2-l，2-2,2-3)。 4、重复性试验结果 PRRSV NADC30-like (TJnh株）、HP-PRRSV(TJM-F92株）、Classical-PRRSV(VR2332株） 经3次重复RT-PCR扩增，均能扩出大小分别为628bp、93化P及102化P左右的目的条带，表明 本发明具有良好的重复性。
[0026] 5、临床样品检测结果 对2014-2016年送检的342份PRRSV疑似样品检测，结果检出NADC30-1化e PRRSV共11 份，HP-PRRSV共62份，Classical-PRRSV共21 份，阳性率分别为3.2%，18.1%，6.14%(图3)。检 测结果与I抓XX ELISA检测试剂盒检测结果相比较，相比试剂盒化ISA检测，本发明多检出 6份，其余样品检测符合率为100%;详见下表：
=、结论： (1)本发明试剂盒能够从发病临床病料中鉴别诊断NADC30-like PRRSV，且还可同时对 HP-PRRSV或Classical-PRRSV不同类型病毒混合感染进行鉴别诊断。
[0027] (2)本发明试剂盒具有特异性强，对临床常见CSFV、PRV、PCV2、PPVJEV、BVDV、SIV 病毒PCR均无特异扩增。
[002引 （3)本发明试剂盒具有高敏感性，对PRRSV NADC30-like (TJnh株）、册-PRRSV (TJM-F92株）、Classica^PRRSV(VR2332株）的最小DNA 检出量分别为 2.1pg、3.4pg、4.5pg。
【附图说明】： 图 1 特异性试验结果；其中 1-10 分别为 TJnh、TJM-F92、VR2332、CSFV、PRV、PCV2、PPV、 JEV、BVDV、SIV;M: IOObp Ladder，从上向下依次为：2000，1000，900，800，700，600，500，400， 300,200,100； 图2为敏感性试验结果;其中图2-1 PRRSV NADC30-like (Unh株)敏感性试验结果，1-5号浓度依次为21化旨、219旨、2.19旨、0.219旨、0.0219旨；图2-2册斗31?5￥(1'厕斗92株）敏感性 试验结果，1-5号浓度依次为340pg、34pg、3.4pg、0.34pg、0.034pg;图2-3 Classical-PRRSV (VR2332株)敏感性试验结果，1-5号浓度依次为450pg、45pg、 M:IOObp Ladder， 从上向下依次为:2000,1000,900,800,700,600,500,400,300,200,100; 图3为部分阳性样品RT-PCR扩增结果；其中1-18号为部分临床阳性样品，其中5号为 Classical-PRRSV, 1016bp; 10,17号为NADC30-like PRRSV，623bp(17号为NADC30-like PRRSV与HP-PRRSV混合感染）；其余为HP-PRRSV，926bp;M: IOObp Ladder，从上向下依次为： 2000,1000,900,800,700,600,500,400,300,200,100； 图4为A、B场临床样品RT-PCR检测结果:其中I:A场采集临床样品；2 :B场采集临床样品 3:试剂盒阳性对照；4:Marker IOObp Ladder;5:HP-PRRSV(TJM-F92株）阳性对照；6:试剂盒 阴性对照，
【具体实施方式】： 下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为 本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范 围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发 明实质和范围的前提下，对运些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属 于本发明的保护范围。
[0029] 实施例1: NADC30-1 ike PRRSV临床样品检测 1、样品准备 A场采集临床样品，B场采集临床样品，PRRSV NADC30-like (TJnh株），HP-PRRSV(TJM-F92株），生理盐水空白对照。
[0030] 2、RNA 提取 取样品20化L，分别加入Trizol Reagent 600化，振荡混匀，室溫作用5 min,后加入 200化氯仿，振荡混匀，室溫作用5 minD4 °C、12 000 r/min离屯、10 min,取上清至新的 1.5 mL离屯、管中，加等体积异丙醇，颠倒混匀，室溫放置15 minn4 °C、12 000 r/min离屯、 10 min,弃上清；500化75%乙醇洗涂。4 °C，12 000 r/min离屯、10 min,自然干燥，加20 化DEPC水溶解。
[0031 ] 3、CDNA 合成 反应体系为（总体积20化）：SXbuffer 化URandom primer 化L，dNTPs(2.5 mmol/ L)化L，MgC12 化L，RNase Inhibito;r(40 U/uL) 0.5 化，M-MuLV Reverse Transc;rip1:ase (5 UAiUO.S 化，RNA 模板 10 化。反应条件为：30 °C 10 min，42 °C 解育 I h，95 °C 5 min,4 C保存备用。
