trophicus Mo-TB菌体原粉加入糖蜜中，需保证B.methylotrophicus Mo-TB菌株 在糖蜜中的活菌数含量在5 X IO9个/毫升以上，搅拌均匀后用氢氧化钠稀溶液将pH调至7.2 即制得该根结线虫诱吸剂。
[0039] 2.本发明的根结线虫诱吸剂对土壤中根结线虫的诱吸效果试验
[0040] 南方根结线虫(Meloidogyne incongnita)二龄幼虫的制备:从云南省峨山县化念 镇的大棚番茄中采集感染线虫的根瘤，从根瘤中挑取卵囊于培养皿中，加入1 %的次氯酸钠 溶液降解卵囊壁使卵粒游离出来，然后将培养皿至于28°C的温箱中孵化2-3天。利用贝曼漏 斗法(将样品用3层擦镜纸包裹，置于漏斗中，漏斗下端接一长度50厘米的塑料管，塑料管末 端用夹子夹住，在漏斗中加满水，放置24小时候从塑料管放出200ml的水，即得线虫悬液。） 分离获得大量的二龄龄幼虫，通过离心沉淀和解剖镜下的线虫计数，将线虫悬液浓度调整 到1000条/毫升，4°C保存备用。
[0041] 取田间土壤，晒干后粉碎并过100目筛子，将过筛的细土经过高温湿热灭菌（121 °C，灭菌2小时）以杀死土壤中原有的线虫。在室内灭菌土壤按长方形(长X宽= 1.4米X0.1 米)铺在塑料布上，土壤厚度为10厘米。取lml、2ml、3ml、4ml本发明制备的根结线虫诱吸剂 (B.methylotrophicus Mo-TB菌株的菌体含量为5.5 X IO9个/毫升)分别滴加到棉球中，在 上述条形土壤带的一端放入棉球并用土覆盖。在对照处理中用等量的无菌水替代线虫诱吸 剂，其余操作相同。在距离棉球端1米位置的土壤中分别加入根结线虫悬液10毫升(含线虫 10000条以上）。加入线虫后的72小时取棉球及其附近20厘米范围内的土样1000克，用贝曼 漏斗法分离土壤中的线虫，在解剖镜下计数线虫数量，按下述公式计算线虫诱吸率：
[0042] 线虫诱吸率（％ )=(处理的线虫数-对照的线虫数)/10000 X 100%
[0043]试验结果:如表1所示，在土壤带一段分别加入本发明制备的根结线虫诱吸剂lml、 2ml、3ml、4ml，在距离棉球1米处加入线虫72小时时在棉球及其附近20厘米范围内土壤中 分离到的线虫数量从5270条增加到8144条，诱吸率从51.95%提高到80.68%。线虫诱吸剂 在加入分别剂量为3ml和4ml时对线虫的诱吸率分别为80.25 %和80.68%，二者无显著差 异。因此，在田间应用时，本发明的线虫诱吸剂使用剂量以3毫升/株为宜。在此剂量下根部1 米范围内80%以上的土壤线虫被诱吸到根部，便于杀灭。
[0044]表1根结线虫诱吸剂对根结线虫二龄幼虫的诱吸效果
[0046] 3.本发明的根结线虫诱吸剂提高噻唑膦对根结线虫病防效的试验
[0047] (1)供试药剂
[0048] a.根结线虫诱吸剂:本分明制备的根结线虫诱吸剂，B.methylotrophicus Mo-TB 菌株的菌体含量为5.5 X IO9个/毫升;推荐用量:7500毫升/亩。b. 30 %噻唑膦微囊悬浮剂： 山东省联合农药工业有限公司生产;厂家推荐用量：1000毫升/亩。c. 10%噻唑膦颗粒剂:青 岛奥迪斯生物科技有限公司生产;厂家推荐用量:2000克/亩。
[0049] (2)试验处理设置
[0050] 处理1:30%噻唑膦微囊悬浮剂1000毫升，线虫诱吸剂7500毫升，将二者与10公斤 细土充分混匀。处理2:10 %噻唑膦颗粒剂2000克，线虫诱吸剂7500毫升，将二者与10公斤细 土充分混匀。处理3:30%噻唑膦微囊悬浮剂1000毫升与10公斤细土充分混匀。处理4:10% 噻唑膦颗粒剂2000克与10公斤细土充分混匀。处理5(空白对照）：15公斤细土。
[00511 (3)试验方法
