一种利用自体骨髓间充质干细胞治疗各种严重皮肤损伤的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于再生医学技术领域，涉及体外分离、扩增骨髓间充质干细胞，以及制备生物制剂治疗皮肤损伤等技术。
【背景技术】
[0002]皮肤是人体的第一道天然防御屏障，具有防止体液流失，阻挡外界的细菌病毒和异物等诸多功能，对人体起到保护作用。当皮肤受到损伤时，要立即进行治疗使伤口闭合，否则会产生一系列并发症状如体内电解质紊乱、免疫平衡失调、脓毒症、弥散性血管内凝血等，严重时会危及生命。随着现代医疗水平的提高，目前对于皮肤损伤已有突破性的治疗方法，主要有金属Ag及其衍生制剂、皮肤移植、人造皮肤等，但仍有一半以上的损伤对治疗保持抗性，导致伤口长期不能愈合。一些严重性皮肤损伤，如:糖尿病足、急慢性皮肤溃烂、严重烧伤和创伤及皮肤癌等，目前没有有效的治疗手段。在我国每年新增约70万例严重性皮肤损伤的患者，而患者无法得到有效的治疗，长期处于痛苦之中。
[0003]金属Ag及其衍生制剂作为化学药物治疗法，在临床上应用较多。虽然此方法对于抗感染具有较好的疗效，但近年来许多研究表明此方法对皮肤组织有毒性，不利于损伤部位皮肤再生。皮肤移植法虽然能在短时间内使创伤部位闭合，但由于自体皮肤有限，对于较大面积的皮肤损伤仍无能为力，而异体皮肤移植存在免疫排斥，有一定风险。人造皮肤通常是使用动物胶原组织制备人工皮肤，虽然人造皮肤可以批量化生产供应，但其不具有自身皮肤的柔韧性，也不能促进自身皮肤的生长。上述三种常用方法用于皮肤损伤治疗后的复发率较高。目前还有一些利用皮肤细胞体外培养制备的人工皮肤，但存在移植后降解过快、疤痕较重等问题，也限制了其在临床上的应用。因此，寻找一种对于皮肤损伤治疗安全性强、治愈率高，术后副作用小的方法已成为临床上的热门研究课题。
[0004]近年来干细胞治疗作为一种新的治疗人类疾病的途径被广泛关注，早在2002年Science就将其列为年度值得关注的六大热门科技领域之首。骨髓间充质干细胞(BoneMarrow Stem Cells, BMSCs)是一种来自人体骨髓组织中的单核细胞，且具有多种分化潜能。本发明采用自体BMSCs，除具有易于获取、易于体外扩增培养、临床应用安全性高等特点外，更避免了伦理学争端。研究表明BMSCs可分化为血管细胞、成纤维细胞、表皮细胞等皮肤再生的重要组成部分，为干细胞治疗皮肤损伤提供了理论依据。本发明通过将自体扩增的BMSCs涂抹到患者皮肤创伤部位表面或采用喷剂、敷疗的方法作用于伤患处，利用干细胞的趋化性和损伤部位的人体微环境，定向分化为相应皮肤组织，使损伤部位快速愈合。BMSCs与传统方法治疗皮肤损伤相比具有治愈时间短，治疗后损伤部位复原效果好等优势，具有广阔的临床研究价值和市场前景。
【发明内容】
[0005]本发明运用的核心技术为BMSCs的体外分离提取和培养扩增、BMSCs细胞制剂的制备以及临床治疗技术的实施和操作。
[0006]骨髓采集:将皮肤消毒后，利用一次性骨髓穿刺针从患者两侧髂后上肌各采集骨髓30毫升，每侧采集三个点，每个点采集10毫升骨髓。在洁净低温下，采集的骨髓样本立即送往GMP实验室进行间充质干细胞的分离和提取。
[0007]骨髓有核细胞(BoneMarrow NucleusCells，BNCs)的分离提取:骨髓在450rpm/min下离心6-8min，上半部透明部分转移到新的锥形管。在1500rpm/min下离心6min，沉淀有核细胞。将上清取出与RBCs骨髓液混合后再次离心，得到更多有核细胞。用PBS悬浮有核细胞并进行计数。
