UP-F: 5’-GAATTGCGTCCAATGTTTGAAAACG-3’
UP-R: 5’-TCTATTTTTTCCTCCTTTATGTTACCACTAC-3’
DN-F:5，-GTAGTGGTAACATAAAGGAGGAAAAAATAGAGCAAGCTGAAGAGACACAAGAAGAAC-3，
DN-R:5’-GTTGAACTAATGGGTGCTTTAGTTGAAGAACGTTTGATTCCCTGAAGTTCTATATC-3’
CR-F: 5，-TCTTCAACTAAAGCACCCATTAGTTC-3’
CR-R: 5’-TTATTCATTCAGTTTTCGTGCGGAC-3’
G-F:5 ’-CCAGTCCGCACGAAAACTGAATGAATAAATGAGTGATCGTCAGGCAGCCTTAG-3，
G-R: 5 ’-TGCTGCACTACTCCGTTATTATCCAAG-3’
UP为待敲除区域上游序列;DN为待敲除区域下游序列；CR为氯霉素表达盒和AraR表达盒的融合片段;G为待敲除区域片段。通过融合PCR方法将四个片段融合为一个DNA片段UP-DN-CR-G，然后直接转化枯草芽孢杆菌感受态细胞1A751，涂布含氯霉素(12.5 ng/yL)平板进行筛选，并以菌落PCR进行验证。挑选阳性克隆接种于无抗生素LB液体培养基中，37 °C、200 rpm条件下培养12?14 h，将菌液稀释涂布含壮观霉素(200 ng/yL)平板进行筛选，以菌落PCR进行验证，获得重组菌株1A751SD。
[0036]3)将重组表达质粒pMA5-PxyiA_RDPE转化基因敲除菌株1A751SD，涂布含卡那霉素(50 ng/μυ平板进行筛选，以菌落PCR进行验证，获得基因工程菌株1A751SD-XR。
[0037]4)将所构建菌株1A751SD-XR进行摇瓶发酵，待发酵液OD6qq达到0.8左右时分别添加0.0%、0.5%、I.0%、I.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%的木糖进行诱导。发酵72 h，进行酶活检测和SDS-PAGE分析(如图5所示)，具体方法同于实施例2。
[0038]结果显示，当添加木糖浓度仅为0.5%时，胞外的酶活便达到最高值63 U/mL，为基因未敲除菌株的1.7倍;SDS-PAGE分析与以上结果一致。对胞外木糖浓度进行测定，72 h剩余木糖浓度为3.6%。以上结果说明敲除基因xylAB阻断了枯草芽孢杆菌的木糖利用途径，提升了胞内木糖累积量，从而大大提高了 RDPE的诱导表达水平。
[0039]实施例5 7.5 L发酵罐发酵生产RDPE
采用分批-补料发酵方式对所构建工程菌株1A751SD-XR进行发酵评价。首先将甘油冻存管中工程菌株1A751SD-XR在平板上划线，挑取单菌落接种于装有5 mL种子培养基(SR培养基)的试管中，37°C、200 rpm条件下培养16?18 h，然后转接于装有30 mL种子培养基(SR培养基)的摇瓶(250 mL)中，37°C、200 rpm条件下培养16?18 h。将种子液(1%接种量)转入7.5 L发酵耀(New Brunswick Scientific co Inc, USA)中，装液量3.0 L，发酵培养基成分为3.0%蛋白胨、5.0%酵母提取物、2.0%可溶性淀粉和0.6%磷酸氢二钾，初始调整为pH7.2。通气量2.0 vvm，搅拌转速200?600 rpm，溶氧维持在20?40%，pH维持在7.2。发酵3 h后添加木糖使终浓度达到0.5%，以诱导目标蛋白的表达。待发酵液OD6qq稳定时，开始按照恒定流速补入8.0%可溶性淀粉，直到最终可溶性淀粉浓度达到4.0%。接种72 h后发酵结束，此时发酵液中RDPE的活性和产量最高，分别达到95 U/mL和2.6 g/L(如图6所示)。在此条件下，重组RDPE的表达量约占上清液总量的70%，全为可溶性状态。
【主权项】
1.一种高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌(BaciI Iussubtilis)基因工程菌株 1A751SD-XR。2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，其是以来源于质粒pMA5且包含木糖启动子PxyiA和瘤胃菌D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因rdpe的重组质粒为表达载体，以枯草芽孢杆菌为宿主构建得到的基因工程菌株，所述宿主是枯草芽孢杆菌168、1A751、WB600、WB700、WB800或以上菌株后代细胞中的一种。3.根据权利要求2所述的瘤胃菌D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因，其特征在于，其序列如 SEQ ID N0.1所示。4.根据权利要求2所述的宿主，其特征在于，其是以枯草芽孢杆菌1A751为出发菌改造而获得的基因工程菌株，命名为1A751SD。5.