[0052]试验地点为云南省峨山县化念镇大棚番茄地，前茬作物为番茄，根结线虫病严重。 番茄移栽时，分别将处理1-5的药剂穴施到番茄根部，当番茄苗按2500株/亩的种植密度移 栽时，处理1-5的施用剂量分别为:7.4克/株，7.8克/株，4.4克/株，4.8克/株，6克/株。每处 理100株番茄，三个重复，重复间随机排列。番茄毛移栽时间为2015年4月23日，防效调查时 间为2015年10月23日。调查防效时，从每处理的三个重复中各随机拔取50株番茄，获得的 150株番前作为该处理的调查样本。根瘤分级按0-5级进行（Oka et al. ,Pest Manag Sci . 2012，68: 268-275 )，0级:无根瘤，1级：1 -20 %的根有根瘤，2级：21 -40 %的根有根瘤，3 级:41 - 60 %的根有根瘤，4级:61 - 80 %的根有根瘤，5级:81 -100 %的根有根瘤。病情指数及 防效的计算公式如下（Wang et al·，2012,Phytopathology 102:267-271):
[0053] 病情指数（％ ) = (ηι X 1+Π 2 X 2+Π 3 X 3+ruX4+n5 X 5)/(S X 5) X 100ηι-η5表示该根 瘤级别的植株数量，S表示调查的植株总数。
[0054] 防效（％ ) = 100(I-x/y); X、y分别代表处理和对照的病情指数。
[0055] 试验结果:如表2所示，30 %噻唑膦微囊悬浮剂(处理3)和10 %噻唑膦颗粒剂(处理 4)单独施用时对根结线虫病的防效分别为67.4%和61.6%;当这两种农药分别与本发明的 根结线虫诱吸剂混合施用时，对根结线虫病的防效分别提高至83.6% (处理1)和78.9% (处 理2)，防效分别提高了 24.04%和28.08%。表明本发明的线虫诱吸剂能显著提高噻唑膦化 学杀线虫农药对根结线虫的防治效果。
[0056]表2根结线虫诱吸剂提高噻唑膦对根结线虫的防效结果
[0058] 3.本发明的根结线虫诱吸剂提高阿维菌素对根结线虫病防效的试验
[0059] (1)供试药剂
[0000] a.根结线虫诱吸剂:本分明制备的根结线虫诱吸剂，B.methylotrophicus Mo-TB 菌株的菌体含量为5.5 X IO9个/毫升;推荐用量:7500毫升/亩。b. 0.9%阿维菌素颗粒剂:宜 东国际（香港)有限公司生产;厂家推荐用量:5000公斤/亩。c.5%阿维菌素乳油:石家庄市 兴柏生物工程有限公司生产;厂家推荐用量:2000克/亩。
[0061 ] (2)试验处理设置
[0062] 处理1:0.9 %阿维菌素颗粒剂5000克，线虫诱吸剂7500毫升，将二者与10公斤细土 充分混匀。处理2:5 %阿维菌素乳油2000克，线虫诱吸剂7500毫升，将二者与10公斤细土充 分混匀。处理3:0.9%阿维菌素颗粒剂5000克与10公斤细土充分混匀。处理4:5%阿维菌素 乳油2000克与10公斤细土充分混匀。处理5(空白对照）：15公斤细土。
[0063] (3)试验方法
[0064] 试验地点为云南省峨山县化念镇大棚番茄地，前茬作物为番茄，根结线虫病严重。 番茄移栽时，分别将处理1-5的药剂穴施到番茄根部，当番茄苗按2500株/亩的种植密度移 栽时，处理1-5的施用剂量分别为:9克/株，7.8克/株，6克/株，4.8克/株，6克/株。每处理100 株番茄，三个重复，重复间随机排列。番茄毛移栽时间为2015年4月23日，防效调查时间为 2015年10月23日。调查防效时，从每处理的三个重复中各随机拔取50株番茄，获得的150株 番前作为该处理的调查样本。根瘤分级按0-5级进行(Oka et al. ,Pest Manag Sci.2012， 68: 268-275)，0级:无根瘤，1级：1-20%的根有根瘤，2级：21-40%的根有根瘤，3级:41-60% 的根有根瘤，4级:61 - 80 %的根有根瘤，5级:81 -100 %的根有根瘤。病情指数及防效的计算 公式如下（Wang et al·，2012,Phytopathology 102:267-271):
[0065] 病情指数（％ ) = (ηι X 1+Π2 X 2+Π3 X 3+ruX4+n5 X 5)/(S X 5) X 100ηι-η5表示该根 瘤级别的植株数量，S表示调查的植株总数。
