[0186] 利用 http://crispr_era.stanford.edu/InitAction.action，（2015，Honglei Liu, Zheng Wei, Antonia Dominguez, Yanda Li, Xiaowo Wang, and Lei S. Qi ；CRISPR-ERA:a comprehensive design tool for CRISPR-mediated gene editing, repression and activation)在线工具设计sgDNA。
[0187] 首先构建T7启动子驱动的sgRNA表达载体，将包含启动子、sgDNA序列及终止子 的片段进行PCR扩增，纯化回收。使用T7RNA快速高效合成试剂盒（NEB公司，#E2050S)对 PCR产物进行RNA体外转录，使用RNAclean RNA清洁纯化试剂盒（博迈德公司，RN1402)进 行纯化。将纯化后的sgRNA在-20°C冻存。所构建的sgRNA顺序包含crRNA序列、tracRNA 序列和识别序列。其结构参见 A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity，2012 中的描述。
[0188] 检测方法
[0189] 用分子筛缓冲液将融合蛋白储液稀释至0. 5 μ M，用DEPC水将sgRNA稀释至 IOOnM0
[0190] 采用如下30 μ 1体系，分别将工作浓度的单个sgRNA与单个融合蛋白在25°C孵育 IOmin :第一 sgRNA与第一融合蛋白、第二sgRNA与第二融合蛋白；或者，第一 sgRNA与第二 融合蛋白、第二sgRNA与第一融合蛋白。对于各sgRNA和各融合蛋白而言，采用相同的工作 浓度。这样的处理可提高信号强度。
[0191] 随后将分开孵育的两部分溶液等体积混合，加入目标DNA或对照DNA(pSBlC3质 粒）后，37°C孵育3Omin。
[0192] 将体系转移至预热至 37°C 的 96 孔板（Corning CosUirt? Assay Plate 3925)中， 每孔加入1〇〇1^1^预热至37<€的萤光素酶测定试剂（1^1(^€6抑86 48837 1^386111：，？1'01116区已， E4550)，立即放入酶标仪测量（Thermo Varioskan? Flash Multimode Reader#5250030)， 读取发光信号。测量参数为：单孔测量时间为1000ms，动态范围为自动或低。
[0193] 研究1 :融合蛋白的最适工作浓度
[0194] 本研究对融合蛋白的最适工作浓度进行测定。所使用的各SgRNA的工作浓度为 150nM，目标DNA的终浓度为30nM。所测试的各融合蛋白的工作浓度分别为3nM、6nM、15nM 和30nM。实验发现，融合蛋白浓度过小时信号较弱。而当融合蛋白工作浓度为30nM时，由 于非特异性相互作用，仅加入sgRNA对中的一种SgRNA也出现阳性信号。可以看出，在本实 施例的体系中合适的融合蛋白工作浓度为15nM。
[0195] 研究2 :PAM序列以及融合蛋白的相对位置对荧光信号强度的影响
[0196] 为了研究融合蛋白的不同构建方式对检测信号强度的影响，本发明采用了与 前述相同的方法构建了 dCas9融合在拆分式萤火虫萤光素酶各片段N端的融合蛋白 (dCas9_Nfluc和dCas9_Cfluc)，所述融合蛋白同样包含连接肽和组氨酸标签。
[0197] 此外，为了研究PAM序列的方向和位置对检测信号强度的影响，本发明采用了四 种靶序列的设置方式。其中，iL表示3L针对的靶序列为正义链序列，PAM序列位于该靶序 列的3'端。eL表示3L针对的靶序列为反义链序列，PAM序列位于该靶序列的3'端。iR表 示3R针对的靶序列为反义链序列，PAM序列位于该靶序列的3'端。eR表示3R针对的靶序 列为正义链序列，PAM序列位于该靶序列的3'端。从而iL+iR表示两条PAM序列位于两条 革巴序列之间（PAM-in)，eL+eR表示两条PAM序列位于两条祀序列之外（PAM-out) (Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing)〇
[0198] PAM序列的位置和方向以及融合蛋白的构建方式对信号强度的影响较为复杂（如 图2所示）。例如，使用Nfluc-dCas9/Cfluc_dCas9融合蛋白时，eL+eR的效果最好，在使 用dCas9-Nfluc/dCas9-Cfluc融合蛋白时，iL+iR的效果最好，此两种情况下两个融合蛋白 的距离较近，容易发生重新组装；iL+eR或者eL+iR效果不好，推测可能是dCas9融合蛋白 相对较大，在同一条DNA链上发生重新组装较为困难。实验中所用的两个dCas9融合蛋白 的浓度均为15nM，参与测试的DNA浓度均为I. 5nM。在其后的研究中，采用dCas9-Nfluc/ dCas9_Cfluc融合蛋白以及革巴序列方向为eL/eR。
