728-32)中所描述的，或在专利申请WO 91/18999A1中所描述的。在一个特定的实施方 式中，本发明的脂质纳米颗粒具有的生长因子(特别是EGF)的比例相对于脂质纳米颗粒的 总重量为0.01重量％至20重量％，优选0.1重量％至10重量％，并且更优选地相对于脂质纳 米颗粒的总重量为0.5重量％至5重量％。
[0032] 如上所述，本发明的脂质纳米颗粒包含至少一种在室溫下为固体的脂质。在本发 明的上下文中，"在室溫下为固体的脂质"应理解为在45°C下为固体的脂质，可W是饱和的 或不饱和的。所述定义包括甘油一醋、甘油二醋、甘油=醋、脂肪酸、类固醇和蜡。同样地，可 W使用运些脂肪酸的衍生物，该衍生物应理解为由酸基团与醇或胺反应所产生的那些化合 物，诸如例如所述脂肪酸的醋类或酷胺类。因此，在一个特定的实施方式中，所述在室溫下 为固体的脂质选自于酷基甘油醋、具有至少10个碳原子的链的饱和脂肪酸或其衍生物W及 其混合物。在一个优选的实施方式中，所述酷基甘油醋选自于栋桐酸硬脂酸甘油醋（ Pre紐0.1敏.ATO5 )、单硬脂酸甘油醋（Imwitor? 900)和山斋酸甘油醋（CompritQl愈 888AT0)。在更优选的实施方式中，所述脂质组分是栋桐酸硬脂酸甘油醋(Prec虹〇1⑥AT05)。
[0033] 在本发明一个特定的实施方式中，所述脂质纳米颗粒具有的固体脂质的比例相对 于该脂质纳米颗粒的总重量为1重量％至40重量％，优选5%至15%。
[0034] 如上所述，本发明的脂质纳米颗粒还包含非离子表面活性剂。术语"非离子表面活 性剂"应理解为具有疏水性和亲水性部分的化合物，其能够产生乳状液。在本发明的一个特 定实施方式中，所述非离子表面活性剂选自于聚山梨醇醋、聚乙二醇共聚物和聚丙二醇共 聚物、W及它们的混合物。在一个特定的实施方式中，所述非离子表面活性剂选自于由吐 溫、司盘（Span)、泊洛沙姆(Poloxamer)和它们的混合物组成的组。在一个优选的实施方式 中，所述非离子表面活性剂是吐溫80,并且在另一个优选的实施方式中，所述非离子表面活 性剂是吐溫80和泊洛沙姆的混合物。
[0035] 在本发明的一个特定实施方式中，非离子表面活性剂的比例相对于脂质纳米颗粒 的总重量为0.01重量％至1〇重量％，优选0.05%至5重量％。
[0036] 在本发明的一个特定实施方式中，本发明的脂质纳米颗粒包含1 %~40 %在室溫 下为固体的脂质、0.01%~10%非离子表面活性剂、和0.01%~20%生长因子，所有给出的 百分比均相对于该脂质纳米颗粒的总重量按重量计。
[0037] 在一个特定的实施方式中，本发明的脂质纳米颗粒可W任选地提供为冻干的或干 燥的（desiccated)产品。
[0038] 在第二方面，本发明设及第一方面的脂质纳米颗粒，其进一步包含在室溫下为液 体的脂质。在本发明的上下文中，"在室溫下为液体的脂质"应理解为在室溫下并且在低于 45°C下为液体的脂质，其可W是饱和的或不饱和的。在室溫下为液体的脂质选自于不饱和 的或饱和的脂肪酸醋、油、脂肪酸W及链的甘油=酸醋(具有少于10个碳原子）、W及它们的 混合物(例如，辛酸和癸酸的甘油立醋(~％1>'0倾)、大豆油、肉豆違酸异丙醋、藍麻油）。在 一个优选的实施方式中，将Mygli细膨用作液体脂质。在一个优选的实施方式中，所述脂质 纳米颗粒的脂质组分是栋桐酸硬脂酸甘油醋（Precirol饭AT05)与辛酸和癸酸的甘油S醋 (Miglyol?)的组合。在本发明第二方面的另一个变型中，当将在室溫下为液体的脂质加入 到所述纳米颗粒中时，其比例相对于脂质纳米颗粒的总重量为1~30重量％，优选5~15重 量％。在另一个实施方式中，比例固体脂质:液体脂质为0.5:10至5:10。
[0039] 在本发明的第=方面，本发明设及一种用于制备在上述段落中定义的本发明第一 方面的脂质纳米颗粒的方法(本发明的方法1)，其特征在于包含下列步骤：
[0040] (i)制备包含非离子表面活性剂的水性溶液，
