用于愈合伤口的脂质纳米颗粒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及脂质纳米颗粒W及它们作为伤口愈合用的药物组合物的用途，特别是 作为局部施用的纳米颗粒悬浮液、敷料(dr e S S i ng)或凝胶。
【背景技术】
[0002] 慢性伤口治疗已成为世界范围内卫生保健系统的一个主要问题，代表了巨大的经 济和公共卫生挑战。诸如人口老龄化、吸烟、糖尿病和肥胖等危险因素的现行增加会使伤口 愈合过程复杂化和减慢，造成难W愈合的伤口。
[0003] 包括高压氧化yperbaric oxygen)、负压和手术清创的一些姑息疗法(palliative treatments)目前正被用于治疗老年人的慢性伤口。此外，在市场上可W购得许多用于治疗 慢性溃瘍的商用合成敷料，虽然呈现出有限的治疗功效。
[0004] 表皮生长因子化GF)通过刺激细胞的迁移、分化和增殖并且还通过促进肉芽组织 形成而在组织再生及修复中发挥重要作用。从临床角度看，EGF已经被用来增强伤口愈合， 尤其是糖尿病足溃瘍。临床试验中已经显示了低级神经性溃瘍中局部EGF应用的有益效果 的证据;但是，局部EGF制剂的效果可能被减弱，尤其是在高级伤口化igh-grade wound)中， 因为在运种类型的伤口中已经鉴定出增加的蛋白酶活性。Rengen-D 150?是一种在印度制 造用于治疗I级或II级糖尿病溃瘍的含有15化g/g重组人表皮生长因子(riiEGF)的凝胶。其 需要每日给药两次，平均治疗时间为6周。Heberpro!;饭，一种含有75iig rhEGF的冻干制剂， 通过病灶内注射(损伤内注射，intralesional injection)每周给药S次。其在在阿尔及利 亚、阿根廷、哥伦比亚、古己、多明尼加共和国和委内瑞拉销售。在20位糖尿病患者中进行的 试验性研究证明，拭筑'berprat愈作为一种可行性和安全性治疗，在全厚溃瘍患者中促进慢 性伤口的愈合。然而，rhEGF的短半衰期需要连续暴露(至少6-12小时）W增强对上皮细胞有 丝分裂的影响。因此，为了在伤口愈合中取得显著疗效，在剂量、递送系统和安全方面，需要 优化生长因子如rhEGF的给药。为了运个目的，加 U et aLiSOlCK^notechnology promotes the full-thickness diabetic wound healing effect of recombinant human epidermal growth factor in diabetic rats，，，Wound Repair Regen 2010；15: 499-505)已经开发出了一种制备具有2%rhEGF含量的聚合物聚（乳酸-共-乙醇酸）（化GA) 纳米颗粒的方法。rhEGF的封装(囊封，encapsulation)效率为85.6 %并且提供长达24小时 的生物活性rhEGF的受控释放。与未封装的rhEGF相比，在糖尿病大鼠中诱导的全厚伤口 (full-thickness wound)上每日一次局部施用运些纳米颗粒促进了较高的成纤维细胞增 殖水平和最快的愈合速率。
[000引此外，专利EP 1 987 817 Bl要求保护一种生产含有rhEGF的聚合物微球的方法， 该聚合物微球用于病灶内（intralesional)浸润到糖尿病患者的下肢中W预防糖尿病截 肢。所开发的具有1.6-2.4%rhEGF含量的微球显示出每天5和IOiig的rhEGF受控释放，持续 14天，并且与等效量的非封装rhEGF相比，在人体中加快了损伤愈合。
[0006]令人惊奇的是，本发明人们已经开发出了具有高封装效率的包含表皮生长因子的 脂质纳米颗粒，其W每周两次的局部制剂进行应用，改善了伤口愈合。
【发明内容】
[0007] 根据一个方面，本申请设及一种脂质纳米颗粒(本发明的纳米颗粒），其包含至少 一种在室溫下为固体的脂质、至少一种非离子表面活性剂、和一种生长因子。
