(1)分别以提取的棘腹蛙的DNA作为模板，进行PCR检测。
[0092] (2)分别取2倍反应混合缓冲液10 μ L，上、下游引物（S-F、S-R)各0. 5 μ L，Taq DNA聚合酶1 μ L，ddH20 1 μ L，模板I. 0 μ L。混合均勾后离心数秒，置于PCR反应仪上反应。
[0093] (3)按下列条件进行PCR扩增反应：95°C预变性5分钟；然后95°C变性30秒，56°C 退火30秒，72 °C延伸30秒，共循环30次；72 °C延伸7分钟，最后4°C保存。
[0094] (4)反应结束后，取反应产物10 μ L加到2 μ L溴酚蓝中混勾，经1 %琼脂糖凝胶电 泳20min后，于紫外仪上观察，若在226bp处出现明亮的反应条带，则为金黄色葡萄球菌阳 性；若无反应条带出现，则为阴性。
[0095] (5)实验结果分析：如图2所示，标号1的电泳带在226bp处出现明亮的反应条带， 显示金黄色葡萄球菌阳性。标号2~4(分别为肺炎克雷伯氏菌、腐败希瓦氏菌、大肠杆菌） 的电泳带在226bp处无反应条带出现，显示金黄色葡萄球菌阴性。表明本发明所述的试剂 盒对感染的金黄色葡萄球菌的特异性强。
[0096] 实施例4本发明的PCR快速检测试剂盒对发病棘腹蛙的检测
[0097] 使用实施例1所述的试剂盒，按下列步骤进行：
[0098] (1)分别以发病养殖场中取的6只棘腹蛙组织中提取的DNA作为模板，进行PCR检 测。
[0099] (2)分别取2倍反应混合缓冲液10 μ L，上、下游引物（S-F、S-R)各0. 5 μ L，Taq DNA聚合酶1 μ L，CldH2O 7 μ L，DNA模板I. 0 μ L，另取阳性对照液和阴性对照液各1 μ L作为 模板，作为阳性和阴性对照组。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上反应。
[0100] ⑶按下列条件进行PCR扩增反应：95°C预变性5分钟；然后95°C变性30秒，56°C 退火30秒，72 °C延伸30秒，共循环30次；72 °C延伸7分钟，最后4°C保存。
[0101] ⑷反应结束后，取反应产物?ο μ L加到2 μ L溴酚蓝中混勾，经1 %琼脂糖凝胶电 泳20min后，于紫外仪上观察，若在226bp处出现明亮的反应条带，则为金黄色葡萄球菌阳 性；若无反应条带出现，则为阴性。
[0102] 检测所取6只棘腹蛙中，5只呈金黄色葡萄球菌阳性，通过进一步测序表明，其检 测结果均为金黄色葡萄球菌，且核苷酸同源性都在99%以上，PCR检测结果见图3。
[0103] 实施例5本发明的PCR快速检测试剂盒对不同地区的棘腹蛙样品的检测
[0104] 使用实施例1所述的试剂盒，按下列步骤进行：
[0105] (1)分别以从四川、贵州、重庆等地采集的具有被金黄色葡萄球菌感染症状的棘腹 蛙样品，提取组织中的DNA作为模板，进行PCR检测。
[0106] (2)分别取2倍反应混合缓冲液10 μ L，上、下游引物（S-F、S-R)各0.5 μ L，Taq DNA聚合酶1 μ L，CldH2O 7 μ L，模板I. 0 μ L，另取阳性对照液和阴性对照液各1 μ L作为模 板，作为阳性和阴性对照组。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上反应。
[0107] (3)按下列条件进行PCR扩增反应：95°C预变性5分钟；然后95°C变性30秒，56°C 退火30秒，72 °C延伸30秒，共循环30次；72 °C延伸7分钟，最后4°C保存。
[0108] (4)反应结束后，取反应产物10 μ L加到2 μ L溴酚蓝中混勾，经1 %琼脂糖凝胶电 泳20min后，于紫外仪上观察，若在226bp处出现明亮的反应条带，则为金黄色葡萄球菌阳 性；若无反应条带出现，则为阴性。
[0109] 检测所取3份样品中，金黄色葡萄球菌均为阳性，通过进一步测序表明，标号1~ 3(分别为四川、贵州、重庆）其检测结果均为金黄色葡萄球菌，且核苷酸同源性都在99%以 上，PCR检测结果见图4。
【主权项】
