miRNA在肝硬化诊断和治疗中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种miRNA在肝硬化诊断和治疗的应用，具体地 涉及miRNA-548a-3p在肝硬化诊断和治疗的应用。
【背景技术】
[0002] 肝硬化是临床常见的慢性进行性肝病，由一种或多种病因长期或反复作用形成的 弥漫性肝损害。在我国大多数为肝炎后肝硬化，少部分为酒精性肝硬化和血吸虫性肝硬化。 肝硬化是肝细胞发生坏死及炎症刺激时，肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程；过度 纤维化使肝脏萎缩变硬，最终引起肝硬化失代偿或肝功能衰竭而导致患者死亡。早期由于 肝脏代偿功能较强可无明显症状，后期则以肝功能损害和门脉高压为主要表现，并有多系 统受累，晚期常出现上消化道出血、肝性脑病、继发感染、脾功能亢进、腹水、癌变等并发症。
[0003] microRNAs (miRNAs)是一类含量丰富的非蛋白编码小分子RNA，miRNAs主要是与 靶mRNA的3'-UTR区域结合，能够抑制mRNA的翻译或直接使mRNA降解，调节多种生物功 能。据估计，生物体内约有1/3的基因受miRNA的调控。
[0004] 检测miRNA的表达水平可以为癌症的临床诊断提供参考。而miRNA的异常表达直 接导致一些与疾病发生相关基因的表达异常，诱发癌症的发生。已有报道证明miRNA可以 通过调控靶基因 mRNA的表达，在肝硬化中起重要作用。在未来临床治疗中，miRNA不仅可 以成为新的肝硬化早期诊断和疾病进程相关的标记物，而且也有望通过改变miRNA的表达 或者其靶基因的表达治疗肝硬化等疾病。寻找和鉴定与肝硬化发生相关的miRNA及其靶基 因为miRNA的临床治疗提供基础。
【发明内容】
[0005] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供miRNA-548a_3p在肝硬化诊断 和治疗中的应用。相比传统的肝硬化的诊断方法，使用miRNA来诊断肝硬化具有及时性、 灵敏性、特异性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，从而采取相应的预防和治疗措 施。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0007] 本发明提供了 miRNA-548a_3p在制备诊断患者是否患有肝硬化或处于肝硬化的 风险中的产品中的应用，所述产品包括能够检测miRNA-548a-3p的表达水平的试剂。
[0008] 进一步，所述核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 进一步，上面所述的产品包括芯片或试剂盒；其中，所述芯片包括固相载体； 以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针；所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于 miRNA-548a-3p的部分或全部序列；所述的寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报 道的可用于诊断肝硬化的miRNA的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一芯 片上通过检测多种miRNA指标联合诊断肝硬化的情况也包含在本发明的保护范围之内。
[0010] 其中，所述试剂盒包括用于检测上面所述的miRNA-548a-3p的表达水平的试剂， 所述试剂包括针对miRNA-548a-3p的引物和/或探针。所述试剂还包括针对现有技术中已 经报道的诊断肝硬化miRNA的引物和/或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置 在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指标联合诊断肝硬化的情况也包含在本发明的保护 范围之内。
[0011] 进一步，所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料， 例如但不限于尼龙膜，经活性基团（如醛基、氨基等）修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑 料片等。
[0012] 所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如， 如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡 核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序 列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨 基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》； J. L. erisi, V. R. Iyer, P. 0. BROWN. Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science，1997 ;278 :680和马立人，蒋中华主编·生 物芯片.北京：化学工业出版社，2000,1-130。
[0013] 本发明提供了一种诊断患者是否患有肝硬化或处于肝硬化的风险中的产品，所述 产品能够通过检测miRNA-548a-3p的表达水平来诊断肝硬化。所述产品包括上面所述的芯 片或试剂盒。其中，所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针； 所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miRNA-548a-3p的部分或全部序列。所述的寡核苷 酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于诊断肝硬化的miRNA的寡核苷酸探针。 将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合诊断肝硬化的情 况也包含在本发明的保护范围之内。所述试剂盒包括用于检测上面所述的miRNA-548a-3p 的表达水平的试剂。
[0014] 进一步，所述检测miRNA-548a-3p表达水平的试剂包括针对miRNA-548a-3p的引 物和/或探针。所述试剂还包括针对现有技术中已经报道的诊断肝硬化miRNA的引物和/ 或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指 标联合诊断肝硬化的情况也包含在本发明的保护范围之内。
[0015] 本发明提供了 miRNA-548a_3p在高通量测序平台中的应用。通过高通量测序能 获知待检测样本中miRNA-548a-3p的表达水平，将待测样本的结果同对照组样本相比， 容易判断待测样本是否患有肝硬化以及患肝硬化的风险。因此，通过高通量测序获得 miRNA-548a-3p表达水平与肝硬化相关性的应用同样包含在本发明的保护范围之内。
