Akr1b10在制备急性心肌梗死诊疗制剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及AKR1B10在制备急性心肌梗死诊疗制剂中的 应用。
【背景技术】
[0002] 心血管疾病是威胁人类健康的重要疾病之一，尤其是急性心肌梗死（(Acute Myocardial Infarction，AMI)己成为心血管疾病中死亡率不断增加的重要原因。AMI的早 期治疗对患者良好的预后起着至关重要的作用。AMI的早期、及时、准确的诊断及病情估计 是积极采取有效的治疗措施并保证心脏及时再灌注以减少死亡率的必要条件。目前AMI的 临床诊断的血清生物标志物主要有肌酸激酶同工酶、肌红蛋白和肌钙蛋白等，上述标志物 虽己在AMI早期诊断的敏感性及特异性上达到一定水平，但研究者们对高敏感性及特异性 的新血清标志物的研究仍在继续，如何更早的对急性心肌梗死进行诊断及预防，一直是研 究的重要课题。而随着人类基因组计划完成和基因芯片技术的发展，许多单基因疾病的致 病基因被发现，并应用到疾病的诊断与治疗当中。而AMI作为一种受多种遗传与环境因素 影响的疾病，遗传学在AMI发病中的作用仍未明确。具体是哪些基因，通过何种细胞过程， 有哪些通路参与了 AMI过程尚未明确。
[0003] 本研究通过AMI的外周血RNA表达谱差异分析，来研究具体有哪些基因参与了 AMI 过程，为将来AMI早期基因诊断奠定基础。发明人对6例急性心肌梗死病例组和6对照组 血液样本进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，在差异表达明显的基因中 挑选出高表达的候选基因 AKR1B10,现有研究中并没有AKR1B10和急性心肌梗死相关的报 道，进一步，发明人进行了分子验证，证实了 AKR1B10在急性心肌梗死组中高表达，AKR1B10 抑制剂可用于制备治疗急性心肌梗死药物。本发明提供了一种新的急性心肌梗死的监测治 疗靶点，具有重要的临床应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种急性心肌梗死诊断制剂，所述急性心肌梗死诊断制剂 检测AKR1B10基因和/或AKR1B10基因的表达产物。
[0005] 进一步，所述急性心肌梗死诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方 法检测急性心肌梗死组织或外周血中AKR1B10基因的表达，优选的，所述的荧光定量PCR试 剂盒中含有一对特异性扩增AKR1B10基因的引物；所述的基因芯片中包括与AKR1B10基因 的核酸序列杂交的探针，更优选的，荧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测AKR1B10基因的 上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 9,下游引物序列为SEQ ID NO. 10。
[0006] 进一步，直接检测急性心肌梗死组织或外周血中AKR1B10基因和/或基因的表达 产物。
[0007] 进一步，所述的急性心肌梗死的诊断制剂采用免疫方法检测急性心肌梗死组织或 外周血中AKR1B10基因的表达产物，优选的，所述免疫方法为ELISA检测和/或胶体金检 测。
[0008] 进一步，所述检测AKR1B10表达产物的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所 述试剂盒中的抗体可采用市售的AKR1B10单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被 AKR1B10单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗 涤液，酶反应终止液等。
[0009] 进一步，所述检测AKR1B10蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采 用市售的AKR1B10单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技 术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区（T)喷点 有抗AKR1B10单克隆抗体、质控区（C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0010] 本发明的目的在于提供上述急性心肌梗死诊断制剂在制备急性心肌梗死诊断工 具中的应用。
[0011] 本发明的目的在于提供一种治疗急性心肌梗死的制剂，所述制剂中含有抑制 AKR1B10基因的转录或表达的试剂或化合物。
[0012] 进一步，所述治疗急性心肌梗死的制剂中含有激活AKR1B10的抑制基因、激活抑 制AKR1B10表达的蛋白、导入抑制AKR1B10转录或表达的siRNA、激活促进AKRlBlOmRNA降 解的microRNA、导入促进AKR1B10蛋白降解的分子、抑制促进AKR1B10表达的因子及蛋白的 表达。
[0013] 优选的，所述治疗急性心肌梗死的制剂含有下列中的一组或几组siRNA :SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6。更优选 的，所述治疗急性心肌梗死的制剂含有siRNA序列为SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6。
[0014] 本发明的目的在于提供上述治疗急性心肌梗死的制剂在制备急性心肌梗死治疗 药物或试剂中的应用。
[0015] 为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基 因 AKR1B10基因，进而通过分子细胞生物学方法验证了 AKR1B10基因与急性心肌梗死的关 系：AKR1B10基因在外周血中高表达，与急性心肌梗死具有很好的相关性，可用于制备急性 心肌梗死辅助诊断制剂，具有重要的临床应用价值。
[0016] 本领域人员熟知抑制基因及其表达产物的表达通常可以采用下述方法中的一种 和/或几种：通过激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表达的蛋白、采用 RNA干扰技术抑制目的基因表达、激活促进目的基因 mRNA降解的microRNA、导入促进目的 基因编码蛋白降解的分子、抑制促进目的基因表达的因子及蛋白的表达。