1. 一种检测棘腹蛙的金黄色葡萄球菌的PCR检测试剂盒，包含2倍反应混合缓冲 液、上游引物、下游引物、Taq酶和灭菌的ddH 20,其特征在于所述上游引物为54:5'_ AGGTAACGGCGTAAATAG - 3 '，所述下游引物 S-R :5 ' - ACTTGCTTCAGGACCATA - 3 '。2. 如权利要求1所述的检测试剂盒，所述2倍反应混合缓冲液包含以下成份： KCi 20mM MgCl2 25rnM TrIs-HCi, ρΗ5.8 40πιΜ ciNTP 2.5i-nMc3. 如权利要求2所述的检测试剂盒，所述2倍反应混合缓冲液的量为1.0 ml。4. 如权利要求1所述的检测试剂盒，所述上游引物和下游引物的浓度均为10 yM/L。5. 如权利要求1所述的检测试剂盒，所述Taq酶为5U/ μ L Taq酶，其用量为0. 5 μ L ; 所述灭菌的CldH2O的用量为1.0 mL。6. 如权利要求1所述的检测试剂盒，还包含阳性对照液和阴性对照液。7. 如权利要求1所述的检测试剂盒，所述阳性对照液为感染金黄色葡萄球菌的棘腹蛙 的基因组DNA，所述阴性对照液为ddH20。8. -种采用权利要求1-7任一所述的试剂盒检染棘腹蛙感染金黄色葡萄球菌的方法， 包含以下步骤： (1) 棘腹蛙DNA的提取： ① 取病蛙眼、口腔或胃部组织，剪碎后置于匀浆器中，加入匀浆液后冰浴研磨，研磨碎 裂后置离心管中； ② 加入1 % -3%的β -巯基乙醇溶液，混匀后60-70°C水浴0. 5-lh，每隔3-5分钟取出 摇勾一次； ③ 10000-15000rpm离心3-7min，离心后，移出上清液于另一无菌离心管中，弃沉淀； ④ 向上清液中加入等体积的按体积比20-30 :1的氯仿：异戊醇的混合溶剂，混匀后， 8000_12000rpm离心5_15min，取上清液至另一无菌离心管中； ⑤ 加入等体积的氯仿，混勾后8000-12000rpm离心5-15min，再取上清液； ⑥ 向上清液中加入〇. 8-1. 2倍体积的2-4M NaAc溶液，混匀后再加入1. 5-2. 5倍体积 预冷的无水乙醇，充分混匀后于-18°C以下放置30min以上； ⑦ 10000-15000rpm离心3-7min，弃上清液，所得DNA沉淀在室温下晾干； ⑧ 用70-80 %的乙醇对DNA沉淀进行洗涤，干燥后沉淀溶于TE中，加 RNase A，37°C消 化20-40min，获得DNA之后于-20°C保存； (2) PCR反应体系：采用20 μ L的PCR反应体系，在0. 2mL PCR反应管内分别加入2倍 反应混合缓冲液10 μ L，上游引物、下游引物各0. 5 μ L，5U/ μ L Taq DNA聚合酶0. 5 μ L，DNA 模板I. 〇 μ L，用灭菌超纯水加至总体积20 μ L，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为 模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上反应； (3) PCR反应条件：95 °C预变性5分钟；然后95 °C变性30秒，56 °C退火30秒，72 °C延伸 30秒，共循环30次；72 °C延伸7分钟，最后4°C保存； (4) PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10 μ L产物放在含溴化乙锭0. 5 μ g/mL的 1 %琼脂糖凝胶上，使用〇. 5 X TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR 产物的预期大小； (5) 结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在226bp处出现 明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为金黄色葡萄球菌阳性；若阳性对照可见目的条 带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的金黄色葡萄球菌。
【专利摘要】本发明公开了一种感染棘腹蛙的金黄色葡萄球菌的PCR快速检测试剂盒及检测方法,所述PCR快速检测试剂盒，包括：一种检测棘腹蛙的金黄色葡萄球菌的PCR检测试剂盒，包含2倍反应混合缓冲液、上游引物S-F：5’–AGGTAACGGCGTAAATAG–3’、下游引物S-R：5’–ACTTGCTTCAGGACCATA–3’、Taq酶和灭菌的ddH2O。本发明的PCR快速检测试剂盒对棘腹蛙感染金黄色葡萄球菌的检测具有快速、准确、特异的优点，满足了临床诊断的要求，为检测感染棘腹蛙的金黄色葡萄球菌提供了便利条件。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/14
【公开号】CN105177134
【申请号】
【发明人】姜玉松, 徐敬明, 樊汶樵, 吴宝红, 李晓英
【申请人】重庆文理学院
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月8日