一种棘腹蛙感染金黄色葡萄球菌的pcr检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术和生物医学领域，特别涉及一种棘腹蛙的金黄色葡萄球 菌的PCR检测试剂及检测方法，适用于感染金黄色葡萄球菌的棘腹蛙的检测。
【背景技术】
[0002] 棘腹蛙是一种营养丰富且具药用价值的大型山区食用蛙，其鲜肉干样中蛋白质含 量为16. 25%、脂肪含量为1.26%，具有丰富的滋补功效和药用价值，随着人民生活水平的 不断提高，棘腹蛙的食用价值也在逐渐上升，具有较好的开发前景。同时作为脊椎动物进化 中的过渡动物，是进行解剖学、遗传学和胚胎发育学研究较为理想的实验动物。由于环境 污染严重、野生栖息地遭受破坏、人类大肆捕杀等因素造成棘腹蛙野生种群数量大量减少； 为保护其野生资源，同时满足市场需求，棘腹蛙的人工养殖逐渐受到重视。但是，随着养殖 数量的不断增多，随之而来的多种病害对棘腹蛙养殖产业的发展产生严重威胁。感染蛙类 的病原菌主要有温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、链球菌等，可见棘腹蛙细菌性疾病是人工养 殖过程中常见且危害极大的一类疾病，对细菌性疾病的研究也是棘腹蛙人工养殖的一个重 点。目前还没有过棘腹蛙感染金黄色葡萄球菌的报道。
[0003] 葡萄球菌根据生化反应和产生色素的不同可分为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌 和腐生葡萄球菌三种，其中金黄色葡萄球菌致病力较强，是动物化脓感染中最常见的病原 菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全 身感染。从而给动物水产养殖带来了巨大伤害。近年来，虽然中国特种经济动物养殖业得 到了迅猛发展，但由于养殖户的管理水平、养殖场的硬件和软件设施不能进行规范化管理 等原因，已经有多起由该菌引起的人畜感染的报道，且已日益被关注。为了及早发现棘腹蛙 是否被金黄色葡萄球菌感染，有必要建立一种快速、准确、灵敏的检测方法。
[0004] 传统病原菌的诊断需要进行显微镜观察，缺乏进行快速、准确、敏感的检测方法。
[0005] CN104726594A公开了一种检测金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，采用的引物有：
[0006] 上游引物：5 ' -AACAAGATCGCTATGGTAGAACATTGGC-3 ' nuc
[0007] 下游引物：5' -CTTCTCTCTAGCAAGTCCCTTTTCCACTA-3' hlyA
[0008] 上游引物：5' -AAAAGCAAGTTAGCTCATTTCACATCGT-3' hlyA
[0009] 下游引物：5' -TTACCGTTCTCCACCATTCCCAAG-3' invA
[0010] 上游引物：5' -CAATCAGTCCTAACGACGACCCTTC-3' invA
[0011] 下游引物：5 ' -GCCGCCAAACCTAAAACCAGC-3 ' tIh
[0012] 上游引物：5 ' -CGAACGAGAACGCAGACATTACG-3 ' tIh
[0013] 下游引物：5' -CGGGTTAGGGAAGCGCCATT-3' ipaH
[0014] 上游引物：5' -GGTAAATCTGCTGTTCAGTCTCACGC-3' ipaH 下游引物：5' -TTTACGGACTG GTTCTCCCTCTGG-3'。
[0015] 本发明发现采用上述引物的PCR试剂盒检测棘腹蛙感染金黄色葡萄球菌不敏感， 缺乏特异性。为此有必要寻找一种操作简单、特异、快速、敏感等优点的检测棘腹蛙感染金 黄色葡萄球菌的PCR检测试剂盒。
【发明内容】
[0016] 本发明提供了一种检测棘腹蛙感染金黄色葡萄球菌的PCR检测试剂盒及其检测 方法。该检测试剂盒及检测方法能快速、高效、特异性的用于棘腹蛙感染金黄色葡萄球菌的 检测。
[0017] 本发明的一种检测棘腹蛙的金黄色葡萄球菌的PCR检测试剂盒，包含2倍反应混 合缓冲液、上游引物、下游引物、Taq酶和灭菌的ddH20,其特征在于所述上游引物为S-F : 5 ' - AGGTAACGGCGTAAATAG - 3 '，所述下游引物 S-R : 5 ' - ACTTGCTTCAGGACCATA - 3 '。
[0018] 上述本发明的检测试剂盒，所述2倍反应混合缓冲液包含以下成份：
[0020] 所述2倍反应混合缓冲液的量为1.0 ml。