[0008] 根据进一步的方面，本申请设及一种用于制备本发明的脂质纳米颗粒的方法，其 特征在于包含下列步骤：
[0009] (i)制备包含非离子表面活性剂的水性溶液，
[0010] (ii)制备包含处于有机溶剂中的在室溫下为固体的脂质的亲脂性溶液，
[0011] (iii)将水性溶液(i)加入到亲脂性溶液(ii)中，使所得到的混合物经受超声处理 (sonication)，直到获得乳状液(乳液，emulsion)，
[0012] (i V)蒸发(i i i)中获得的乳状液中的有机溶剂，和 [001引（V川欠集脂质纳米颗粒，
[0014]其中，生长因子被加入到溶液(ii)中。
[0015] 根据进一步方面，本申请设及一种药物组合物(本发明的药物组合物），其包含本 发明的脂质纳米颗粒W及药物载体。
[0016] 根据进一步的方面，本申请设及本发明的脂质纳米颗粒W及设及包含该脂质纳米 颗粒的药物组合物，其作为医药的用途W及其在促进伤口愈合中的用途。
[0017] 从W下说明W及随附的权利要求书中，本申请的其它目的、特征、优点和方面将变 得对本领域技术人员显而易见。
【附图说明】
[0018]图1显示了加载有riiEGF的脂质纳米颗粒对细胞增殖的体外效应的图示。
[0019] 图2显示了尼罗红-SLN制剂和尼罗红-NLC制剂的细胞摄取的显微照片。
[0020] 图3显示了 (A)加载有riiEGF-的SLN和(B)加载有riiEGF-的NLC对伤口闭合的体内效 应的图示，和（C)未处理的对照大鼠 W及使用空化N、空化C、rhEGF-MS、对照空MS、游离 rhEGFJhEGF-SLN 20yg JhEGF-SLNlOiigJhEGF-MX 20ygJhEGF-MX IOiig处理的大鼠中 的伤口照片。数据显示为平均值±标准偏差（5.0.)，*显著大于未经处理的对照（*口< 0.05、*卸<0.0 l和***p<0.0 Ol);显著大于空MS对照. 05、国!)<0.0巧日. OOl) ;? 显著大于空化N(*p<0.05、**p<0 . Ol和***p<0 . OOl);▼显著大于空化. 05、'^p<0.0 l 和'^^p<0 . OOl) ;〇显著大于游离;rhEGF(〇p<0.05、〇〇p<0 . Ol和〇mp〈〇 . OOi);?显著大于 rhEGF-MS 7扣g(S<0.05、Wp<〇. Oi和OWp(C). OOi);▲显著大于rhEGF-化N 10yg(Ap<0.05 <0.01 和 *^<0.001)。
[0021] 图4显示了加载有rhEGF的脂质纳米颗粒在炎症评分(A，C)和在再上皮化评分(B, D)上的体外效应的图示。数据显示为平均值±S.D.。*显著大于未处理的对照(*p<0.05、**p <0.0 l和***p<0.0 Ol);显著大于对照空MS("p<0.05、-p<0.Ol和.OOl) ;*显著大于 空化 ^?9<0.05、**9<〇.〇1和《??9<〇.〇〇1);，显著大于空化(：八<0.05、'^9<0.01和'^口< 0.0 Ol) ;〇显著大于游离riiEGF(〇p<0.05、mp<〇. Oi和cc〇p〈Q. QQi);?显著大于rhEGF-MS 7化 g(、<0.05、?%<〇. Oi和〇〇%<〇. OOi)产显著大于'1166。-5^^10蛇(^<0.05、 <0.001)。
[0022] 图5显示了化N-尼罗红、NLC-尼罗红和石蜡-尼罗红的皮肤摄取的显微照片(A)和 图示(B)(任意像素亮度值(ABU)，在角质层、表皮和真皮中校正背景巧光）。*显著大于石蜡-尼罗红（*p<0.05、**p<0 . Ol和***p<0 . OOl)。插入数值给出了相对于石蜡霜（paraf f in cream)(阳E)的相应渗透增强。
[0023] 图6显示了加载有化37的脂质纳米颗粒对细胞增殖的体外效应的图示。
[0024] 图7显示了riiEGF和化37的组合对细胞增殖的体外效应的图示。