[0066]防效（％ ) = 100(I-x/y); X、y分别代表处理和对照的病情指数。
[0067] 试验结果:如表3所示，0.9 %阿维菌素颗粒剂(处理3)和5 %阿维菌素乳油(处理4) 单独施用时对根结线虫病的防效分别为63.8%和60.7%;当这两种农药分别与本发明的根 结线虫诱吸剂混合施用时，对根结线虫病的防效分别提高至78.5% (处理1)和76.4% (处理 2)，防效分别提高了 23%和25.9%。表明本发明的线虫诱吸剂能显著提高阿维菌素杀线虫 农药对根结线虫的防治效果。
[0068]表3根结线虫诱吸剂提高阿维菌素对根结线虫的防效结果
【主权项】
1. 一种根结线虫诱吸剂，其特征在于该根结线虫诱吸剂经如下步骤得到： (1) 利用分离细菌的常规方法从根结线虫的体内分离到Bacillus methylotrophicus ]\1〇-113菌株;13.11161:1171〇1：1'(^11；[(3118]\1〇-113菌株已于2015年12月9日保存于中国微生物菌种保 藏委员会普通微生物中心，保藏号:CGMCC No. 11851; (2) 、B.methylotrophicus M〇-TB菌株试管斜面种子培养:将该菌株的菌体接种到常规 牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上，32 °C下培养2天后获得斜面种子； (3) 、B.methylotrophicus Mo-TB菌株液体种子的液体培养:将斜面种子接种到三角瓶 中的常规牛肉膏蛋白胨液体培养基中，32°C，150rpm条件下摇床培养3天； (4) 、B.methylotrophicus Mo-TB菌株发酵罐大量培养:将液体种子按V/V为5%〇的比例 接入发酵罐中的常规牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在10-10000升发酵罐中的培养条件控制 在:温度32 °C，搅拌速度200rpm，发酵时间4天； (5) 、诱吸剂的制备:经发酵罐培养获得的B.methylotrophicus Mo-TB菌株菌体及其代 谢物经过喷雾干燥获13.11161:1171〇1：1'〇卩11；[。118]\1〇-113菌体原粉，将13.11161:1171〇1：1'〇卩11；[。118]\1〇-丁13 菌体原粉加入糖蜜中，需保证B.methylotrophicus Mo-TB菌株在糖蜜中的活菌数含量在5 X109个/毫升以上，搅拌均匀后用氢氧化钠稀溶液将pH调至7.2即制得该根结线虫诱吸剂。2. 权利要求1所述的根结线虫诱吸剂在诱吸土壤中根结线虫二龄幼虫中的应用。3. 权利要求1所述的根结线虫诱吸剂与阿维菌素、噻唑膦化学农药混配后在防治根结 线虫病中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种根结线虫诱吸剂及其应用，属植物病害防治技术领域。该生物诱吸剂用菌种保藏号为CGMCC？No.11851的Bacillus？methylotrophicus？Mo-TB菌株，经试管斜面种子培养、液体培养、发酵罐大量培养、及诱吸剂的制备步骤得到。所述的生物诱吸剂在诱吸土壤中根结线虫二龄幼虫中的应用。所述的生物诱吸剂与阿维菌素、噻唑膦化学农药混配后在防治根结线虫病中的应用。本发明的有益效果在于：1、生物诱吸剂对一平方米内土壤中根结线虫二龄幼虫的诱吸率在80％以上。2、生物诱吸剂与阿维菌素、噻唑膦化学农药混配使用，提高了防治根结线虫病的效果。3、生物诱吸剂具有成本低、无残留、对人畜安全的特点，能显著提高常规杀线虫农药的防效效果。CGMCC NO. 1185120151209
【IPC分类】C12N1/20, A01N57/32, A01N63/00, A01P19/00, A01N43/90, C12R1/07
【公开号】CN105638740
【申请号】
【发明人】莫明和
【申请人】莫明和
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月25日