[0016] 本发明提供了 miRNA-548a-3p在制备治疗肝硬化药物中的应用。
[0017] 进一步，所述药物包含促进miRNA-548a_3p表达或增强miRNA-548a_3p功能的试 剂。
[0018] 进一步，促进miRNA-548a_3p表达或增强miRNA-548a_3p功能的试剂包括蛋白、寡 核苷酸、小分子化合物。
[0019] 进一步，所述的试剂包括：miRNA-548a_3p的模拟物、miRNA-548a_3p的前体、 miRNA-548a-3p 的激动剂、携带 miRNA-548a-3p 的载体。
[0020] 根据miRNA-548a-3p序列设计出它的模拟物或激动剂，miRNA-548a-3p的模拟物 是化学合成的小RNA，miRNA-548a-3p的激动剂是经过特殊标记和化学修饰的双链小RNA， 将miRNA-548a-3p模拟物或者激动剂转移到人体内后，它们能够明显上调miRNA-548a-3p 的表达。
[0021] 本发明提供了一种治疗肝硬化的药物，所述药物包括上面所述的促进 miRNA-548a-3p表达或增强miRNA-548a-3p功能的试剂。
[0022] 进一步，所述的试剂包括：miRNA-548a-3p的模拟物、miRNA-548a-3p的前体、 miRNA-548a-3p 的激动剂、携带 miRNA-548a-3p 的载体。
[0023] 本发明的治疗肝硬化的药物还包含药物学上可以接受的载体，所述载体包括但不 限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮 吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
[0024] 所述药物可以制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉 剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
[0025] 所述药物可以单独施用或者与其他能够抑制肝硬化的药物进行组合施用。
[0026] 所述药物可以离体施用：将miRNA-548a-3p的模拟物、miRNA-548a-3p的激动剂、 miRNA-548a-3p的前体或者miRNA-548a-3p的表达载体在体外导入或转染人体自身或异体 细胞（或异种细胞），经体外细胞扩增后，输回人体。
[0027] 所述药物可以体内施用：将miRNA-548a-3p的模拟物、miRNA-548a-3p的激动剂、 miRNA-548a-3p的前体或者miRNA-548a-3p的表达载体直接导入体内。这种载体可以是病 毒型或非病毒性，甚至是裸DNA或RNA。
[0028] 所述的受试者可以是人类或者其他哺乳动物。更具体地，受试者是器官、组织、细 胞。
[0029] 本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
[0030] 本发明提供了上面所述的试剂在制备治疗肝硬化药物中的应用。
[0031] 应当知道，本发明的miRNA-548a_3p包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体， 其显示完整miRNA-548a-3p核酸分子相同的功能，它们可能通过核苷酸残基的缺失、置换 或者插入而突变。
[0032] 本领域人员熟知，为了保证miRNA的稳定性，可以在miRNA的一端或者两端增加保 护性碱基，如TT，也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA的功能。因此，本领域技术 人员熟知，在不影响miRNA-548a_3p功能的条件下，对miRNA-548a_3p进行碱基修饰或者在 两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。
[0033] 本发明的miRNA-548a_3p可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达 miRNA-548a-3p的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核表达载体。 [0034] 病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺 病毒相关病毒载体、疱疹病毒（例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）载体、甲病毒载 体。
[0035] 真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、 pcDNA3. 0表达载体、pcDNA3. 1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表 达载体、PTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、 PCAMBIA1301 等。
[0036] 可以表达miRNA-548a-3p的DNA片段可以通过如下方式获取：从miRNA数据库中 (http://microrna. sanger. ac. uk/sequences/)寻找 miRNA-548a_3p 在基因组上的位置及 具体序列信息，根据基因组序列确定miRNA-548a-3p初始miRNA的位置，在miRNA-548a-3p 初始miRNA位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获 得表达miRNA-548a-3p的DNA片段。
[0037] 本发明的优点和有益效果：
[0038] 本发明首次发现了 miRNA-548a_3p表达水平与肝硬化的发生发展相关，通过检测 受试者miRNA-548a-3p的表达水平，可以判断受试者是否患有肝硬化或者判断受试者是否 存在患有肝硬化的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
【附图说明】
[0039] 图1显示利用QPCR检测miRNA-548a-3p在肝硬化患者活检组织中的表达情况；
[0040] 图2显示miRNA-548a-3p模拟物对miRNA-548a-3p表达的促进作用。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明， 并不意味着限制本发明的保护范围。
[0042] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0043] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0044] 实施例1与肝硬化相关的miRNA的筛选
[0045] 1、样本获取：各收集10例健康人的活检组织和肝硬化患者的活检组织样本。上述 所有样本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
[0046] 2、样本总RNA的提取
[0047] 使用QIAGEN公司的组织RNA提取试剂盒提前总RNA。具体步骤如下：
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