转基因玉米t4-1-1品系特异性检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种转基因作物的品系特异性检测，特别涉及转基因玉米T4-1-1品 系特异性PCR检测方法及试剂盒。
【背景技术】：
[0002] 在对进行转基因植物及其加工产品进行成分定性检测时，可根据其检测的特异性 分为筛选检测方法、基因特异性检测方法和品系特异性检测方法等。
[0003] 品系特异性检测是通过检测插入载体与植物基因组的连接区序列实现的，由于每 一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列。品系特异 性具有更高的特异性和准确性，最适合做转基因产品检测。
[0004] 根据《转基因植物及其产品成分检测》国家标准，品系特异性检测方法中往往对特 异性PCR反应扩增的产物有一定要求，即长度120-300bp之间、扩增条带单一、并可用于多 种仪器进行结果显示。这样符合检测上快速、准确、特异的要求，更加方便转基因产品成分 检测上的应用。
[0005] 转基因玉米T4-1-1品系是由四川省农业科学院生物技术核技术研究所开发的玉 米品系，具有极好的抗除草剂能力。目前尚未有任何关于转基因玉米T4-1-1的品系特异性 PCR检测方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供转基因玉米T4-1-1品系特异性PCR检测方法及试剂盒。
[0007] 为达到上述目的，要解决的关键技术是提供合适的用于检测转基因玉米T4-1-1 的品系特异性PCR检测引物。
[0008] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
[0009] 本发明首先根据转基因玉米T4-1-1的3'端侧翼序列（SEQ ID No.9)，设计了用于 检测转基因玉米T4-1-1的品系特异性PCR检测引物，其核苷酸序列选自以下引物对1~4 中任一：
[0010] 引物对 I :SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ;
[0011] 引物对 2 :SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 ;
[0012] 引物对 3 :SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6 ;
[0013] 引物对 4 :SEQ ID No. 7 和 SEQ ID No. 8。
[0014] 其中，经实验证实，引物对1的扩增效率最高。
[0015] 本发明还提供了一种用于检测转基因玉米T4-1-1的品系特异性PCR检测试剂盒， 其特征在于包括有上述的4对PCR检测引物中任一。优选的PCR检测引物是引物对1。
[0016] 由此，本发明建立了一种转基因玉米T4-1-1品系特异性的PCR定性检测方法，其 特征在于使用前述的PCR检测引物。
[0017] 上述方法的具体步骤如下：
[0018] (1)提取待检测水稻样品的DNA ;
[0019] ⑵以提取的DNA为模板，用权利要求1所述的PCR检测引物，建立PCR扩增体系， 并进行PCR扩增；
[0020] (3)根据是否能扩增出核苷酸序列为SEQ ID No. 10的DNA片段的条带，确定品系 特异性：如果扩增出该条带，则确定被检测的样品是转基因玉米T4-1-1 ;如果不能扩增出， 则确定不是转基因玉米T4-1-1。
[0021] 其中，所述的从待检测样品中提取DNA的方法，可以是从植物材料中提取DNA的各 种常用方法，例如可以是CTAB法、异硫氰酸胍法或盐酸胍法等各种方法。
[0022] 在上述方法中，PCR反应体系和扩增条件对检测效果有影响。特别是，PCR反应体 系中引物的终浓度以及退火温度对于检测结果的特异性、灵敏度；本发明考察了 PCR反应 体系中引物的终浓度以及退火温度对于检测的特异性和灵敏度的影响，实验结果发现在引 物终浓度为0. 2 μ M、退火温度为58°C时，检测结果的特异性最强，灵敏度最高。
[0023] 本发明中所述的PCR扩增体系可参考以下方法建立：反应体系的总体积为 25·0μL，其中，10XPCR缓冲液5μL，dNTPs混合溶液2μL，10μmol/LSEQIDNo·l所示的 引物 1.0yL，10ymol/L SEQ ID Νο·2所示的引物 1.0yL，5U/yL Go Taq酶0.2yL，25mg/ L DNA模板2. 0 μ L，余量为双蒸水。
[0024] 所述的 PCR 扩增条件优选为：94°C，5min ;94°C，20s，58°C，20s，72°C，20s，35 个循 环；72°C，2min。