[0021] 上述本发明的检测试剂盒，所述上游引物和下游引物的浓度均为10 yM/L;所述 Taq酶为5U/ μ L Taq酶，其量为0· 5 μ L ;所述灭菌的CldH2O为1.0 mL。
[0022] 上述本发明的检测试剂盒，还包含阳性对照液和阴性对照液，所述阳性对照液为 感染金黄色葡萄球菌的棘腹蛙的基因组DNA，所述阴性对照液为ddH20。
[0023] 本发明还提供了一种采用本发明的检测试剂盒检棘腹蛙感染金黄色葡萄球菌的 方法，包含以下步骤：
[0024] (1)棘腹蛙DNA的提取：
[0025] ①取病蛙眼、口腔或胃部组织，剪碎后置于匀浆器中，加入匀浆液后冰浴研磨，研 磨碎裂后置离心管中；
[0026] ②加入1 % -3%的β -巯基乙醇溶液，混匀后60_70°C水浴0. 5-lh，每隔3-5分钟 取出摇匀一次；
[0027] ③10000-15000rpm离心3_7min，离心后，移出上清液于另一无菌离心管中，弃沉 淀；
[0028] ④向上清液中加入等体积的按体积比20-30 :1的氯仿：异戊醇的混合溶剂，混匀 后，8000_12000rpm离心5_15min，取上清液至另一无菌离心管中；
[0029] ⑤加入等体积的氯仿，混勾后8000-12000rpm离心5-15min，再取上清液；
[0030] ⑥向上清液中加入0. 8-1. 2倍体积的2-4M NaAc溶液，混匀后再加入1. 5-2. 5倍 体积预冷的无水乙醇，充分混匀后于-18°C以下放置30min以上；
[0031] ⑦10000-15000rpm离心3_7min，弃上清液，所得DNA沉淀在室温下瞭干；
[0032] ⑧用70-80 %的乙醇对DNA沉淀进行洗涤，干燥后沉淀溶于TE中，加 RNase A，37°C 消化20-40min，得到棘腹蛙DNA之后于-20°C保存；
[0033] (2) PCR反应体系：采用20 yL的PCR反应体系，在0. 2mL PCR反应管内分别加入2 倍反应混合缓冲液10 μ L，上游引物、下游引物各0. 5 μ L，5U/ μ L Taq DNA聚合酶0. 5 μ L， DNA模板I. 0 μ L，用灭菌超纯水加至总体积20 μ L，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作 为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上反应；
[0034] (3) PCR反应条件：95°C预变性5分钟；然后95°C变性30秒，56°C退火30秒，72°C 延伸30秒，共循环30次；72°C延伸7分钟，最后4°C保存；
[0035] (4)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10 μ L反应产物放在含溴化乙锭 0. 5 μ g/mL的1 %琼脂糖凝胶上，使用0. 5 X TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR 产物，检查PCR产物的预期大小；
[0036] (5)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在226bp处 出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为金黄色葡萄球菌阳性；若阳性对照可见目 的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的金黄色葡萄球 菌。
[0037] 在一具体实施方案中，一种检测棘腹蛙的金黄色葡萄球菌的PCR检测试剂盒，包 括：
[0038] (1)2倍反应混合缓冲液1.0 mL，包含以下成分：
[0041] (2)检测引物的设计合成：根据GenBank中发布的棘腹蛙的基因序列，设计一 对特异性检测引物，上游引物S-F : 5 ' -AGGTAACGGCGTAAATAG - 3 '，下游引物S-R : 5 ' - ACTTGCTTCAGGACCATA - 3'，浓度为 10 μ M ;
[0042] (3) Taq 酶 5U/ μ L ;
[0043] (4)灭菌的 ddH20 1.0 mT,；
[0044] (5)阳性对照液：感染金黄色葡萄球菌的棘腹蛙的基因组DNA ;
[0045] (6)阴性对照液：CldH2O。
[0046] 与现有技术相比，本发明的检测棘腹蛙的金黄色葡萄球菌的PCR检测试剂盒及其 检测方法具有以下特点及优点：
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