用于卵巢癌诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测，具体涉及用于人卵巢癌诊断的microRNA生物标志物及检 测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 卵巢癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，发病率居于第三位。但由于缺 乏有效的早期诊断方法以及卵巢癌耐化疗、易转移复发的特点，使得卵巢癌的病死率居妇 科恶性肿瘤的首位，5年存活率低于30%，严重威胁女性的生命健康。虽然研究已发现与上 皮性卵巢癌（epithelial ovarian carcinoma，E0C)恶性转化及耐药有关的各种分子信号 途径，但如何进行早期诊断和对化疗反应的预测仍然是EOC临床治疗的一个重大挑战。
[0003] MicroRNA(miRNA)是最新发现的长约18-25个核苷酸的非编码小分子RNA，在进 化上高度保守，数量约占基因组的1 %，现已普遍认为miRNA与人类疾病的发生有密切的联 系，其发现为人们在基因水平认识癌症提供了新思路。MiRNA在转录或转录后水平负调控蛋 白质编码基因的表达：通过与其靶基因 mRNA非完全互补或近似完全互补结合，导致mRNA降 解或抑制其翻译。人类基因组约30%的基因受miRNA调控，在细胞的生长、增殖、分化和凋 亡等多方面发挥着重要的生物调节作用。研究已证实miRNA的异常调控与肿瘤形成及进展 关系密切。MiRNA的靶基因多数是参与转录、信号转导、肿瘤发生等生物学效应的基因。随 着miRNA与癌症关系的不断深入研究，发现miRNA并不只是参与了癌症形成的初期阶段，还 涉及到疾病病情变化、对药物的敏感性、患者预后等等多方面。随后基于miRNA的癌症基因 治疗顺势登上舞台，凸显出很大的研究价值。
[0004] MiRNA在卵巢癌中的研究显示了 miRNA在卵巢癌诊治中的研究价值及应用前景。 越来越多的研究表明，微小RNA表达水平的改变与EOC的发生和发展有关。miRNA表达失 调，不仅在卵巢癌的发病机制和肿瘤特征中发挥重要作用，在EOC的诊断、预后和对治疗反 应的预测中也有潜在的尚未明确的作用。因此，探索miRNA与卵巢癌发生、转移、耐药和复 发的相关性及其调控机制，可能是提高卵巢癌疗效、改善卵巢癌患者预后的手段之一。但 是，目前对miRNA自身调控机制的认识仍较浅，而其在卵巢癌中的研究也亟待深入。miRNA 与卵巢癌发生、发展、转移及耐药等有关。分离和检测与肿瘤相关的miRNA分子，阐明其作 用机制和临床意义，对于提高肿瘤早期诊断和治疗水平具有重要的意义。miRNA可能成为调 节卵巢癌耐药性的潜在靶点，以及推测患者对化疗药物反应和生存率的早期标记。现在已 经被广泛接受的是，miRNA可以旁分泌或内分泌到局部微环境或进入循环，调节多种生物学 功能，包括癌症细胞生长。在血清、血浆或其他体液中循环的miRNA可能不仅作用于细胞， 也作用于身体的其他部位。测量循环中miRNA水平，这种简单、方便、损伤小的检测方法对 肿瘤患者的诊断、治疗和预后有着深远的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供用于卵巢癌诊断的microRNA生物标志物及检测试剂盒。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007] -组用于人卵巢癌诊断的microRNA生物标志物，所述microRNA生物标志物由如 下 microRNA 组成：has-miR-193b_3p、has-miR-155_5p、has-miR-145_5p、has-miR-132_3p 和has-miR-143_3p ;所述has-miR-193b_3p的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示；所述 has-miR-155-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；所述has-miR-145-5p的核苷酸序 列如SEQ ID NO. 3所示；所述has-miR-132-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；所述 has-miR-143-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0008] 进一步地，所述microRNA生物标志物为人血清microRNA生物标志物。
[0009] 所述的microRNA生物标志物在筛选人卵巢癌的肿瘤诊断药物中的用途。
[0010] 一组人卵巢癌诊断用microRNA引物、探针的组合，所述microRNA引物、探针的组 合包括：has-miR-193b-3p 引物、探针；has-miR-155-5p 引物、探针；has-miR-145-5p 引物、 探针；has_miR_132_3p 引物、探针；has_miR_143_3p 引物、探针。
[0011] 进一步地，所述microRNA引物包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引 物。
