一种根结线虫诱吸剂及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种根结线虫诱吸剂及其应用，属植物病害防治技术领域。
【背景技术】：
[0002] 根结线虫(Meloidogyne spp.)是多种农作物的重要病原之一。根结线虫在全世界 农作物上每年造成的经济损失就高达1000亿美元(Oka et al. ,2009)。在国内，近年来随着 设施蔬菜栽培面积扩大，连作、设施环境密闭和高温高湿等原因导致根结线虫的危害日益 加重，致使蔬菜减产30-50%，严重时甚至绝收(王艳艳等，2014)。在山东寿光的几十万亩大 棚番茄种植中，即使施用大剂量的化学杀线剂，根结线虫病株率仍在25%以上，减产约 30%。根结线虫的二龄幼虫是侵染作物的唯一虫态，其分泌的蛋白类物质能诱发植物根细 胞增生成巨大细胞，进而堵塞植物吸收营养和水分的导管，引起作物生长不良、萎蔫、枯死 等症状(卢志军，2012)。
[0003] 目前防治根结线虫病常用的措施有轮作、化学防治、生物防治和栽培抗病品种等。 轮作被广泛应用，但由于根结线虫寄主范围广，一般只有水旱轮作才有一定的效果，但水旱 轮作在很多区域无法实施。栽培抗线虫的作物品种是简单有效的措施，遗憾的是现有的各 种作物栽培品种中能抗线虫病的少之又少;此外，抗源材料的匮乏加大了选育抗性品种的 难度(韩生成等，1999)。利用线虫天敌微生物研发的生物杀线剂，因其对人畜的安全性和环 境的友好性一直被寄予很大的期望。目前，利用食线虫真菌(Pochonia chlamydosporia、 Paeci lomyces I i lacinus、Hirsutel la spp ·，Arthrobotrys spp.等）和生防细菌 (Pasteuria penetrans、Bacillus thuringiensis、Pseudomonas spp·、Streptomyces avermi til is等）国内外注册登记的商品化线虫生防制剂近20种;但由于防效相对较低和不 稳定很难推广应用(Davies&Spiegel，2011)。化学防治是目前防治根结线虫的主要措施。但 随着溴甲烧的禁用(Ristaino&Thomas，1998)，以及涕灭威、灭线磷、咲喃丹、威百亩等化学 杀线虫剂高毒高残等弊端的显现，目前农业上兼顾防效和安全性的化学杀线剂仅有噻唑 膦、阿维菌素等为数不多的几个产品。
[0004] 根结线虫在土壤中呈无规律的不均匀分布，这给防治带来了极大的困难。常用的 生物杀线剂、化学杀线剂的用量一般为2-3公斤/亩。若采用穴施于根部的方法，一旦过了药 剂的持效期，根部之外的线虫仍可侵染作物造成损失;若采用撒施混土的方法，药剂给过度 稀释，很难保证良好的防治效果。
[0005] 嗅觉趋化性（Olfactory chemotaxis)是线虫中常见的一种行为（Bargmann，et al .，1993)。土壤微生物可产生某些挥发物性物质作为线虫的嗅觉趋化性物质，诱吸线虫靠 近。这些气味性物质被认为与线虫的趋化行为(Zhang，et al. ,2005)以及线虫对食物的选 择有关（Pradel，et al ·，2007) 〇
[0006] Bacillus me thy lotrophi CUs是韩国人2010年作为新种报道的一种可以代谢甲 醇、促进植物生长的细菌(Madhaiyan et al.，2010)，该细菌对多种植物病原真菌还有很好 的拮抗效果(莫明和等，2012);但该微生物对根结线虫的诱吸功能及其在线虫防治中的应 用至今未见公开报道。
[0007] 参考文献：
[0008] Bargmann Cl,Hartwieg EjHorvitz HR.1993.Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C.elegans. Cell,74,515-527.
[0009] Davies K, Spiegel Y.2011.Biological control of plant-parasitic nematodes:Building coherence between microbial ecology and molecular mechanisms . In series : Progress in Biological Control，Vol·11，Springer，Doi 10.1007/978-1-4020-9648-8.
[0010] Madhaiyan M , Poonguzhal i S , Kwon SffjSa TM.2010.Bacillus methylotrophicus sp.nov.a novel species of methanol utilizing,plant-growth promoting bacterium isolated from rice. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,60:2490-2495.
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[0012] Pradel E ,et al.2007.Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans.Proc Natl Acad Sci USA.104,2295-2300.
[0013] Ristaino J,Thomas ff.1998.Agriculture,methyl bromide and the ozone hole:can we fill the gap?Plant Disease,81:964-997.
[0014] Zhang Y,Lu H,Bargmann Cl.2005. Pathogenic bacteria induce aversive olfactory learning in Caenorhabditis elegans.Nature,438,179-184.