[0025] 采用本发明建立的转基因玉米T4-1-1的品系特异性PCR定性检测方法对常规玉 米吉单180、吉东26、沈玉21、郁青281和转基因玉米T4-1-1、GA21、NK603、T25、TC1507、 Btll、Btl76、M0N863、M0N89034、MIR604以及其它转基因植物（例如：水稻科丰6号、大豆 356043、棉花M0N1445和油菜MSl等）进行了定性检测。定性PCR扩增结果表明，在转基 因玉米T4-1-1基因组中扩增得到了目的片段大小的条带（293bp)，在其它转基因植物以 及常规玉米等基因组中没有扩增得到目的片段大小的片段；通过测序分析表明转基因玉米 T4-1-1基因组中扩增获得的序列与目的扩增片段序列一致。实验结果表明，本发明所建立 的转基因玉米T4-1-1品系特异性定性PCR检测方法具有较强的特异性。
[0026] 检出限实验结果表明，转基因玉米T4-1-1成分为1 %、0. 5 %、0. 1 %、0. 05 %的PCR 反应中均扩增出了目的片段大小的条带，说明本发明转基因玉米T4-1-1品系特异性PCR定 性检测方法的检出限为0. 05%，具有高度的灵敏性。
【附图说明】
[0027] 图1引物扩增结果，其中
[0028] M :100bp DNA marker ;1 :空白对照；2 :阴性对照；3 :引物1 ;4 :引物2 ;5 :引物3 ; 6 :引物4。
[0029] 图2 PCR反应体系中引物1终浓度和退火温度优化结果：M :Trans 2K plus II DNA Marker ;1-5 引物终浓度为 0· I μΜ/L ;1 :55°C ;2 :56°C ;3 :58°C ;4 :6(TC ;5 :62°C ;6-10 引物终浓度为 〇· 2yM/L ;6 :55°C ;7 :56°C ;8 :58°C ;9 :60°C ;10 :62°C ;11_15 引物终浓度为 0· 5 μΜ/L ;11 :55°C ;12 :56°C ;13 :58°C ;14 :60°C ;15 :62°C ;16-20 引物终浓度为 I. 0 μΜ/ L ;16 :55°C ;17 :56°C ;18 :58°C ;19 :60°C ;20 :62°C。
[0030] 图3转化体方法特异性检测；M :Trans 2K plus II DNA Marker ;I :空白对照；2 : 阴性对照；3 :T4-1-1样品；4-13 :分别为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6、样品 7、样品8、样品9、样品10。
[0031] 图4转化体方法检测限测试结果。A灵敏度测试结果；M:Trans 2Κ plus II DNA Marker ;1 :空白对照；2 :阴性对照；3-7 分别为：T4-1-1 阳性 1%、0· 5%、0· 1%、0·05%、 0· 01%。B 检测限测试结果；M :Trans 2Κ plus II DNA Marker ;1-10 :Τ4-1-1 阳性 0· 05% 的10个平行；11-20 :Τ4-1-1阳性0.01%的10个平行。
[0032] 实施例1转基因玉米Τ4-1-1的品系特异性定性检测引物的筛选
[0033] 1、引物的设计
[0034] 根据Τ4-1-1插入基因载体和其3'端旁侧序列的连接区序列（SEQ ID No. 9)为靶 序列设计4对转化体特异性引物，引物序列如下：
[0035] 引物1 :扩增产物片段大小为293bp
[0036] I-F ：TCGTGAGAGTTTAGCGATTGG(SEQ ID No.I)
[0037] I-R ：ATGACGTTATTTATGAGATGGGTTT(SEQ ID No. 2)
[0038] 引物2 :扩增产物片段大小为176bp
[0039] 2-F ：GAATCTTAGCTGTCCATGTTGGG(SEQ ID No. 3)
[0040] 2-R：GGATAAATTATCGCGCGCG(SEQ ID No. 4)
[0041] 引物3 :扩增产物片段大小为270bp
[0042] 3-F ：AATGGAATCTTAGCTGTCCA (SEQ ID No. 5)
[0043] 3-R ：GACGTTATTTATGAGATGGGTTTTT(SEQ ID No. 6)
[0044] 引物4 :扩增产物片段大小为122bp
[0045] 4-F ：GTGTTGGATCAATGGCTGCC(SEQ ID No. 7)
[0046] 4-R ：AACTAGGATAAATTATCGCGCG(SEQ ID No. 8)
[0047] 2、引物的扩增及筛选
[0048] 扩增外源插入载体和玉米基因组的连接区序列，扩增产物的大小均不小于100bp。 应用通用的PCR反应条件，用4对引物进行PCR扩增，设置2个重复；从扩增结果可