骤四、把带根的受体植物苗插到转化溶液中；
步骤五、接通电源开始电泳；
步骤六、3小时后，将受体植物转入MSO固体培养基中，25 °C下暗培养3天；
步骤七、暗培养后的植株转入添加固体基质的花盆中，并于人气候室中诱导开花结实； 步骤八、从种子中筛选纯合的阳性转化子。
[0020]本实施例对30棵蒙古韭植株进行了遗传转化，结果23棵苗中检测到了几丁质酶基因的存在，PCR和核酸杂交检测的结果相吻合，并得到了纯合的阳性种子。从初步的研究结果来看，整体转化效率比较高。
[0021]实施例三，以白术为受体植株，转换外源基因为来自烟草的几丁质酶基因本实施例对白术植株进行了脉冲电泳辅助转基因试验，被转化的外源基因为来自烟草的几丁质酶基因。本实施例使用的白术苗来自本实验室。
[0022]本实施例包括如下步骤:
步骤一、从大田中采挖30棵健壮的白术苗作为受体；
步骤二、将包含有几丁质酶基因的农杆菌溶液在摇床上震荡培养，使OD值达到0.8;步骤三、步骤二得到农杆菌溶液在3800转/分钟的条件下离心3分钟，然后用pH为5.4的MSO液体培养基重悬，最后往悬浮液中加入190μΜ的乙酰丁香酮，得到转化溶液；
步骤四、把带根的受体植物苗插到转化溶液中；
步骤五、接通电源开始电泳；
步骤六、4小时后，将受体植物转入MSO固体培养基中，25 °C下暗培养2.5天；
步骤七、暗培养后的植株转入添加固体基质的花盆中，并于人气候室中诱导开花结实； 步骤八、从种子中筛选纯合的阳性转化子。
[0023]本实施例对30棵白术植株进行了遗传转化，结果21棵苗中检测到了几丁质酶基因的存在，PCR和核酸杂交检测的结果相吻合，并得到了纯合的阳性种子。从初步的研究结果来看，整体转化效率比较高。
[0024]实施例四
一种脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因装置，连接在转基因植株受体2的根须部21和茎叶部23的两端;转基因植株受体2置于包含有培养溶液7的容器I中；转基因植株受体2的根须顶部全部淹没在培养溶液7内；辅助农杆菌介导的植物转基因装置包括微电泳仪3和连接在其一端的直径为0.8-1.5毫米的金属管4，金属管4为目的基因通道，金属管4中设有若干孔，为目的基因进入植物的通道，其插入植株受体的近根部位的维管中；微电泳仪3包括正极31和负极32，其正极31通过一根总导线61和若干根分流导线62组成的正极导线6连接在植株受体2的叶、茎和生长点上，其负极32通过负极导线5穿过金属管4连接在培养溶液7内根须部21中间。本发明的辅助农杆菌介导的植物转基因装置，在现有的微电泳仪的基础上，将其正极31连接在转基因植株受体2的茎、叶等若干个生长点，将其负极32通过负极导线5连接在转基因受体植株的根须部21—侧的培养溶液7内，并且位于培养溶液7位置处的负极导线5外还套有金属管4，金属管4为目的基因提供通道。
[0025]在上述实施例中，微电泳仪3的电压为100-150毫伏，连接在其两端的负极导线5和正极导线6为铂丝或者银丝，保证转基因植株受体具有较高的转换率以及转换效率。
[0026]在上述实施例中，茎叶部22包括茎部23和叶面24，正极导线6分别与茎部23和叶面24连接的若干根分流导线62直接插入其对应的茎部23或叶面24，并且与茎部23连接的分流导线62数量不少于两根，与叶面24连接的分流导线62的数量也不少于两根，使得其具有更高的转换率。此外，正极导线6的分流导线62的数量与受体植物的茎部23或叶面24等生长点的数量保持一致，也就是说正极导线6尽可能多分出一些来，确保转基因植物整体被覆盖到电场下，无死角，减小嵌合体出现的概率。另外，金属管4用注射针头代替，也可以实现同样的转换效果。
[0027]本发明的实施例公布的是较佳的实施例，但并不局限于此，本领域的普通技术人员，极易根据上述实施例，领会本发明的精神，并做出不同的引申和变化，但只要不脱离本发明的精神，都在本发明的保护范围内。
【主权项】