[0015] 韩生成，刘清利，孟颂东，杨怀义，田波.1999.植物寄生线虫分子生物学和抗线虫 基因工程策略的研究进展.农业生物技术学报，7(4): 395-399.
[0016]卢志军.2012.蔬菜根结线虫病害综合治理.中国农业出版社.
[0017]莫明和，林碧莲，黄英，周峰.2012. -种广谱性拮抗植物病原真菌的生防微生物及 其应用，专利号ZL 201010561580.3.
[0018]王艳艳，魏珉，杨凤娟，等.2014.蔬菜根结线虫致病机理及其防控技术研究进展. 中国蔬菜，2:9-14.
【发明内容】
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[0019] 本发明的目的在于提供一种根结线虫诱吸剂及其应用。
[0020] 本发明的根结线虫诱吸剂经如下步骤得到：
[0021 ] ( 1 )、利用分离细菌的常规方法从根结线虫的体内分离到B a c i I I u s 11161:1171〇1：1'〇口11；[(3118]\1〇-113菌株；13.11161:1171〇1：1'〇口11；[(3118]\1〇-113菌株已于2015年12月9日保存 于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保 藏号：CGMCC No .11851;
[0022] (2)、B.methylotrophicus Mo-TB菌株试管斜面种子培养:将该菌株的菌体接种到 常规牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上，32°C下培养2天后获得斜面种子；
[0023] (3)、B.methylotrophicus Mo-TB菌株液体种子的液体培养:将斜面种子接种到三 角瓶中的常规牛肉膏蛋白胨液体培养基中，32°C，150rpm条件下摇床培养3天；
[0024] (4)、B.methylotrophicus Mo-TB菌株发酵罐大量培养:将液体种子按V/V为5%〇的 比例接入发酵罐中的常规牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在10-10000升发酵罐中的培养条件 控制在:温度32 °C，搅拌速度200rpm，发酵时间4天；
[0025] (5)、诱吸剂的制备:经发酵罐培养获得的B.methylotrophicus Mo-TB菌株菌体及 其代谢物经过喷雾干燥获B.methylotrophicus Mo-TB菌体原粉，将B.methylotrophicus Mo-TB菌体原粉加入糖蜜中，需保证B.methylotrophicus Mo-TB菌株在糖蜜中的活菌数含 量在5X IO9个/毫升以上，搅拌均匀后用氢氧化钠稀溶液将pH调至7.2即制得该根结线虫诱 吸剂。
[0026] 所述的根结线虫诱吸剂在诱吸土壤中根结线虫二龄幼虫中的应用。
[0027] 所述的根结线虫诱吸剂与阿维菌素、噻唑膦化学农药混配后在防治根结线虫病中 的应用。
[0028]本发明的有益效果在于：
[0029] 1、诱吸剂对一平方米内土壤中根结线虫二龄幼虫的诱吸率在80 %以上。
[0030] 2、诱吸剂与阿维菌素、噻唑膦化学农药混配使用，提高了防治根结线虫病的效果。
[0031] 3、本发明的根结线虫诱吸剂具有成本低、无残留、对人畜安全的特点，能显著提高 常规杀线虫农药的防效效果。
【具体实施方式】：
[0032] 1.本发明中B.methylotrophicus Mo-TB菌株的培养及诱吸剂的制备
[0033]本发明的生物诱吸剂经如下步骤得到：
[0034] ( 1 )、利用分离细菌的常规方法从根结线虫的体内分离到B a c i I I u s methylotrophicus Mo-TB菌株；B.methylotrophicus Mo-TB菌株已于2015年 12月9 日保存 于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No . 11851;利用细菌16S rRNA基因扩增通用引物（5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'，5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'）经PCR扩展B.methylotrophicus Mo-TB菌株的DNA，获得其 16S rRNA基因序列并 提交到GeneBank公共数据库，B.methylotrophicus Mo-TB菌株16S rRNA基因序列在 GeneBank公共数据库的序列号为KU297172,此序列是鉴定该菌株的主要特征依据。
[0035] (2)、B.methylotrophicus Mo-TB菌株试管斜面种子培养:将该菌株的菌体接种到 常规牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上，32°C下培养2天后获得斜面种子；
[0036] (3)、B.methylotrophicus Mo-TB菌株液体种子的液体培养:将斜面种子接种到三 角瓶中的常规牛肉膏蛋白胨液体培养基中，32°C，150rpm条件下摇床培养3天；
[0037] (4)、B.methylotrophicus Mo-TB菌株发酵罐大量培养:将液体种子按V/V为5%〇的 比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在10-10000升发酵罐中的培养条件控制 在:温度32 °C，搅拌速度200rpm，发酵时间4天；
[0038] (5)、根结线虫诱吸剂的制备:经发酵罐培养获得的B.methylotrophicus Mo-TB菌 株菌体及其代谢物经过喷雾干燥获B. me thy lotrophi cus Mo-TB菌体原粉，将 B.methylo