[0017] RNA干扰（RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的 mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断 体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA 设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸 钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子 脂质体试剂法等途径转染细胞。
[0018] 荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标 记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板 的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定 量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、 重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
[0019] 基因芯片又称为DNA微阵列（DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在 聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记 的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针 阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷 酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通 量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二 是快速简便；二是可同时检测多种疾病。
[0020] 本发明的目的在于提供一种检测急性心肌梗死的基因检测试剂盒，所述试剂盒检 测基因 AKR1B10,采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 9,下游引物 序列为 SEQ ID NO. 10。
[0021] 进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪， 灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[0022] 进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR 反应液。所述内参为GAPDH。
[0023] 所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。
[0024] 本发明目的是提供了一种急性心肌梗死蛋白检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测 AKR1B10蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
[0025] 本发明目的是提供了一种检测急性心肌梗死的基因芯片，所述的基因芯片包括与 AKR1B10基因的核酸序列杂交的探针。
【附图说明】
[0026] 图I siRNA干扰后各组AKRlBlOmRNA相对表达量
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。
[0028] 实施例1病例的收集
[0029] 取2012年12月到2014年6月期间在医院心血管内科的初发急性心肌梗死患者6 例，急性心肌梗死发病至入院时间为0. 5-10小时。纳入标准符合2012年ESC大会上公布 的急性心肌梗死的纳入标准。入组患者均己签署知情同意书。健康对照为医院体检中心的 健康体检者6人，且与实验组患者年龄、性别等相匹配，同时参照AMI组的排除标准排除相 关疾病。健康受试者知情并同意参与该项研究。
[0030] 纳入标准：
[0031] 参照2012年在德国慕尼黑召开的ESC大会上公布的新版心肌梗死全球统一定义 的心肌梗死诊断标准，并且所有入组患者入院时间均在发病12小时内。
[0032] 诊断标准即：血清心肌生化标志物（主要为血清肌钙蛋白）出现明显升高（且至 少超过99%正常参考值上限），同时合并有以下至少一项心肌缺血的临床证据：
[0033] 1.心肌缺血的临床表现；
[0034] 2.心电图出现新发生的缺血性心电图改变，包括新出现的ST-T的改变或新出现 的左束支传导阻滞（LBBB)图形；
[0035] 3.心电图表现为病理性Q波的形成；
[0036] 4.影像学证据，包括新发的心肌活性丧失或新发的心肌局部室壁运动异常；
[0037] 5.通过冠脉造影检查或尸检的客观证据证实冠状动脉内存在血栓。
[0038] 排除标准：
[0039] L 年龄〈2〇 岁，>9〇 岁；
[0040] 2.既往曾有冠脉支架植入或者冠脉搭桥术后的患者；
[0041] 3.有高心病、扩心病等其他各种心肌病，有陈旧性心肌梗死、心脏瓣膜病、心肌炎、 心包炎、感染性心内膜炎、主动脉夹层等心脏病史者；
[0042] 4.有全身免疫系统疾病或免疫功能紊乱、低下者；
[0043] 5.近期1月内出现过发热、咳嗽、咳痰、恶心、呕吐、腹泻、腹痛、尿频、尿急、尿痛等 呼吸道、消化道或泌尿等其他系统感染，及有其他慢性感染性疾病的患者；
[0044] 6.有重度贫血、原发血液系统疾病者；
[0045] 7.有肿瘤病史者；
[0046] 8.慢性肝炎、肝硬化、严重肝肾功能不全者；
[0047] 9.近期有脑卒中、肺梗塞、周围血管疾病者；
[0048] 10.器官或者骨髓移植患者。
[0049] AMI组：分别于患者入院当时采集肘正中静脉血3ml。
[0050] 对照组：亦采集空腹肘正中静脉血3ml。
[0051] 实施例2高通量测序及分析
[0052] 对外周血进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提 取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组测序。进而通过NanoDroplOOO 分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：0D260/0D280为1. 8-2. 2。 样品合格后送往测序公司进行测序，测序平台为Illumina公司的H