[0041] (ii)制备包含处于有机溶剂中在室溫下为固体的脂质的亲脂性溶液，
[0042] (iii)将水性溶液(i)加入到亲脂性溶液(ii)中，使所得到的混合物经受超声处理 直到获得乳状液，
[0043] (iv)蒸发(iii)中获得的乳状液的有机溶剂，和
[0044] (V)收集纳米颗粒，
[004引其中，生长因子被加入到溶液（i i)中。
[0046] 使用运种方法1获得的脂质纳米颗粒是化N。所述第一步（i)由将非离子表面活性 剂溶解于水性溶液优选水中组成。制备亲脂性溶液的第二步（ii)通过将在室溫下为固体的 脂质溶解于有机溶剂中来进行，其中所述固体脂质的比例相对于有机溶剂的总重量为至少 1重量％。将生长因子，优选EGF，且更优选riiEGF，与脂质一起溶解于所述有机溶剂中。有机 溶剂的选择在很大程度上取决于脂质组分。在本发明的一个特定的实施方式中，所述有机 溶剂选自于二氯甲烧、丙酬、氯仿和它们的混合物，更优选二氯甲烧。
[0047] -旦制备了两种溶液，即将水性溶液（i)加入到亲脂性溶液（ii)中。然后，使所得 到的混合物经受超声处理直到获得乳状液。随后，通过本领域技术人员已知的任何方法蒸 发有机溶剂。在一个特定的实施方式中，所述有机溶剂蒸发步骤是通过将乳状液在机械揽 拌下保持至少60分钟，优选至少120分钟来进行的。在除去有机溶剂之后，亲脂性溶液凝固， 并且获得纳米颗粒悬浮液，然后通过离屯、过滤。最后，洗涂所收集的脂质纳米颗粒并且将其 再悬浮于纯化水中。
[0048] 在本发明的第四方面，本发明设及一种用于制备在上述段落中定义的本发明第二 方面的脂质纳米颗粒的方法(本发明的方法2)，其特征在于包含下列步骤：
[0049] (i)制备包含非离子表面活性剂的水性溶液，
[0050] (ii)制备亲脂性溶液，其包含固体脂质与液体脂质的共混物，该共混物在高于该 液体脂质的烙点的溫度下烙融，
[0051 ] (i i i)将水性溶液(i)加热至与亲脂性溶液(i i)相同的溫度，
[0052] (iv)将水性溶液（i)加入到亲脂性溶液（ii)中，使所得到的混合物经受超声处理 直到获得乳状液，
[0053] (V)将乳状液(iv)在5°C±3°C冷却W使得脂质再结晶并且形成纳米颗粒，和
[0054] (Vi)收集纳米颗粒，
[0055] 其中，生长因子被加入到溶液（i i)中。
[0056] 使用运种方法2获得的脂质纳米颗粒是化C。第一步（i)由将非离子表面活性剂溶 解于水性溶液优选水中组成。制备亲脂性溶液的第二步(ii)通过在高于液体脂质的溶点的 溫度下烙融固体脂质和液体脂质的共混物来进行。生长因子，优选EGF并且更优选riiEGF，与 脂质共混物一起溶解。
[0057] 一旦将水性溶液(i)加热到已经烙融脂质共混物的溫度，即将水性溶液(i)加入到 亲脂性溶液(ii)中。然后，使所得到的混合物经受超声处理直到获得乳状液。随后，在5°C± 3°C的溫度下将乳状液(iv)冷却W允许脂质再结晶和纳米颗粒形成。在脂质再结晶之后，获 得纳米颗粒悬浮液，通过离屯、将其过滤。最后，洗涂收集的脂质纳米颗粒并且再悬浮于纯化 水中。
[0058] 第五方面设及通过方法1获得的脂质纳米颗粒和通过方法2获得的脂质纳米颗粒。
[0059] 本发明的第一、第二和第五方面的脂质纳米颗粒的特征在于，具有等于或小于1皿 的平均颗粒尺寸，它们优选具有处于Inm和1000 nm之间的平均尺寸，更优选150nm~400nm。 所述平均尺寸可W通过本领域技术人员众所周知的标准方法来测量，并且其被描述于例如 W下实验部分中（表1、实施例2)。此外，所述脂质纳米颗粒可W具有表面电荷(通过Z电势测 量），其大小可W为-50mV至+SOmV(表1，实施例2)。另外，所述脂质纳米颗粒具有大于40%的 封装效率，特别地对于SLN大于70 %，并且对于化C大于95 % (表1，实施例2)。