一种构建权利要求1，2和4任一所述基因工程菌株的方法，其特征在于，主要包括以下步骤:(I)PCR扩增或化学合成rdpe基因序列；(2)将rdpe基因插入表达质粒pMA5，构建重组表达质粒pMA5-RDPE;(3)将pMA5-RDPE转化枯草芽孢杆菌，获得重组菌株1A751-HR;(4)以三个诱导型启动子PxyiA、Pgiv和PsacB替换PMA5-RDPE上的组成型启动子PHpaII，分别构建重组表达质粒pMA5-Pxy ia-RDPE、pMA5-Pgiv—RDPE 和 pMA5-PsacB-RDPE;( 5)将pMA5-Pxy ia-RDPE、pMA5-Pgiv-RDPE和pMA5-Psac；B-RDPE分别转化枯草芽孢杆菌，获得重组菌1A751-XR、1A751-GR和1A751-SR;(6)敲除基因xylAB(xylA和xylB)，获得菌株1A751SD，导入重组表达质粒pMA5-PxyiA-RDPE，从而获得基因工程菌株IA751SD-XR。6.按照权利要求5所述的方法构建的重组表达载体pMA5-RDPE、pMA5_PxyiA-RDPE、pMA5_Pgiv-RDPE 和 pMA5-PsacB_RDPE。7.按照权利要求5所述的方法构建的基因工程菌株1A751-HR、1A751-XR、1A751-GR和1A751-SR。8.权利要求1-7任一所述基因工程菌株在分泌生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶中的应用方法。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，主要包括以下步骤:将重组菌用种子培养基活化后，将种子液以0.5%?5%接种量转入装液量50%?70%的发酵罐中，通气量1.0-2.0vvm，搅拌转速100?800 rpm，pH不作控制，于37°C培养;待发酵液OD6qq稳定后以恒定流速进行补料;发酵培养基成分为2.0%-4.0%蛋白胨、3.0%-7.0%酵母提取物、0.3%?0.9%磷酸氢二钾和1.0%?3.0%可溶性淀粉，初始pH 7.2；补料培养基为2.0%?8.0%可溶性淀粉；当基因工程菌株需诱导表达时，待发酵液OD6OO达到0.8时添加一定浓度的诱导物。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将重组菌用种子培养基活化后，将种子液以1.0%接种量转入装液量60%的发酵罐中，通气量2.0 vvm，搅拌转速200?600 rpm，pH控制在7.2，于37 °C培养;发酵培养基成分为3.0%蛋白胨、5.0%酵母提取物、0.6%磷酸氢二钾和.2.0%可溶性淀粉，初始pH 7.2;补料培养基为8.0%可溶性淀粉；当基因工程菌株需诱导表达时，待发酵液OD6OO达到0.8时添加一定浓度的诱导物。11.一种高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，以重组表达了瘤胃菌来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因rdpe的枯草芽孢杆菌为生产菌株，发酵生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶RDPE。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，构建基因工程菌株1A751-HR、1A751-XR、.1A751-GR、1A751-SR或1A751SD-XR;发酵培养基为2.0%?4%蛋白胨、3.0%-7.0%酵母提取物和.0.3%~0.9%磷酸氢二钾，pH 7.2；于37°C、200 rpm摇瓶发酵;当基因工程菌株需诱导表达时，待发酵液OD6qq达到0.8时添加一定浓度的诱导物。
【专利摘要】本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株高效分泌D-阿洛酮糖？3-差向异构酶的基因工程菌株及其构建方法。本发明首先获得了来源于瘤胃菌<i>Ruminococcus</i>？sp.？5_1_39B_FAA的D-阿洛酮糖？3-差向异构酶基因<i>rdpe</i>，构建重组表达质粒pMA5-RDPE并转化枯草芽孢杆菌，实现了RDPE在枯草芽孢杆菌中组成型分泌表达。通过比较三个糖诱导型启动子，得到最优诱导型启动子P<i>xylA</i>，并明显提高了RDPE的分泌水平。通过敲除木糖利用基因<i>xylAB</i>？(<i>xylA</i>和<i>xylB</i>)，阻断了枯草芽孢杆菌的木糖代谢途径，进一步提高了RDPE的分泌量，并使诱导剂木糖的最优诱导浓度由4.0%降低为0.5%。最终，采用分批补料方式，在7.5？L发酵罐中对工程菌株1A751SD-XR进行评价，RDPE的分泌水平最高可以达到95？U/mL？和2.6？g/L。
【IPC分类】C12R1/125, C12N1/21, C12N15/61, C12N15/75, C12N9/90
【公开号】CN105602879
【申请号】CN201610051547
【发明人】张大伟, 陈景奇, 付刚, 朱玥明, 孙媛霞
【申请人】中国科学院天津工业生物技术研究所
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年1月26日