[0012] 进一步地，has-miR-193b_3p的反转录引物序列如SEQ ID NO. 6所示，定量PCR前 引物序列如SEQ ID NO. 7所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO. 16所示；has-miR-155-5p 的反转录引物序列如SEQ ID NO. 8所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO. 9所示，定量 PCR后引物序列如SEQ ID NO. 16所示；has-miR-145-5p的反转录引物序列如SEQ ID NO. 10 所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO. 11所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO. 16所 示；has-miR-132-3p的反转录引物序列如SEQ ID NO. 12所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO. 13所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO. 16所示；has-miR-143-3p的反转录引物 序列如SEQ ID NO. 14所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO. 15所示，定量PCR后引物序 列如SEQ ID NO. 16所示；各microRNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO. 17所示。
[0013] 所述的人卵巢癌诊断用microRNA引物、探针的组合在制备或筛选人卵巢癌的肿 瘤诊断药物中的用途。
[0014] 一种人卵巢癌的肿瘤诊断试剂盒，包括所述的miRNA引物、探针的组合。
[0015] 进一步地，所述的人卵巢癌的肿瘤诊断试剂盒还包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、 MgCl2、DEPC水、Taq酶以及标准品和/或对照品。
[0016] 本发明的优点：
[0017] 本发明将卵巢癌与癌旁组织表达差异明显（差异表达量大于2个fold，RT-PCR 中 CT 值小于 30)的 5 种 miRNA has-miR-193b-3p、has-miR-155-5p、has-miR-132-3p、 has-miR-145_5p及has-miR-143_3p进行血清学表达分析，结果表明这5种miRNA在 血清中稳定表达，血清miRNA的表达与组织具有很好的一致性，has-miR-193b-3p、 has-miR-155_5p 和 has-miR-145_5p 表达下调，has-miR-132_3p 和 has-miR-143_3p 表达上 调。这5种miRNA可以作为卵巢癌诊断的生物标志物，且联合诊断的灵敏度与特异性显著 高于单一 miRNA诊断的灵敏度和特异性。
【附图说明】
[0018] 图 1-图 5 分别显不 has-miR-193b_3p、has-miR-155_5p、has-miR-145_5p、 has-miR-132_3p和has-miR-143_3p单独用于区分卵巢癌样本和正常对照的ROC曲线；
[0019] 图 6 显不为 has-miR-193b_3p、has-miR-155_5p、has-miR-145_5p、 has-miR-132_3p和has-miR-143_3p联合用于区分卵巢癌样本和正常对照的ROC曲线。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。实施 例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条 件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0021] 实施例1 :卵巢癌组织差异性miRNA的筛选
[0022] 1对象和方法
[0023] I. 1标本来源
[0024] 在取得患者知情同意后，收集江苏省人民医院2013年4月-2014年6月经病理证 实为卵巢癌患者手术后标本8对，包括癌组织标本以及配对的距离癌组织3厘米以上范围 的癌旁组织，所有患者在术前均未接受过化疗和放疗。
[0025] 1. 2主要仪器设备
[0026] 台式离心机：Eppendorf Mini spin(美国）Eppendorf centrifuge 58IOR(美国）
[0027] 核酸浓缩仪：Eppendorf concentrator 53〇1 (美国）
[0028] 紫外分光光度计：DU640、天平（Beckman公司产品）
[0029] 紫外交联仪：GS GENE LINKER UV Chamber(BK)-RAD 公司产品）
[0030] 水浴锅（Memert公司产品）
[0031] 杂交盒、芯片、芯片扫描仪：LuxScan_10K/A(Capitalbio公司产品）
[0032] 水平摇床：TDK-2 (北京通达科技有限公司）
[0033] 凝胶成像分析仪：⑶S-7600 (UPV产品）
[0034] 超净工作台（Memert公司产品）
[0035] 实时荧光 PCR 仪：ABI PRISM7500 (美国）
[0036] 1. 3主要实验试剂
[0037] Trizol、糖原（