1.脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因方法，其特征在于:包括如下步骤: 步骤一、收集长势良好、根系完整的受体植物苗备用； 步骤二、将包含有目的基因的农杆菌溶液在摇床上震荡培养，使其OD值达到0.4-0.8； 步骤三、步骤二得到的农杆菌溶液在3300-3800转/分钟的条件下离心1-3分钟，然后用pH为5-5.4的MSO液体培养基重悬，最后往悬浮液中加入100-200μΜ的乙酰丁香酮，得到转化溶液； 步骤四、把步骤一中准备好的带根的受体植物苗插到步骤三中得到的转化溶液中； 步骤五、接通电源开始电泳，电泳持续2-4小时； 步骤六、步骤五完成后将受体植物转入MSO固体培养基中，23-27°C下暗培养2-3天，所述MSO培养基因为不添加植物激素的MS培养基； 步骤七、暗培养后的植株转入添加固体基质的花盆中，并于人工气候室中诱导开花结实； 步骤八、从步骤七中得到的植株种子中筛选纯合的阳性转化子，便可得到转基因植物种子。2.根据权利要求1所述的脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因方法，其特征在于:所述受体植物在步骤五中进行电泳时，负极插入受体植物近根端的微管组织中，正极可分流出若干支路，分别插入受体植物上端的茎、叶脉和生长点组织中。3.根据权利要求1或2所述的脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因方法，其特征在于:所述受体植物在步骤五中进行电泳时，其电压为100-150毫伏。4.根据权利要求1所述的脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因方法，其特征在于:所述受体植物为完整的植株，大田种植苗、温室苗或试管苗均可。5.使用的脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因装置，其特征在于:连接在转基因植株受体(2)的根须部(21)和茎叶部(23)的两端;所述转基因植株受体(2)置于包含有培养溶液(7)的容器(I)中；所述转基因植株受体(2)的根须顶部全部淹没在培养溶液(7)内； 所述辅助农杆菌介导的植物转基因装置包括微电泳仪(3)和连接在其一端的直径为0.8-1.5毫米的金属管(4)，所述金属管(4)为目的基因通道，其上设有若干通孔(41)，并且所述金属管(4)插入植株受体(2)的根须部(21)位置的培养溶液(7)内； 所述微电泳仪(3)包括正极(31)和负极(32)，其正极(31)通过一根总导线(61)和若干根分流导线(62)组成的正极导线(6)连接在植株受体(2)的叶、茎和生长点上，其负极(32)通过负极导线(5)穿过金属管(4)连接在培养溶液(7)内根须部(21)中间。6.根据权利要求5所述的脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因装置，其特征在于:所述微电泳仪(3)的电压为100-150毫伏，根据权利要求5所述的脉冲电脉辅助农杆菌介导的植物转基因装置，其特征在于:所述受体植物的茎叶部(22)包括茎部(23)和叶面(24)，所述正极导线(6)分别与茎部(23)和叶面(24)连接的若干根分流导线(62)直接插入其对应的茎部(23)或叶面(24)，并且与茎部(23)连接的分流导线(62)数量不少于两根，与叶面(24)连接的分流导线(62)的数量也不少于两根，确保转基因植物整体被覆盖到电场下，无死角，减小嵌合体出现的概率。7.根据权利要求6所述的脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因装置，其特征在于:所述正极导线(6)的分流导线(62)的数量与受体植物的茎部(23)或叶面(24)等生长点的数量保持一致。
【专利摘要】本发明公开了一种脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因方法，将包含有目的基因的农杆菌置于电场中后，带负电荷的农杆菌在电场强度下由负极向正极泳动，从而进入植物体内的各个组织器官中。由于细胞壁是以纤维丝为基质组成的，含有许多小孔，在电场作用下农杆菌迁移过程中可通过细胞壁的小孔，并进一步通过细胞膜而进入植物细胞。本发明所采用的方法，极大地提高了基因转化效率，并且缩短了实验周期，特别是对于那些没有建立起再生体系的植物，具有一定的应用价值。
【IPC分类】A01H5/10, C12N15/84, C12M1/42
【公开号】CN105602986
【申请号】CN201610155430
【发明人】张边江, 陈全战, 唐宁
【申请人】南京晓庄学院
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年3月18日