见，这4 对引物均能特异性地从T4-1-1样品中扩增出预期片段，但是用SEQ ID No. 1和SEQ IDNo. 2 所示的引物扩增的293bp的条带最为清晰且引物二聚体较少（图1)，因此，本发明优先采用 SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示引物作为检测转基因玉米T4-1-1的品系特异性PCR检测 的引物。
[0049] 实施例2基于转基因玉米T4-1-1品系外源插入片段的旁侧序列建立的T4-1-1品 系特异性定性PCR检测方法
[0050] -、植物基因组DNA的提取与检测
[0051] 1植物DNA提取
[0052] (I) IOOmg样品研磨成粉末后转移至2mL离心管中；
[0053] (2) ImL预热至65 °C的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样，并轻柔混合，65 °C水 浴40min，期间颠倒混匀数次；
[0054] (3) 12000 Xg离心15min。转移上清至一新离心管，加入等体积酸、氯仿-异戊醇 (24 :1)，充分混合。重复本操作1次；
[0055] (4) 12000 Xg离心10min，取上清，加入2/3体积异丙醇，1/10体积乙酸钠。-20°C 放置2小时或更长时间；
[0056] (5) 12000 Xg离心10min，弃上清，加入500 μ L，70 %乙醇溶液，并颠倒离心管数 次。离心，弃上清，充分挥发乙醇，干燥DNA。
[0057] (6)加 100 μ L水溶解DNA，用重蒸馏水将DNA溶液浓度调制为IOOng/ μ L，储存 于-20°C备用。
[0058] 备注：CTAB提取缓冲液的配制
[0059] 600mL 蒸馏水中加入 81. 7g NaCl 和 20g CTAB,再加入 IOOmL 的 IM Tris-HCl (pH 7. 5)溶液，IOOmL的0. 5M EDTA (pH 8. 0)溶液，调pH至8. 0,加水定容至lOOOmL。高温高压 (103. 4kPa/121°C )条件下灭菌20min后使用。
[0060] 2DNA 检测
[0061] 取5ul提取的DNA溶液，以0. 8%的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来判断 DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提DNA的浓度和纯度。
[0062] 二、检测引物
[0063] 所使用的检测引物为上述实施例1中筛选的引物对1，其核苷酸序列为SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。
[0064] 三、PCR反应体系和条件优化
[0065] 调整优化PCR反应体系中引物的终浓度，设置0. 1 μ M、0. 2 μ M、0. 5 μ M、1. 0 μ M等 4个浓度梯度，并以55 °C、56 °C、58 °C、60 °C、62 °C为退火温度进行PCR反应的扩增。
[0066] 结果表明，在所设的不同引物浓度和不同退火温度条件下均能扩增出预期大小的 片段，但在引物终浓度为〇. 2 μ M、退火温度为58°C时效果最好（图2)。
[0067] 经过优化，T4-1-1转基因玉米品系特异性定性PCR检测的体系见表1，PCR反应程 序见表2。
[0068] 表1转基因玉米T4-1-1品系特异性定性PCR检测体系
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[0071] 表2转基因玉米T4-1-1品系特异性定性PCR反应程序
[0073] 实施例3T4-1-1转基因玉米品系特异性定性PCR检测方法的特异性分析
[0074] -、实验材料
[0075] 样品1 :非转基因玉米吉单180、吉东26、沈玉21、郁青281，等量混合制成一个样 品。
[0076] 样品2 :水稻阴性。
[0077] 样品3 :大豆阴性。
[0078] 样品4 :棉花阴性。
[0079] 样品5 :油菜阴性。
[0080] 样品 6 :转基因玉米 GA21、NK603、T25、TC1507、Btll、Btl76、M0N863、M0N89034、 MIR604,混合制成1个样品，含量各5%。
[0081] 样品7 :转基因水稻科丰6号、克螟稻、M12、TT51，混合制成一个样品，含量各5%。
[0082] 样品 8 :转基因大豆 356043、305423、(^127、]\?^89788、厶2704-12、6了540-3-2，混合 制成1个样品，含量各5%。
[0083] 样品 9 :转基因棉花 M0N1445、M0N88913、LLC0TT0N25、M0N15985,混合制成 1 个样 品，含量各5%。
[0084] 样品10:转基因油菜]\^1、]^8、1^1、1^2、1^3、了45、(^7235，混合制成1个样品，含 量各5%。