[0008]自体富含血小板血清(Platelet Rich Plasma，PRP)的制备:将患者自体外周血在450rpm/rpm下离心20min。离心后小心取出不含任何红细胞(Red Blood Cells，RBCs)的上层血清，获得自体PRP。
[0009]自体血小板裂解液(Platelet Lysate，PL)的制备:将制备的PRP立刻置于_20°C下进行冷冻，冷冻后立即放入37°C水浴中解冻，获得PL。
[0010]自体不含血小板血清(Platelet Poor Plasma，PPP)制备:将制备PRP后剩余的外周血在1500rpm/min条件下离心lOmin，小心将上清收集，得到PPP后，并立即冷冻保存。
[0011 ] BMSCs的分离提取与培养扩增:将BNCs分离提取步骤中获得的细胞接种到培养瓶中。加入DMEM+10%自体PL的培养液置于37°C、饱和湿度、5%的CO2浓度的培养箱内开始原代培养，每2?3天更换一次培养液，去除未贴壁的细胞。培养7天左右时，用0.25%胰酶消化后离心收集细胞，重复上述步骤继续传代培养，传代所用培养液为AMEM+10%自体PL。
[0012]BMSCs的冻存:自体PPP和99%二甲基亚砜(DMSO)按体积比9:1的比例缓慢混匀配成冻存液，放入冰水混合物中预冷15?20min。将细胞悬浮在冻存液中，并分装到冻存管中，利用程序降温仪将细胞降温至_80°C后转移到液氮罐中长期保存。
[0013]细胞制剂制备:根据患者的实际需求选取P2或P3代的BMSCs，收集细胞制备成一定比例的细胞制剂。将制备好的细胞制剂于24h内移植于患者损伤部位。
[0014]如骨髓采集所述:将皮肤常规消毒后，对患者进行局部麻醉，利用肝素化的骨髓穿刺针从髂骨的顶端采集骨髓，4°C保存，待工作人员取样。
[0015]如BMSCs冻存过程所述:以l°C/min降至-4°C，然后以10°C/min降至-20°C，再以I°C/min降至-40°C，最后以10°C/min降至-80°C，取出冻存管迅速放入液氮罐中长期保存。
[0016]如细胞制剂制备所述:每Iml细胞制剂组成成分包括:I?3 X 16个BMSCs、Iml自体PRP、20?50mmol的0&(:12、10~50单位的凝血酶、10~301^表皮生长因子，环丙沙星10呢。每平方厘米损伤面积所用细胞制剂量为0.1ml。
[0017]与现有技术相比，本发明优点在于:公开了一种利用自体骨髓间充质干细胞治疗严重皮肤损伤的方法，包括BMSCs的分离、培养和冻存以及BMSCs制剂的制备和临床应用方法。BMSCs取自患者自体，避免了疾病传播的危险和免疫排斥反应。本方法采用移植的方式为患者治疗，其时间短，过程简单，可操作性强。使用该方法治疗各种严重性皮肤损伤，能够更快更好的使伤口愈合，减少患者痛苦。
[0018]BMSCs移植到伤口表面后会促进产生转化生长因子(TGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源生长因子(PDGF)、P物质等生物活性物质，能够促进损伤部位组织再生，迅速使伤口愈合。且通过此方法治疗后的再生组织和人工皮肤或药物治疗相比，更接近损伤前的组织形态，提高治疗后患者的生活质量。
【附图说明】
图1是BMSCs培养第3天图；图2是BMSCs培养第4天图；图3是BMSCs培养第5天图；
图4是BMSCs培养第6天图；图5是BMSCs培养第7天图；图6是临床治疗图1图；图7是临床治疗图2图。
【具体实施方式】
[0019]【具体实施方式】一:BMSCs的分离提取和培养扩增。
[0020](I)患者骨髓及外周血采集:通过表皮常规消毒和局部麻醉，利用一次性肝素化的骨髓穿刺针在髂后上肌多点采集骨髓