[0199] 研究3 :祀序列间距与相对信号强度的关系
[0200] 本研究调整了所针对的靶序列的间距，研究了靶序列间距与相对信号强度的关 系。在增加间距的实验中，插入的碱基序列为随机生成。各融合蛋白浓度均为15nM，目标 DNA浓度为I. 5nM，各sgRNA的工作浓度为150nM。如图3所示，相对信号强度以测得的荧光 值与空白对照值之比示出。空白对照值为由不含任何待检测的DNA的样品获得的荧光值。 随着间距的增加，发光信号先升高后降低。在靶序列间距为21bp时，信号强度最大。而在 间距为27-34bp时，由于双螺旋DNA作为靶标，此时的DNA相位有利于融合蛋白的重新组 装。而当间距大于35bp时超出了两个融合蛋白可以结合的距离，加大了萤光素酶重新组装 成有活性的催化剂的难度。该研究为实际检测中靶序列的选择提供了启示。
[0201 ] 研究4 :检测的灵敏度
[0202] 如图4所示，相对信号强度以测得的荧光值与阴性对照值之比示出。阴性对照值 为由加入无靶序列的待检测DNA的样品获得的荧光值。当目标DNA浓度小于I. 5nM时，随着 DNA浓度增加，检测到的信号强度增大，在I. 5nM时检测到的信号强度最强；继续增大DNA 浓度时检测到的信号强度降低，表示脱靶效应（非特异性结合）增加，实际参与蛋白重新组 装结合的dCas9融合蛋白浓度降低，荧光信号强度减弱。实验中所用的两个融合蛋白的浓 度均为15nM，参与测试的DNA浓度均为I. 5nM，误差棒表示三次平行实验的标准差。
[0203] 研究5 :检测的特异性
[0204] 如图5所示出的，pET-28a、pSBlC3为两个不含有本实施例的SgRNA对识别位点的 质粒，3L、3R分别表示体系中仅加入一种SgRNA (工作浓度为300nM)。Target 107和Target 27分别表示在所述目标DNA上，靶序列的间距为107bp和27bp。Target 107的实验中，各 融合蛋白的dCas9结构域的空间距离较远，萤光素酶两部分的重新组装较为困难（如图3 所示），其信号强度较Target 27低。实验中所用的两个dCas9融合蛋白的浓度均为15nM， 参与测试的DNA浓度均为I. 5nM，相对信号强度以测得的荧光值与空白对照值之比示出。空 白对照值为由不含任何待检测的DNA的样品获得的荧光值。误差棒表示三次平行实验的标 准差。
[0205] 实施例2
[0206] 本实施例采用与实施例1相同的融合蛋白，以枯草芽孢杆菌基因组（NCBI access NO :NC_000964)作为目标 DNA。
[0207] 利用与实施例1相同的方法，针对枯草芽孢杆菌基因组的特异性序列，设计并合 成了三对sgRNA，分别称为sgRNA Pair 6、sgRNA Pair 7和sgRNA Pair 8。样品中枯草芽 孢杆菌基因组DNA的浓度为318. 4ng/ μ L。检测中采用的枯草芽孢杆菌基因组DNA的终浓 度为0.012ηΜ。采用添加有大肠杆菌基因组（NCBI access NO :NC_000913)的样品作为阴 性对照，检测中大肠杆菌基因组DNA的终浓度为0. 015nM。
[0208] sgRNA 对序列
[0209] sgRNA Pair 6 atcatcccctcatcaatggg ggcatccaccatctttgtcc
[0210] sgRNA Pair 7 tggtatgaatcccatggtta tgctgagactgttatcatat
[0211] sgRNA Pair 8 ggaggttttggtaagggtat gtgatggtcaaggcaacaat
[0212] 所述结果以测得的荧光值与空白对照值之比示出。空白对照值为由不含任何待检 测的DNA的样品获得的荧光值（即信号发生蛋白的N端片段和C端片段由于随机自发重新 组装产生的假阳性信号）。如图6所示，以枯草芽孢杆菌基因组作为待检测的DNA时，获得 的萤光信号为空白对照（即不加入任何待检测的DNA)的5倍。以大肠杆菌基因组作为待 检测的DNA时，获得的萤光信号强度小于空白对照，不希望受理论限制，这是由于第一融合 蛋白和第二融合蛋白沿大肠杆菌基因组DNA随机移动和结合减弱了信号发生蛋白N端片段 和C端片段的三维随机碰撞。
[0213] 另外，使用不匹配的sgRNA对（3L、3R)，分别对目标DNA(枯草芽孢杆菌基因组）和 阴性对照（大肠杆菌基因组）进行检测时，获得的信号与空白对照无法区分。实施例3
[0