[0085] 以上实验材料由中国农科院生物技术研究所和四川省农业科学院生物技术核技 术研究所提供。
[0086] 二、实验方法及结果
[0087] 以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2为检测引物对，按照实施例2所建立的T4-1-1转 基因玉米品系特异性定性PCR检测方法对各种材料进行扩增。结果表明，在T4-1-1转基因 玉米基因组中扩增得到了目的片段大小的条带（293bp)，在其他样品基因组中均未扩增得 到目的片段大小的片段（图3)。通过测序分析表明T4-1-1转基因玉米基因组中扩增获得 的序列与目的扩增片段序列一致。上述结果表明，引物SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2建立 的转基因玉米T4-1-1品系特异性定性PCR检测方法具有高度特异性。
[0088] 实施例4转基因玉米T4-1-1品系特异性定性PCR检测方法的检出限分析
[0089] 以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2为特异性引物对，按照实施例2所建立的转基因 玉米T4-1-1品系特异性定性PCR检测方法进行检出限分析。
[0090] T4-1-1阳性DNA和其受体DNA按不同质量比混合，制备T4-1-1质量分数分别为 0. 1 %、0. 5 %、0. 1 %、0. 05 %、0. 01 %的样品，按照优化的反应体系及反应程序进行PCR扩 增，实验结果表明，转基因水稻PAl 10-15成分为1 %、0. 5 %、0. 1 %、0. 05 %的PCR反应体系 中均能扩增出大小为293匕？的目的片段（图44)。转基因玉米了4-1-1的含量为0.05%时， 在10个平行中均能稳定扩增出预期大小条带，而该条带在阳性〇. 01 %的10个平行中扩增 呈现不稳定性（图4B)，因此本发明转基因玉米T4-1-1品系特异性定性PCR检测方法的检 测限为0.05%。
【主权项】
1. 用于检测转基因玉米T4-1-1的品系特异性PCR检测引物，其核苷酸序列选自以下引 物对1~4中任一： 引物对 I:SEQIDNo. 1 和 SEQIDNo. 2 ; 引物对 2 : SEQIDNo. 3 和 SEQIDNo. 4 ; 引物对 3 : SEQIDNo. 5 和 SEQIDNo. 6 ; 引物对 4 :SEQIDNo. 7 和 SEQIDNo. 8。2. 用于检测转基因玉米T4-1-1的品系特异性PCR检测试剂盒，其特征在于包括有权利 要求1所述的PCR检测引物。3. 权利要求2所述的试剂盒，所述PCR检测引物是权利要求1所述的引物对1。4. 一种转基因玉米T4-1-1品系特异性的PCR定性检测方法，其特征在于使用权利要求 1所述的PCR检测引物。5. 权利要求4所述的方法，步骤如下： (1) 提取待检测水稻样品的DNA; (2) 以提取的DNA为模板，用权利要求1所述的PCR检测引物，建立PCR扩增体系，并进 行PCR扩增； ⑶根据是否能扩增出核苷酸序列为SEQIDNo. 10的DNA片段的条带，确定品系特异 性：如果扩增出该条带，则确定被检测的样品是转基因玉米T4-1-1 ;如果不能扩增出，则确 定不是转基因玉米T4-1-1。6. 权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述PCR检测引物是SEQIDNo. 1和SEQ IDNo. 2所示的引物对。7. 权利要求5所述的方法，所述PCR反应体系为：反应体系的总体积为25. 0yL，其中， 10XPCR缓冲液 5yL，dNTPs混合溶液 2yL，10ymol/LSEQIDNo. 1 所示的引物 0? 5yL， 10以111〇1/15￡0 10吣.2所示的引物0.5 1^，51]/1^6〇1&9酶0.2 1^，2511^/10嫩模板 2. 0yL，余量为双蒸水。8. 权利要求5所述的方法，PCR扩增条件为：94°C，5min;94°C，20s，58°C，20s，72°C， 20s，35 个循环；72°C，2min。 9. SEQIDNo. 10所示序列的核苷酸在检测转基因玉米T4-1-1品系特异性中的应用。
【专利摘要】本发明设计了用于检测转基因玉米T4-1-1的品系特异性的4对PCR检测引物。本发明还提供了包含所述引物的试剂盒。经实验证明，应用本发明的检测引物对转基因玉米T4-1-1品系特异性的PCR定性检测，特异性强、灵敏度高。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105177172
【申请号】
【发明人】周正富, 张维, 余桂容, 徐利远, 林敏
【申请人】中国农业科学院生物技术研究所
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月30日