[0060] 本发明的脂质纳米颗粒的一个重要特征是，它们W持续释放的方式释放所加载的 生长因子。加载有生长因子的脂质纳米颗粒提供的释放曲线的特征在于:与表面相关蛋白 的百分比有关的初始释放（突发释放(爆发释放，burst release))，随后是4小时至24小时 的快速释放阶段，最后是24小时至72小时的较慢释放，W释放全部量的生长因子为终止(表 3, 实施例2)。
[0061] 运种持续释放特征提供了一个重要的优势，因为与使用游离EGF的那些相比使得 治疗更加安全，使用游离EGF的治疗需要持续给药生长因子和更高的剂量W实现相同的治 疗效果。此外，通过降低剂量，可W进一步减少不期望的不良副作用，因为给药更高剂量的 生长因子不再是必要的，原因在于W较小但更有效的剂量随着时间推移而释放封装的生长 因子。最后，生长因子的持续释放允许减少给药的次数，提高患者治疗依从性，并进而提高 患者生活质量。
[0062] 本发明人惊奇地发现，本发明的脂质纳米颗粒，即加载有EGF的脂质纳米颗粒，与 游离EGF相比，显示出预料不到的更大的成纤维细胞体外增殖速率(实施例3,第3.1节，图 1)。另外，本发明的脂质纳米颗粒，即EGF-SLN和EGF-NLC，能够进入细胞(实施例3，第3.2节， 图2)。
[0063] 有趣的是，体内研究显示，与在4次病灶内施用中给药的30化g rhEGF相比，在伤口 闭合(图3.A、C)、炎症解决（图4.A)和再上皮化过程(图4.B)方面，WlO和20iig剂量riiEGF的4 次局部给药riiEGF-SLN进一步改善了伤口愈合。另外，体内研究显示，与在4次病灶内施用中 给药的30化g rhEGF相比，在伤口闭合（图3.B、C)、炎症解决（图4.C)和再上皮化过程（图 4. D)方面，W10和20iig剂量rhEGF的4次局部给药riiEGF-化C进一步改善了伤口愈合。另外， 获得的数据表明，与一病灶内剂量75iig的聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)微球rhEGF-MS相比，在 伤口闭合方面，在研究的8天和11天后，封装于化N和化C中的20或IOiig rhEGF大幅度提高了 伤口愈合过程。因此，与常见的可生物降解和水解降解的聚合物诸如PLGA的使用相比，将脂 质用作纳米颗粒用的基质材料是有利的，因为脂质纳米颗粒允许脂质纳米颗粒中加载的分 子的局部给药。
[0064] 此外，实施例6(图8-10)所示的体内研究显示，区域和局部给药rhEGF-化C能够增 强伤口愈合，运不仅仅是在伤口愈合速度和愈合的伤口数目（伤口闭合测量)方面，而且还 在W新生成的微血管、成纤维细胞迁移、胶原沉积和炎症反应的演化为基础的愈合质量方 面。此外，运些结果是非常相关的，因为与使用病灶内给药75yg游离rhEGF治疗的损伤相比， 使用20iig局部给药的rhEGF-化C治疗的动物显著增强了愈合。运些数据与来自封闭伤口和 再上皮化的百分比数据一起，表明将rhEGF纳米封装为rhEGF-化C允许局部给药，并且允许 降低剂量，因为封装防止了生长因子在伤口位置处降解。
[0065] 在趣的是，与石蜡霜相比，EGF-SLN和EGF-NLC显示出改善的皮肤渗透能力（实施例 3,第3.4节，图5)。运是一个重要的优势，因为运允许局部给药加载于脂质纳米颗粒中的分 子。
[0066] 因此，本发明的第六方面设及一种药物组合物，其包含如任何上述段落中所描述 的在本发明的第一、第二和第五方面中定义的本发明的脂质纳米颗粒、W及药物载体。在运 方面的优选实施方式中，所述药物组合物是局部给药的。其可W凝胶、乳膏、软膏、敷料或作 为贴剂的形式进行给药。因此，在一个特定的实施方式中，所述药物组合物进一步包含胶原 蛋白、透明质酸、芦苔(aloe vera)、纤维蛋白、carbopoK咬巧合物和纤维素衍生物。
[0067] 另外，本发明的第屯方面设及在任何上述段落中描述的本发明第一、第二和第五 方面中定义的脂质纳米颗粒，其作为医药的用途。另外，在第八方面，本发明设及在第六方 面中定义的药物组合物，其作为医药的用途。
[0068] 考虑到上述的体内结果，本发明的另一方面