[002引图8显示了（4)在第15、25、36和43天，空化(：、游离^166。和^166。-化0 20雌对猪中 的伤口闭合的体内效应的图示，和(B)使用空化C、游离rhEGF和rhEGF-NLC 20yg处理的猪中 的伤口照片。
[0026] 图9显示了（A)在第15、25和43天，不同研究组(空MX、游离riiEGF和riiEGF-NLC 20y g)中上皮长度的图示，和(B)在第15、25和43天，伤口的组织学图像。数据显示为平均值± S.D.。林*显著大于空MX和游离riiEGF(i)<0.0 Ol)。
[0027] 图10显示了在第15(A)、25(B)和43(C)天，伤口愈合延伸(mm)的图示。数据显示为 平均值± S. D.。相比于空化C和游离riiEGF组，林卸<0.0 Ol。
【具体实施方式】
[0028] 本发明的第一方面设及一种脂质纳米颗粒，其特征在于包含至少一种在室溫下为 固体的脂质、至少一种非离子表面活性剂、和一种生长因子。
[0029] 必须指出的是，如在本申请中使用的单数形式的"一个(a)"、"一种（an)"和"该 (the)"包括复数形式，除非上下文另有明确规定。
[0030] 在本发明的上下文中，脂质纳米颗粒是指具有固体基质的纳米范围的颗粒。所述 基质由在室溫下为固体的脂质组成，所述脂质在体溫下也为固体。在固体脂质纳米颗粒 (SLN)的情况下，所述基质仅由固体脂质组成。在纳米结构的脂质载体(化C)的情况下，所述 基质由固体脂质与液体脂质（油）的共混物组成，但是运种共混物在室溫下也为固体并且在 体溫下也为固体（Muller et al.,2002,Solid lipid nanopa;rticles(SLN)and nanostructured lipid carriers(NLC) in cosmetic and dermatological preparations.Advanced Drug Delivery Reviews 54(1)S131-S155)。术语"加载有生长因 子"是指嵌入或封装在纳米颗粒基质中的生长因子。因此，在一个特定的实施方式中，所述 脂质纳米颗粒是SLN并且在另一个特定的实施方式中，所述脂质颗粒是化C。因此，在一个特 定的实施方式中，所述脂质纳米颗粒是SLN或化C。
[0031] 在一个特定的实施方式中，所述生长因子选自于由属于表皮生长因子化GF)家族、 转化生长因子e(TGF-e)家庭、成纤维细胞生长因子(FGF)家族、血管内皮生长因子(VEGF)、 粒细胞-巨隧细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血小板衍生生长因子（血小板源性生长因子， platelet-derived growth factor，PDGF)、结缔组织生长因子（CTGF)、肿瘤坏死因子-a家 族(TNFa)和膜岛素样生长因子(IGF)的生长因子组成的组。优选地，所述生长因子属于表皮 生长因子化GF)家族，并且更优选地，所述生长因子是表皮生长因子化GF)。在一个特定的实 施方式中，所述脂质纳米颗粒是加载有EGF的化N(在下文中也称为EGF-化N)和/或加载有 EGF的化C(在下文中也称为EGF-化C)。在本发明的特定实施方式中，所述表皮生长因子是重 组人表皮生长因子（rhEGF)。所述rhEGF可W商业获得（Peprotech、Promega、Pharmchem等） 或者通过重组DNA技术来生产，如在例如Marioka-Fujimoto et al. (Modified enterotoxin signal sequences increase secretion level of the recombinant human epidermal growth factor in Escherichia coli.J Biol Chem.1991Jan 25；266 (3) :1