[0032] 4、RT-PCR 扩增 PCR反应体系为20 yL:10XPCR buffer 2 化，dNTPs(2.5 mmol/L)2 化，Mgcl2 I 化， 上、下游引物各I化jTaq (5 UAiL)0.5化，cDNA模板5化，加去离子水至20化，混合 均匀，同时设立阴性和阳性对照。PCR反应条件:95°C5min; 94°C40s，56°C 30s，72°C Imin，共 30个循环;最后72 °C延伸lOmin。
[0033] 5、结果判定 结果判定通过观察样品PCR扩增产物电泳检测图，根据有无特异性扩增产物的目的条 带出现来判定。
[0034] 电泳步骤如下： (1)配制50X TAE电泳缓冲液(P册.5):称取Tris-碱242g，冰醋酸57.Ig, NasEDTA* 2出0 18. 61g，去离子水调整体积到1L。
[003引（2)制胶:将50 X TAE电泳缓冲液稀释50倍，配制成1 X TAE电泳缓冲液，称取0. Sg琼 脂糖微波炉加热，使其溶于IOOmL的1 X TAE电泳缓冲液中，加入10化漠化乙锭(Img/mL)。 [0036] (3 )电泳:调节电压至80V，电泳时间20min。
[0037] (4)观察结果:本次电泳结果图如附图4所示，点样顺序从左至右依次为： 1: A场义集临床样品； 2:B场采集临床样品 3:PRRSV NADC30-like (Unh株）阳性对照； 4：Marker IOObp Ladder； 5: HP-PRRSV (T JM-F9 2株）阳性对照； 6:空白对照，即生理盐水； 从电泳结果可看出，阳性对照出现特异性扩增条带，阴性对照无扩增条带，实验成立。 故判定A场采集临床样品无特异性扩增条带，为PRRSV NADC30-like感染阴性;B场采集临床 样品有特异性扩增条带，为PRRSV NADC30-like感染阳性。
【主权项】
1. 一种用于鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的特异性引物，其特征在于它的 上游引物序列为：5-ATGTTGTGCTTCCTGGGGTTG-3， 下游引物序列为:5-CTTGACAGGGAGCTGCTTGA-3 所述的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒包括:HP-PRRSV，Classical-PRRSV，NADC30-like PRRSV〇2. -种用于鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的特异性引物的PCR试剂盒，其特征在 于所述试剂盒主要包括权利要求1所述的特异性引物、PCR Buffer、dNTPs、rTaq酶、Marker 及阳性和阴性标准品，其特异性引物： 上游引物序列为：5-ATGTTGTGCTTCCTGGGGTTG-3， 下游引物序列为:5-CTTGACAGGGAGCTGCTTGA-3。3. 采用权利要求2所述的PCR试剂盒进行检测的方法，其特征在于按如下的步骤进行： (1) 提取待测样品的核酸； (2) 以特异性引物对检测样品进行PCR扩增反应； (3) 扩增反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳； (4) 观察电泳检测图，根据特异性目的条带判定结果。4. 权利要求2所述的PCR试剂盒检测方法，其特征在于：反应总体积为25yL，包括10 X Buffer 2.5yL，dNTPs 2. OyL，上游引物1. OyL下游引物1. OyL，rTaq酶0.5yL，待测样品的核 酸4.0yL，超纯水补至总体积25yL;所述扩增反应的反应条件为:95°C预变性5min，94°C变 性 30s，56°C 退火 30s，72°C 延伸 458,30个循环，72°(：延伸1〇11^11。5. 权利要求2所述的PCR试剂盒检测方法，其特征在于：步骤中所述特异性扩增产物的 大小为NADC30-like PRRSV 628bp、HP-PRRSV 931bp、Classical-PRRSV 1021bp。6. 权利要求2所述鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的特异性引物的PCR试剂盒在检 测临床样品NADC30-like PRRSV感染方面的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种鉴别NADC30-like？PRRSV？的PCR检测试剂盒及检测方法。所述试剂盒主要包括特异性引物和PCR反应试剂，所述特异性引物还能够同时检测HP-PRRSV及Classical-PRRSV。本发明针对NADC30-like？PRRSV提供了一种快速、敏感、特异PCR检测试剂盒和检测方法，为NADC30-like？PRRSV早期快速诊断及其综合防控提供了基础。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/70, C12N15/11
【公开号】CN105603127
【申请号】CN201610192662
【发明人】孙英峰, 李志 , 路超, 韩伟, 王利丽, 杨春蕾, 任卫科, 田向学, 李富强, 张莉, 李秀丽, 付永利, 于海霞, 张立新, 李泽青
【申请人】天津市畜牧兽医研究所
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年3月30日